蝇蛆耐热蛋白提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种蝇蛆耐热蛋白提取物及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 腹泻是一种多病原多因素引起的胃肠道疾病，其主要症状有排便次数明显超过平 日习惯的频率，粪质稀薄，水分增加，每日排便量超过200g，或含未消化食物或脓血、黏液， 常伴有排便急迫感、肛门不适、失禁等。腹泻发病率高，对儿童健康危害极大，是世界性公共 卫生问题，我国卫生部也把腹泻列为重点防治的疾病之一。根据世界卫生组织发布的资料 显示，每年全世界腹泻的发病高达1700万例，造成76000名五岁以下儿童的死亡，已成为继 癌症之后造成儿童死亡的第二大杀手。在养殖业，仔猪腹泻是集约化养猪生产条件下的一 种典型的多因素性疾病，该病是目前最严重的仔猪疾病群之一，也是引起仔猪死亡的重要 原因，据调查，仔猪因腹泻死亡占仔猪死亡总数的39.8%(王红宁，代敏.仔猪腹泻的病因及 综合防治进展[J].肉品卫生，2002(03): 32-34.)。同样因腹泻引起的小鸡死亡如小鸡白痢 对家禽养殖业的危害极大(董惠君.防治小鸡白痢病[J].现代农村科技，1985(07))，严重影 响着整个养殖业的健康发展。因此，腹泻对人类健康以及经济生产等方面已经造成了巨大 的负面影响。
[0003] 蝇蛆，是完全变态昆虫蝇类的幼虫，由于其生长环境恶劣却不感染疾病，一直以来 都成为科学工作者研究的焦点，现代药理研究表明蝇蛆体内主要有效成分为蝇蛆蛋白，蝇 蛆蛋白具有抗细菌、抗真菌、抗炎和抗肿瘤等功效并且可以提高免疫力，促进伤口愈合。从 蝇蛆中提取的抗菌肽，抗菌谱广泛，抗菌效果好，与抗生素相比可以有效避免细菌的耐药 性。《本草纲目》中记载蝇蛆又称"罗仙子""五谷虫"，苦寒，无毒，有治小儿诸疳积、疳疮，热 病谵妄，毒痢作吐等功效。有临床研究显示蝇蛆干粉对儿童厌食疳积有一定的疗效(朱锦 善，姜鹏九，姜鹏凌.五谷虫方治疗小儿厌食、疳证简介[J].中国农村医学，1993(4) :55-55·)。
[0004] 在我国农村地区，有人用野生生长的蝇蛆饲喂家禽家畜，发现可以减少动物腹泻 的几率。但是传统入药的五谷虫大多为蟾蜍肉饲养，对饲养条件要求较高，大大增加了五谷 虫的原料成本。简单的晒干磨粉入药也不能使蝇蛆的药用价值得到应有的发挥。而新鲜野 生蝇蛆饲喂家禽牲畜也存在卫生条件不合格，蝇蛆种类不固定，抗腹泻效果不稳定等问题。 并且有研究表明干燥蝇蛆体内含有约15 %~25 %的油脂，油脂本身具有通便滑肠的功效， 因此传统用法中蝇蛆直接研磨入药，不能有效的发挥其止泻作用。还有研究表明蝇蛆皮中 含有大量的甲克素和几丁质用以保护自身(覃容贵，吴建伟，国果，等.蝇蛆甲壳素的制备技 术研究[J].LishizhenMedicine and Materia Medica Research,2010(05): 1189-1191·)， 单纯的晒干研磨成粉末入药的方式并不能使其体内有效物质充分释放，从而影响药物吸 收，降低药用活性。
【发明内容】
[0005] 基于此，本发明的目的之一在于提供一种蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法。
[0006] 实现上述目的的具体技术方案如下：
[0007] 一种蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)漂洗消毒:将新鲜蝇蛆反复漂洗，排除虫体内容物，再将漂洗干净后的蝇蛆消 毒；
[0009] (2)粗蛋白的提取:将漂洗消毒后的蝇蛆加入提取液充分匀浆，再离心，弃去上层 油脂和不溶性沉淀，得中间清液，备用;所述提取液为pH 6~10的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠 的缓冲溶液，其中含有体积分数为1 %~50 %的甘油，质量分数为0.1 %~10 %的氯化钠， 0.1~1 Ommo 1/L乙二胺四乙酸二钾，体积分数为0.1 %~10 %的β-巯基乙醇；
