D-Leu-〇H，Fmoc-Tyr (tBu)-〇H，Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Psi (Me，]\^)卩1'〇)-0!1，卩1]1〇。-]^8(1'1'1:)-0!1，!1-?5^-0!1氨基酸 过量倍数为2倍。缩合过程中采用四氯对苯醌定性显色（chloranil法)检测反应进度和 Fmoc吸光法定量检测缩合效率。
[0024]实施例5，DIC/H0Bt为偶联试剂，其余同实施例3。
[0025]实施例6，PyB0P/H0Bt为偶联试剂，其余同实施例3。
[0026]实施例7，TBTU/H0Bt为偶联试剂，其余同实施例3。
[0027]实施例8，HATU/H0At为偶联试剂，其余同实施例3。
[0028]实施例9:参照图1，切割全保护多肽： 冰浴条件下，用1% TFA/DCM (V/V)将肽链从树脂切割树脂，DCM洗涤树脂，收集待用。 [0029]实施例10，参照图1，切割全保护多肽： 冰浴条件下，用1.3% TFA/DCM (V/V)将肽链从树脂切割树脂，DCM洗涤树脂，收集待用。
[0030] 实施例11，参照图1，切割全保护多肽： 冰浴条件下，用2% TFA/DCM (V/V)将肽链从树脂切割树脂，DCM洗涤树脂，收集待用。
[0031] 实施例12:参照图1，全保护多肽的液相乙胺化； 全保护多肽与乙胺耦合的液相合成步骤为将全保护多肽溶于DCM中，加1.5当量N-甲基 吗啉，冰浴，温度维持在〇~5°C，滴加1.1倍量（以全保护多肽物质量为基准）的氯甲酸乙酯， 反应10分钟；另取全保护多肽物质量1.3倍量的乙胺盐酸盐，加入等物质量（以全保护多肽 物质量为基准)N-甲基吗啉中和，中和后滴入多肽混合酸酐，剧烈搅拌，冰浴维持反应温度0 ~5°C，反应30分钟；低温旋干DCM溶剂，乙酸乙酯萃取，1N盐酸洗涤2次，饱和盐水洗涤两次； 干燥，蒸干乙酸乙酯得全保护多肽;全保护多肽用三氟乙酸切割液切割侧链;低温蒸馏三氟 乙酸，切割侧链保护基三氟乙酸切割液配比为三氟乙酸：水为(95: 5V/V)，1N氢氧化钠中和 至pH=7~8，正丁醇提取得到亮丙瑞林粗肽，纯度85.1%，收率92%。
[0032]实施例13:参照图1，全保护多肽的液相乙胺化； 全保护多肽与乙胺耦合的液相合成步骤为将全保护多肽溶于DCM中，加3当量N-甲基吗 啉，冰浴，温度维持在0~5°C，滴加1.3倍量（以全保护多肽物质量为基准）的氯甲酸异丙酯， 反应20分钟；另取全保护多肽物质量4倍量的乙胺盐酸盐，加入等物质量（以全保护多肽物 质量为基准)N-甲基吗啉中和，中和后滴入多肽混合酸酐，剧烈搅拌，冰浴维持反应温度0~5 °C，反应2小时；低温旋干DCM溶剂，乙酸乙酯萃取，1N盐酸洗涤2次，饱和盐水洗涤两次；干 燥，蒸干乙酸乙酯得全保护多肽;全保护多肽用三氟乙酸切割液切割侧链;低温蒸馏三氟乙 酸，切割侧链保护基三氟乙酸切割液配比三氟乙酸:水:苯甲硫醚:苯酚为(90:5:2.5:2.5V/ V)，1N氢氧化钠中和至pH=7~8，正丁醇提取得到亮丙瑞林粗肽，纯度88.1%，收率93.1%。 [0033]实施例14,参照图1，全保护多肽的液相乙胺化； 全保护多肽与乙胺耦合的液相合成步骤为将全保护多肽溶于DCM中，加2.2当量N-甲基 吗啉，冰浴，温度维持在〇~5°C，滴加1.6倍量（以全保护多肽物质量为基准）的氯甲酸乙酯， 反应30分钟；另取全保护多肽物质量8倍量的乙胺盐酸盐，加入等物质量（以全保护多肽物 质量为基准)N-甲基吗啉中和，中和后滴入多肽混合酸酐，剧烈搅拌，冰浴维持反应温度0~5 °C，反应3小时；低温旋干DCM溶剂，乙酸乙酯萃取，1N盐酸洗涤2次，饱和盐水洗涤两次；干 燥，蒸干乙酸乙酯得全保护多肽;全保护多肽用三氟乙酸切割液切割侧链;低温蒸馏三氟乙 酸，切割侧链保护基三氟乙酸切割液配比三氟乙酸:水:苯甲硫醚:苯酚为(90:5:2.5:2.5V/ V)，1N氢氧化钠中和至pH=7~8，正丁醇提取得到亮丙瑞林粗肽，纯度88.5%，收率94%。
[0034] 实施例15:纯化 其所述的高效逆流色谱萃取得条件是甲醇:正丁醇:水:乙酸=1:3:3:1 (V/V);温度0~5 °C，转速400转/分，流量20毫升/分;根据HPLC-MS判定目标出峰位置，优化溶剂比例，确定目 标出峰时间，收集目的产品，冻干，得醋酸亮丙瑞林，纯度99.3%，收率71.2%;见图2、3。
[0035] 实施例16:纯化 高效逆流色谱萃取得条件是甲醇:正丁醇:水：乙酸=5: 7:7:3 (V/V);温度0~5°C，转速 550转/分，流量50毫升/分;根据HPLC-MS判定目标出峰位置，优化溶剂比例，确定目标出峰 时间，收集目的产品，冻干，得醋酸亮丙瑞林，纯度99.1%，收率70.1%;见图2、3。
