[0082] 2.添加3L 25 μ 1的40% PEG溶液并且混合原生质体。
[0083] 3.将处理的细胞在冰上孵育30分钟。
[0084] 4.向每个孔添加200 μ 1的W5溶液且混合细胞。
[0085] 5.使板在冰上孵育30分钟，从而允许原生质体沉降至每个孔的底部。
[0086] 6.除去在沉降的原生质体以上的200 μ 1培养基。
[0087] 7.添加 85 μ 1 的培养基（MSAP，参见 Mathur 等，1995)。
[0088] 8.将板在室温下在黑暗中孵育48小时。在添加培养基之后GRON的最终浓度是 8 μΜ〇
[0089] 使用此方案，与GRON-起引入不同浓度的TALEN质粒。在GRON递送之后四十八 小时，通过流式细胞术对样品进行分析以便检测绿色和黄色荧光不同于对照原生质体的绿 色和黄色荧光的原生质体。绿色荧光由在BFP基因中引入靶向突变引起，从而导致GFP的 合成D图1中；^出了结果。
[0091] m将根分生组织源性的原生质体用不同浓度的TALEN质粒连同靶向BFP基因 中的突变的GRON进行处理，从而引起转化成GFP基因。在GRON/TALEN递送后48小时通过 流式细胞术测量GFP表达。
[0092] 对于以下所有实施例2-11，应用以下图例：
[0093] GRON
[0094] BFP->GFP 靶向设计。
[0095] BFP->GFP H66Y CAC->TAC〇
[0096] BFP4/C/41/5' Cy3/3' idC
[0097] VCCCTCGTGACCACCTTCACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCH
[0098] BFP4/NC/41/5, Cy3/3, idC
[0099] VGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTGAAGGTGGTCACGAGGGH
[0100] BFP非靶向对照设计。
[0101] BFP H66-CAC
[0102] BFPO/C/41/5' 3PS/3'3PS
[0103] VCCCTCGTGACCACCTTCACCCACGGCGTGCAGTGCTTCAGCH
[0104] BFPO/NC/41/5' 3PS/3'3PS
[0105] VGCTGAAGCACTGCACGCCGTGGGTGAAGGTGGTCACGAGGGH
[0106] TALEN ：
[0108] pCLS14165在单个质粒上具有两个TAL臂（根据Zhang等，2013指定），其中每个 臂结合至加下划线的序列且连接至FokI单体。这种组合产生双链断裂（DSB)，如以下在与 Zhang等（2013)中的测定相同进行的单链退火测定（SSA)中所示。
[0109]
[0110] PCLS15771是在FokI结构域中具有针对左臂的突变（D450A)的切口酶。此构建体 中的右臂是根据PCLS14165。
[0111] GRON和TALEN如以下所示进行测试。由单独非靶向GRON(BFP0/C或BFP0/NC)和 TALEN组成的对照处理以及使用缺乏GRON或TALEN质粒的40% PEG溶液的模拟处理不具 有显著转化活性。
[0112] 在此系统中，单独BFP4/NC GRON设计好于单独BFP4/C GRON设计。将这些与DSB TALEN(pCLS14165)组合改进最佳活性和BFP4/C GRON的倍数改进（在许多情况下>2个数 量级）两者。显著改进还在组合GRON与缺口酶TALEN对中观察到并且预期当同时在几个 基因/等位基因中靶向突变时通过最小化附带损伤而是最有益的。
[0113] 实施例 2 :GR0N 加 TALEN 缺 口酶。
[0115] 实施例 3:GR0N 加 TALEN 缺 口酶。
[0116]
[0117]实施例 4:GR0N 加 TALEN 缺 口酶。
[0119] 实施例 5:GR0N 加 TALEN 缺 口酶。
[0120]
[0121]实施例 6:GR0N 加 TALEN 缺 口酶。
[0123] 实施例 7:GR0N 加 TALEN 缺 口酶。
[0124]
[0133] 参考文献
[0134] Clough，S. J.，and Bent，A. F. (1998) · Floral dip :A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J. 16， 735-743.
[0135] Mathur，J. ，Szabados，L，and Koncz，C. (1995)A simple method for isolation， liquid culture， transformation and regeneration of Arabidopsis thaliana protoplasts. Plant Cell Rep. 14,221-226
[0136] Fujikawa Y，Karo N(2007)Split luciferase complementation assay to study protein-protein interactions in Arabidopsis protoplasts. Plant J 52 :185-195
[0137] Zhang Y，Zhang F，Li X，Bailer JA，Qi Y，Starker CG，Bogdanove AJ，Voytas DF. (2013)Transcription activator-like effector nucleases enable efficient plant genome engineering. Plant Physiol.161 (11) ：2〇-7.