[0010] (3)去除不耐热组分:取步骤(2)所得的中间清液在70-100°C水浴中加热，加热过 程中搅拌使受热均匀，加热后，离心去除沉淀，取上层清液备用；
[0011] (4)脱盐、冻干:将步骤(3)所得的上层清液用截留分子量为3500~lOOOOkDa的超 滤膜过滤除盐，再溶解于溶解液中，冷冻干燥，即得所述蝇蛆耐热蛋白提取物;所述溶解液 为pH 6~10的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠的缓冲溶液，其中含有质量分数为0.1%~10%的氯 化钠。
[0012] 步骤（1)中所述的新鲜蝇蛆为环裂亚目（Cyclorrhapha)各科下的蝇的幼虫，包括 但不限于家蝇、大头金蝇、痳蝇、丝光绿蝇。
[0013] 在其中一些实施例中，步骤(2)所述提取液为pH 7~9的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠 的缓冲溶液，其中含有体积分数为1 %~2 %的甘油，质量分数为0.5 %~1.5 %的氯化钠，9 ~1 Ommo 1/L乙二胺四乙酸二钾，体积分数为0.5 %~1.5 %的β-巯基乙醇。
[0014] 在其中一些实施例中，步骤(2)所述加入提取液的重量为蝇蛆重量的1-20倍，匀浆 的温度为〇_8°C，离心的温度为0_8°C，离心转速为10000~20000rpm，离心时间为10~ 50min〇
[0015] 在其中一些实施例中，步骤(2)所述加入提取液的重量为蝇蛆重量的4-6倍，匀浆 的温度为3_5°C，离心的温度为3-5°C，离心转速为14000~16000rpm，离心时间为45~ 50min〇
[0016] 在其中一些实施例中，步骤(3)所述水浴中加热的温度为90-100°C，加热时间为1-20min〇
[0017] 在其中一些实施例中，步骤(4)所述溶解液为pH为6~7的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠 的缓冲溶液，其中含有质量分数为〇. 5 %~1 %的氯化钠。
[0018] 在其中一些实施例中，步骤(4)所述超滤膜为截留分子量为3500~4000kDa的超滤 膜，所述冷冻干燥的真空度为10~100Pa，温度为-30°c~-70°c。
[0019] 本发明的另一目的在于提供一种蝇蛆耐热蛋白提取物。
[0020] 具体技术方案如下：
[0021 ] -种由上述制备方法制备得到的蝇蛆耐热蛋白提取物。
[0022]本发明的另一目的在于提供上述蝇蛆耐热蛋白提取物的应用。
[0023]具体技术方案如下：
[0024] 上述蝇蛆耐热蛋白提取物在制备防治腹泻的药物中的应用。上述蝇蛆耐热蛋白提 取物可加入常规辅料及赋形剂，制备成常用剂型。
[0025] 在其中一些实施例中，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂或颗粒剂。
[0026] 本发明的蝇蛆耐热蛋白提取物及其制备方法具有以下特点及有益效果：
[0027] (1)本发明的蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法，制备工艺简单，价格低廉，制备得 到的蝇蛆耐热蛋白提取物具有显著的抗腹泻作用。
[0028] (2)昆虫在死亡过程中会增加蛋白酶等各种酶的释放用以加快体内物质的水解， 因此处死方式或保存方式不当会直接影响其药用效果。本发明中蝇蛆耐热蛋白提取物的制 备采用新鲜蝇蛆入药极大地减少了蝇蛆传统晒干等处理过程中有效物质的损失，提高了提 取物的药用效果。
[0029] (3)本发明的蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法中，所用提取液中含有必须的缓冲 盐，抗氧化剂等物质，可以有效地将蝇蛆耐热蛋白提取出来，且防止有效物质的失活，将提 取液经过低温预冷可以更有效地防止有效物质的失活。
[0030] (4)本发明的蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法中，用合理配比的提取液对蝇蛆充 分匀浆，可以使蝇蛆细胞破裂，使蝇蛆体内的有效物质充分释放，增加蝇蛆中有效物质的溶 出。