[0036]实施例17，高效逆流色谱萃取得条件是甲醇:正丁醇:水：乙酸=2:5:5:2 (V/V);温 度0~5°C，转速550转/分，流量50毫升/分;根据HPLC-MS判定目标出峰位置，优化溶剂比例， 确定目标出峰时间，收集目的产品，冻干，得醋酸亮丙瑞林，纯度99.2%，收率70.6%;见图2、 3〇
[0037]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法，其特征是包括以下步骤： 1) 由Fmoc-Pro-OH与取代度为0.4~0.6mmo 1的2-氯三苯甲基氯树脂反应生成Fmoc-Pro-树脂； 2) 加入偶联剂，依次偶联Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-D-Leu-〇H、Fmoc-Tyr (tBu) -OH、Fmo c_Trp (Boc)_Ser(Psi(Me，Me) pro) -OH、Fmo c_Hi s (Tr t) -OH、H-Pyr-OH，形成固 相多肽； 3) 加入切割试剂切割固相多肽，得到全保护多肽序列； 4) 全保护多肽与乙胺液相缩合，多肽羧基端封闭;脱侧链保护得到亮丙瑞林粗肽； 5 )采用高效逆流色谱萃取，之后冻干得亮丙瑞林纯肽。2. 根据权利要求1所述的一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法，其特征是所述的 偶联试剂为：HBTU/HOBt/D IEA、DI C/HOBt、DI C/HOAt、PyBOP/HOBt、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt或 HATU/HOAt 中的一种。3. 根据权利要求1所述的一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法，其特征是所述的 切割试剂为〇. 8~2%体积百分含量的TFA/DCM溶液。4. 根据权利要求1所述的一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法，其特征是步骤4具 体为:将全保护多肽溶于DCM中，加1.5~3当量N-甲基吗啉，冰浴，温度维持在0~5°C，滴加1.1 ~1.6倍量的氯甲酸乙酯或氯甲酸异丙酯，反应10~30分钟；另取全保护多肽1.3~8倍量的乙 胺盐酸盐，加入等物质量N-甲基吗啉中和，中和后滴入多肽混合酸酐，剧烈搅拌，冰浴维持 反应温度0~5°C，反应30分钟~3小时；低温旋干DCM溶剂，乙酸乙酯萃取，1N盐酸洗涤2次，饱 和盐水洗涤两次;干燥，蒸干乙酸乙酯得全保护多肽;全保护多肽用三氟乙酸切割液切割侧 链;低温蒸馏三氟乙酸，1N氢氧化钠中和至pH=7~8，正丁醇提取得到亮丙瑞林粗肽。5. 根据权利要求4所述的一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法，其特征是所述的 三氟乙酸切割液其体积比为:三氟乙酸:水=95:5;或三氟乙酸:水:苯甲硫醚:苯酚为=90:5: 2·5:2·5。6. 根据权利要求1所述的一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法，其特征是所述的 高效逆流色谱萃取得条件是甲醇:正丁醇:水：乙酸体积比=(1~5) : (3~7) : (3~7) : (1~3 );温 度为0~5 °C，转速为400~550转/分，流量为20~50毫升/分。
【专利摘要】本发明涉及亮丙瑞林的合成，尤其是涉及与一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法。主要解决现有亮丙瑞林合成中存在色氨酸丝氨酸片段会有二级构像变化，影响分子活性导致HPLC色谱纯化产品收率较低的技术问题。本发明合成由以下步骤组成：1）由Fmoc-Pro-OH与取代度为0.4~0.6mmol的2-氯三苯甲基氯树脂反应生成Fmoc-Pro-树脂；2）依次偶联氨基酸形成固相多肽；3）切割，得到全保护多肽序列；4）全保护多肽与乙胺液相缩合，多肽羧基端封闭；脱侧链保护得到亮丙瑞林粗肽；5）采用高效逆流色谱萃取，之后冻干得亮丙瑞林纯肽。
【IPC分类】C07K1/04, C07K7/23, C07K1/06, C07K1/02
【公开号】CN105622727
【申请号】CN201610189423
【发明人】徐红岩, 冯庆贺
【申请人】无锡亚肽生物科技有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月30日