一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药技术领域，尤其是涉及与一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的工 〇
【背景技术】
[0002] 亮丙瑞林，英文名：Leuprorelin，CAS:53714-56-0,分子式，分子 量：1209.42。
[0003] 结构式如下：
亮丙瑞林属于GnRH类似物。作用同布舍瑞林。重复给予大剂量的促黄体生成释放激素 (LH-RH)或其高活性衍生物醋酸亮丙瑞林，在首次给药后能立即产生一过性的垂体-性腺系 统兴奋作用（急性作用），然后抑制垂体生成和释放促性腺激素。它还进一步抑制卵巢和睾 丸对促性腺激素的反应，从而降低雌二醇和睾丸酮的生成(慢性作用）。醋酸亮丙瑞林的促 黄体生成激素(LH)释放活性约为LH-RH的100倍，它的抑制垂体-性腺系统功能的作用也强 于LH-RH。醋酸亮丙瑞林是高活性的LH-RH衍生物，由于它对蛋白分解酶的抵抗力和对LH-RH 受体的亲和力都比LH-RH强，所以能有效地抑制垂体-性腺系统的功能。
[0004] 此外，醋酸亮丙瑞林又是一种缓释制剂，它恒定地向血液中释放醋酸亮丙瑞林，故 能有效地降低卵巢和睾丸的反应，产生高度有利的垂体-性腺系统的抑制作用。
[0005] 对子宫内膜异位症、子宫肌瘤或绝经前乳腺癌患者，每4周1次皮下注射醋酸亮丙 瑞林，使血清中雌二醇下降到接近绝经期的水平。因此本品有卵巢功能抑制作用，可抑制正 常排卵和使月经停止。
[0006] 对前列腺癌患者皮下注射醋酸亮丙瑞林，每4周1次，使血清睾丸酮浓度降至去势 水平之下，表明本品有药理学的去势作用。
[0007] 对患有中枢性性早熟的男孩和女孩每4周1次，皮下注射醋酸亮丙瑞林后，血清中 促性腺激素的水平降至青春期前的水平，表明对第二性征有进行性抑制作用。
[0008]亮丙瑞林是1974年由日本武田化工的Fujino Masaniko等人首先发现促黄体激素 释放激素的九肽酰胺类似物具有很好的活性，并且发明合成工艺。其先后在日本、德国、美 国等国家申请专利，专利号分别为JP19740027442、DE2446005、US4008209等。随后，又有一 些研究机构和个人发表了 一些合成工艺，专利号为EP1088555、EP1777232、US5480868、 CN1865280、申请号为CN200910104993.6等。
[0009] 其中CN200910104993.6专利申请时间较近，技术较为领先，但固相合成中色氨酸 丝氨酸片段会有二级构像变化，影响分子活性;利用HPLC色谱纯化产品损失较大，收率较 低。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实 现产业化的亮丙瑞林合成方法，主要解决现有亮丙瑞林合成中存在色氨酸丝氨酸片段会有 二级构像变化，影响分子活性导致HPLC色谱纯化产品收率较低的技术问题。
[0011] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案； 一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法，包括以下步骤： 1) 由Fmoc-Pro-OH与取代度为0.4~0.6mmol的2-氯三苯甲 基氯树脂反应生成Fmoc-Pro-树脂； 2) 加入偶联剂，依次偶联Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-D-Leu-〇H、Fmoc-Tyr (tBu)-〇H、Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Ps i(Me，Me)pro)-〇H、 Fmoc-Hi s (Tr t) -〇H、H-Pyr-OH，形成固相多肽； 3) 加入切割试剂切割固相多肽，得到全保护多肽序列； 4) 全保护多肽与乙胺液相缩合，多肽羧基端封闭;脱侧链保护得到亮丙瑞林粗肽； 5) 采用高效逆流色谱萃取，之后冻干得亮丙瑞林纯肽。
[0012] 所述的偶联试剂为 HBTU/H0Bt/DIEA、DIC/H0Bt、DIC/H0At、PyB0P/H0Bt、TBTU/ HOBt、HBTU/HOBt或 HATU/HOAt 中的一种。