【主权项】
1. 一种用于将基因修复寡核碱基（GRON)介导的突变引入细胞中的靶脱氧核糖核酸 (DNA)序列中的方法，所述方法包括： 在将GR0N递送至植物细胞中之前和/或同时在增加一种或多种细胞DNA修复过程的 条件下培养所述细胞。2. 如权利要求1所述的方法，其中在GR0N存在下增加一种或多种细胞DNA修复过程的 所述条件包括以下中的一种或多种：将一个或多个位点引入至所述植物细胞DNA中，所述 位点是用于碱基切除修复的靶标；将一个或多个位点引入至所述植物细胞DNA中，所述位 点是用于非同源末端连接的靶标；将一个或多个位点引入至所述植物细胞DNA中，所述位 点是用于微同源介导的末端连接的靶标；将一个或多个位点引入至所述植物细胞DNA中， 所述位点是用于同源重组的靶标；以及将一个或多个位点引入至植物细胞DNA中，所述位 点是用于引导和增加修复的靶标。3. 如权利要求1或2中的一项所述的方法，其中所述增加一种或多种细胞DNA修复过 程的条件包括引入一种或多种化合物，所述化合物在将所述GR0N递送至所述植物细胞中 之前或同时诱导单链缺口或双DNA链断裂进入至所述植物细胞中。4. 如权利要求3所述的方法，其中诱导单链缺口或双DNA链断裂的所述一种或多种化 合物包含一种或多种核酸酶和/或一种或多种博来霉素家族化合物。5. 如权利要求1-4中的一项所述的方法，其中诱导单链缺口或双DNA链断裂的所述一 种或多种化合物共价偶联至所述GR0N。6. 如权利要求1-5中的一项所述的方法，其中所述细胞是选自由以下组成的组的物 种的植物细胞：芥花、向日葵、玉米、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、苜蓿、大麦、高 粱、西红柿、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、土豆、胡萝卜、莴苣、洋葱、大豆、大豆属、 甘蔗、豌豆、鹰嘴豆、紫花豌豆、蚕豆、扁豆、萝卜、芜菁甘蓝、球芽甘蓝、羽扇豆、花椰菜、羽衣 甘蓝、菜豆、杨树、松树、桉树、葡萄、柑橘、黑小麦、苜蓿、黑麦、燕麦、草皮和牧草、亚麻、油 菜、芥菜、黄瓜、牵牛花、香脂、辣椒、茄子、万寿菊、莲花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金香、鸢尾 以及百合。7. 如权利要求1-6中的一项所述的方法，其中所述细胞是转基因的。8. 如权利要求7所述的方法，其中所述靶DNA序列是所述细胞的内源基因。9. 如权利要求1-8中的一项所述的方法，其中所述细胞是植物细胞，并且其中所述方 法还包括从所述植物细胞再生具有通过所述GR0N引入的突变的植物。10. 如权利要求9所述的方法，其还包括从所述植物采集种子。11. 一种植物细胞，其包含根据权利要求1-80中的一项所述的方法由GR0N引入的基因 组修饰，或一种植物，其包含根据权利要求9所述的方法由GR0N引入的基因组修饰，或一种 种子，其包含根据权利要求10所述的方法由GR0N引入的基因组修饰。12. 在细胞中，引入一种或多种化合物，所述化合物引入单链缺口或双链断裂以通过作 为供体的基因修复寡核苷酸（GR0N)改进突变转化。13. -种评定GR0N的转化效率的方法，其包括： 将所述GR0N引入至表达编码蓝色荧光蛋白的靶DNA序列的植物原生质体中，其中所 述GR0N被构造成使所述靶DNA序列在预定位点处突变以引起所述蓝色荧光蛋白的转化，由 此所述蓝色荧光蛋白发射不同波长的荧光，其中在引入所述GR0N之前或同时，所述原生质 体内的DNA与一种或多种化合物相接触，所述化合物将单链缺口或双链断裂引入至由所述GRON靶向的所述位点内的所述靶DNA序列；以及 测定所述转化的所述效率。14. 如权利要求13所述的方法，其中引入单链缺口或双链断裂的所述一种或多种化合 物包含一种或多种核酸酶。15. 如权利要求13所述的方法，其中引入单链缺口或双链断裂的所述一种或多种化合 物包含一种或多种博来霉素家族化合物。16. 如权利要求13-15中的一项所述的方法，其中所述靶DNA序列存在于所述原生质体 的所述染色体DNA中。17. 如权利要求13-15中的一项所述的方法，其中所述靶DNA序列存在于质粒中。18. 如权利要求13-15中的一项所述的方法，其中引入单链缺口或双链断裂的所述一 种或多种化合物提供相对于在不存在引入单链缺口或双链断裂的所述一种或多种化合物 的情况下针对所述GRON测定的效率提高的转化效率。
【专利摘要】本发明提供用于修饰植物细胞以及源自其的植物和种子中的基因的改进方法。更具体地说，本发明涉及通过组合基因修复寡核苷酸与增强靶细胞基因修复机制的组分的可用性的方法来增加靶基因突变的效率。
【IPC分类】C12N5/00, C12N15/82, A01H1/06, C12N15/00
【公开号】CN105338805
【申请号】CN201480024708
【发明人】P·R·比瑟姆, G·F·W·格卡尔, C·施波克, N·J·萨奥尔, J·皮尔斯, R·E·塞格米, J·莫左鲁克
【申请人】希博斯美国有限公司, 希博斯欧洲有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2905135A1, EP2966984A2, WO2014144987A2, WO2014144987A3