[0031] (5)本发明的蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法中，匀浆后再进一步经过离心脱脂 (减少油脂对抗腹泻作用的干扰）、除杂、水浴去除不耐热组分等步骤，进一步提高了所制备 的蝇蛆耐热蛋白提取物的抗腹泻的效果。
【附图说明】
[0032] 图1为制备蝇蛆耐热蛋白提取物的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0033] 以下结合具体实施例对本发明的蝇蛆耐热蛋白提取物及其制备方法和应用作进 一步详细的说明。
[0034] 以下实施例中所述新鲜蝇蛆为环裂亚目（Cyc 1 orrhapha)各科下的蝇的幼虫，包括 但不限于家蝇、大头金蝇、痳蝇、丝光绿蝇。
[0035] 实施例1
[0036] 本实施例的蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法包括以下步骤：
[0037] (1)漂洗消毒:将新鲜蝇蛆装入布袋，在流水中反复漂洗，使虫体内容物排除尽净， 蝇蛆洗净后消毒；
[0038] (2)粗蛋白的提取：加入5倍蝇蛆重量的提前预冷至4°C的提取液I，4°C下充分匀 衆，所得勾衆在4 °C下15000rpm冷冻离心50min，弃去上层油脂和不溶性沉淀，得中间清液备 用;所述提取液I为:磷酸二氢钠-磷酸氢二钠的缓冲溶液(PH=8 )，其中含有体积分数为1 % 的甘油，质量分数为1 %的氯化钠，lOmmol/L乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)，体积分数为1 % 的β-巯基乙醇；
[0039] (3)去除不耐热组分:取步骤(2)所得的中间清液在100°C水浴中加热2min，加热过 程中低速搅拌使受热均勾，加热后，5000rpm离心10min去掉沉淀，取上层清液备用；
[0040] (4)脱盐、冻干:将步骤(3)所得的上层清液用截留分子量为3500kDa的超滤膜过滤 除盐，最终溶解在溶解液Π (磷酸二氢钠-磷酸氢二钠的缓冲溶液(PH=6)，含有质量分数为 0.8%的氯化钠）中，在真空度25Pa下，-30°C冷冻干燥，得蝇蛆耐热蛋白提取物。
[0041 ] 实施例2
[0042] 本实施例的蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法包括以下步骤：
[0043] (1)漂洗消毒:将新鲜蝇蛆装入布袋，在流水中反复漂洗，使虫体内容物排除尽净， 蝇蛆洗净后消毒；
[0044] (2)粗蛋白的提取:加入10倍蝇蛆重量的提前预冷至4°C的提取液I，4°C下充分匀 浆，所得匀浆在4°C下20000rpm冷冻离心10min，弃去上层油脂和不溶性沉淀，得中间清液备 用;所述提取液I为:磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(PH = 6 )，其中含有体积分数为50 % 的甘油，质量分数为〇. 1 %的氯化钠，5mmol/L EDTA-K2，体积分数为0.1 %的β-巯基乙醇；
[0045] (3)去除不耐热组分:取步骤(2)所得的中间清液在100°C水浴中加热20min，加热 过程中低速搅拌使受热均勾，加热后，lOOOrpm离心20min去掉沉淀，取上层清液备用；
[0046] (4)脱盐、冻干:将步骤(3)所得的上层清液用截留分子量为5500kDa的超滤膜过滤 除盐，最终溶解在溶解液Π (磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(PH= 10)，含有质量分数为 5%的氯化钠）中，在真空度10Pa下，-40°C冷冻干燥，得蝇蛆耐热蛋白提取物。
[0047] 实施例3
[0048] 本实施例的蝇蛆耐热蛋白提取物的制备方法包括以下步骤：
[0049] (1)漂洗消毒:将新鲜蝇蛆装入布袋，在流水中反复漂洗，使虫体内容物排除尽净， 蝇蛆