[0013]所述的切割全保护多肽的切割试剂为〇. 8~2%体积百分含量的TFA/DCM溶液； 步骤4具体为:将全保护多肽溶于DCM中，加1.5~3当量N-甲基吗啉，冰浴，温度维持在0~ 5°C，滴加1.1~1.6倍量（以全保护多肽物质量为基准）的氯甲酸乙酯或氯甲酸异丙酯，反应 10~30分钟；另取全保护多肽物质量1.3~8倍量的乙胺盐酸盐，加入等物质量（以全保护多肽 物质的量为基准)N-甲基吗啉中和，中和后滴入多肽混合酸酐，剧烈搅拌，冰浴维持反应温 度0~5°C，反应30分钟~3小时；低温旋干DCM溶剂，乙酸乙酯萃取，1N盐酸洗涤2次，饱和盐水 洗涤两次;干燥，蒸干乙酸乙酯得全保护多肽;全保护多肽用三氟乙酸切割液切割侧链;低 温蒸馏三氟乙酸，1N氢氧化钠中和至pH=7~8,正丁醇提取得到亮丙瑞林粗肽。
[0014] 切割侧链保护基三氟乙酸切割液配比为:三氟乙酸:水为(95:5V/V);或三氟乙酸： 水:苯甲硫醚:苯酚为(90:5:2.5:2.5V/V)。
[0015] 其所述的高效逆流色谱萃取得条件是：甲醇：正丁醇：水：乙酸=(1~5) : (3~7) : (3~ 7) : (1~3)V/V ;温度0~5°C，转速400~550转/分，流量20~50毫升/分;根据HPLC-MS判定目标 出峰位置，优化溶剂比例，确定目标出峰时间，收集目的产品，冻干，得醋酸亮丙瑞林。
[0016] 与已有技术相比，本发明有如下优点和有益效果： Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Psi (Me，Me)pro)-〇H 替代 Fmoc_Trp(Boc)-〇H、 Fmoc-Ser (tBu)-〇H，固相合成收率更高，反应更稳定;液相合成采用混合酸酐法反应， 反应效率高，副反应更少；由高速逆流萃取代替高压液相色谱，纯化更容易更稳定，损耗更 少。更利于工业化规模化。
【附图说明】
[0017]图1为本发明合成方法流程图。
[0018]图2为本发明产品色谱图。
[0019] 图3为本发明产品质谱图。
【具体实施方式】
[0020] 下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根 据本
【发明内容】
对本发明作出的一些分本质的改进和调整，仍属本发明保护范围； 说明书和权利要求书中所使用的缩写含义列于下表中:_
保护氨基酸皆为无锡亚肽生物科技有限公司自产产品;_ 头她例i :穸照囹i，Hnoc-Pro-W脂甘肷：
将取代度〇.4mmol的2-CTC树脂lOOOg置于反应器，以DCM洗涤2~3次，滤干；将 1.2mol的Fmoc-Pro-OH与2molDIEA溶于DMF,搅拌振荡lOmin,加进反应器，与反应器 中树脂混合，振荡2 h;结束后，再加入无水甲醇，继续振荡30 min;反应结束后，滤去 反应液，依次以DCM，DMF与无水甲醇交替洗涤树脂2~3次；得到产物即Fmoc-Pro-树 脂。
[0021] 实施例2:参照图1，Fmoc-Pro_树脂合成： 将取代度〇.5mmol的2-CTC树脂lOOOg置于反应器，以DCM洗涤2~3次，滤干；将 1.5mol的Fmoc-Pro-OH与2.5molDIEA溶于DMF，搅拌振荡lOmin,加进反应器，与反应 器中树脂混合，振荡2 h;结束后，再加入无水甲醇，继续振荡30 min;反应结束后，滤 去反应液，依次以DCM，DMF与无水甲醇交替洗涤树脂2~3次；得到产物即Fmoc-Pro-树 脂。
[0022]实施例3:参照图1，肽链的增长 将Fmoc-Pro-树脂脱Fmoc保护基2次，每次用500mL 20% (V/V)哌啶/DMF，时间依次 为5，15 min，最后用DCM, DMF与无水甲醇交替洗涤树脂2~3次，再以HBTU/HOBt/DIEA 为缩合试剂，按照亮丙瑞林中氨基酸从羧基端到氨基端的顺序，重复缩合和脱保护两步 反应，在室温下依次组装Fmoc_Arg(Pbf )-〇H，Fmoc-Leu-〇H，Fmoc-D-Leu-〇H，Fmoc-Tyr (tBu)-〇H，Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Psi (Me，]\^)卩1'〇)-0!1，卩1]1〇。-]^8(1'1'1:)-0!1，!1-?5^-0!1氨基酸 过量倍数为1 .5倍。缩合过程中采用四氯对苯醌定性显色(chloranil法)检测反应进度 和Fmoc吸光法定量检测缩合效率。
[0023]实施例4:参照图1，肽链的增长 将Fmoc-Pro-树脂脱Fmoc保护基2次，每次用500mL 20% (V/V)哌啶/DMF，时间依次 为5，15 min，最后用DCM, DMF与无水甲醇交替洗涤树脂2~3次，再以HBTU/HOBt/DIEA 为偶联试剂，按照亮丙瑞林中氨基酸从羧基端到氨基端的顺序，重复缩合和脱保护两步 反应，在室温下依次组装Fmoc_Arg(Pbf )-〇H，Fmoc-Leu-〇H，Fmoc-