专利名称：OsAKT1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及OsAKTl蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。
背景技术：
钾是植物生长发育所必需的营养元素，是植物体内含量最丰富的一价阳离子，约占植物干重的2%-10%。钾在植物体内具有分布广、含量高、移动性强等特点，主要集中在生命活动最旺盛的部位，通常优先分布于芽、幼叶、上部茎和根尖等生长活动旺盛的器官与组织中。
钾不参与任何有机物质的形成，但钾的许多生理作用却是其它元素所不可替代的。钾在植物体中的作用可以分成以下几类调节酶的活性，促进氮的吸收和蛋白质合成， 调节韧皮部溶质运输，影响光合作用，调节细胞膨压和渗透势，维持细胞电荷平衡等。从而对植物的生长发育、产量形成等产生重要影响。
土壤中的钾是植物钾素最主要的来源。自然条件下植物吸收的钾元素除少部分来自灌溉水外，其余全靠土壤供给，即使在栽培作物施用钾肥的情况下，作物吸收的钾也有 40-80%来自土壤。因此，土壤中钾的状况对植物的钾营养和钾肥施用效果有着极其重要的意义。土壤全钾含量一般占土壤总重的O. 1%-3%，由于植物只能从土壤中吸收以离子形式存在的钾元素，因此其中只有大约2%的钾对植物直接有效，其余的钾都以不能被植物直接吸收利用的形式被固定在土壤矿物中。
目前我国农作物生产发展所面临的严峻状况是土壤缺钾且钾肥资源极其匮乏，因此从经济上和长远的战略上考虑，深入了解和认识植物对低钾胁迫的反应机制，提高农作物的耐低钾能力，对于提高农作物的产量和质量具有重要意义。发明内容
本发明的目的是提供OsAKTl蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。
本发明提供了一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤将OsAKTl 蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株；
所述OsAKTl蛋白获自水稻(Oryza sativa),是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列I衍生的蛋白质。
所述OsAKTl蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)或4)的DNA分子
I)序列表中序列2自5’末端第I至2805位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；
4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 I XSSC,O. 1%SDS 各洗膜一次。
所述OsAKTl蛋白的编码基因可通过表达载体导入所述目的植物。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述表达载体具体可为在1301-Ubiq质粒的多克隆位点(如Bam HI和SmaI酶切位点之间)插入所述OsAKTl蛋白的编码基因得到的重组质粒甲。
携带有所述OsAKTl蛋白的编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述基因可通过所述重组质粒甲导入所述目的植物中。
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。所述突变株具体可为ataktl突变体。
所述“对低钾逆境胁迫耐受能力增强”体现为植株对K+的吸收能力增强和/或植株(植株的地下部分和/或地上部分)中的K+含量增加。
本发明还保护所述OsAKTl蛋白或所述OsAKTl蛋白的编码基因在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥， 如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。所述突变株具体可为ataktl突变体。
以上任一所述“低钾”可为钾离子浓度为ImM以下，如500 μ M以下、250 μ M以下、 100 μ M以下、50 μ M以下、5 μ M以下或O μ Μ。
本发明还保护所述OsAKTl蛋白、所述OsAKTl蛋白的编码基因或以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。所述突变株具体可为ataktl突变体。
本发明还保护所述OsAKTl蛋白在参与生物体中的K+转运中的应用。
本发明公开了水稻OsAKTl蛋白及其编码基因的工程应用，特别公开了该基因在提高植物对土壤中有效钾利用效率方面的应用。OsAKTl蛋白在水稻中负责调控从土壤中吸收K+。OsAKTl基因的敲除突变体导致水稻对K+的吸收显著减少，并出现明显的缺钾褐斑。 OsAKTl基因过表达植物对K+的吸收能力大大增加。本发明可用于提高植物耐低钾能力，为 培育适用于钾贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。
图1为osaktl突变体植株中T-DNA的插入位置。图2为实施例2中的PCR扩增产物的0. 8%琼脂糖凝胶电泳图。图3为实施例2中各个株系中OsAKTl基因的相对表达量。图4为实施例2中Southern blot鉴定的结果。图5为实施例2中水稻品种“Dongjin”、osaktl突变体的全植株照片。图6为实施例2中根长、冠长和钾离子含量的测定结果。图7为实施例3的结果照片。图8为实施例4中的PCR扩增产物的0. 8%琼脂糖凝胶电泳图。图9为实施例4中各个株系的拟南芥培养7天后的照片。图10为实施例4中全植株的钾离子含量的测定结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。osaktl突变体，在水稻品种“Dongjin”的OsAKTl基因中插入T-DNA得到，获自 Rice GE (http://signal.salk.edu/cgi_bin/RiceGE J0B=TEXT&TYPE=GENE&QUERY=0s0 lg45990，编号为PFG_1B-16021. L ；osaktl突变体植株的T-DNA的插入位置见图1，其中 实心盒为外显子，线条为内含子，ATG为转录起始点。同样从Rice GE可以获得水稻品种 “Dongjin”(野生型植株)。哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)TAIR 网站(http://www. arabidopsis. org/)。酵母表达载体p416_GPD (包含氨基酸选择标记)购于http://www. biomart, cn/ infosupply/9602211. htm，货号为 87360。酵母突变菌株R5421 (在文献中被称作“strain CY162”)参考文献Robert L.Nakamura, Julie A.Anderson, Richard F. Gaber. (1997)Determination of Key StructuralRequirements of a K+ Channel Pore.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY272, 1011 - 1018.;该突变图菌株为钾离子转运蛋白基因突变体。野生型酵母R757 (在文献中被称作“strain R757”)参考文献Robert L.Nakamura, Julie A.Anderson, Richard F. Gaber. (1997)Determination of Key Structural Requirementsof a K+ Channel Pore. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 272，1011 - 1018.。ataktl 突变体参考文献Xu J, Li HD, Chen LQ, Wang Y, Liu LL, ffu WH. (2006) Aprotein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+transporterAKTI in Arabidopsis. Cell, 125:1347-1360 ;该突变体植株的出发植株为哥伦比亚生态型拟南芥。
1301-Ubiq 质粒参考文献Baisheng Yu, Zhongwei Linl, Haixia Li, Xiaojiao Li,Jiayang Li,Yonghong Wang, Xia Zhang,Zuofeng Zhu, Wenxue Zhai,Xiangkun Wang, Daoxin Xie and Chuanqing Sun. (2007)TAC I, a major quantitative trait locus controllingtiIIer angle in rice. The Plant Journal 52，891-898 ;1301_Ubiq 质粒是将ubiquitin启动子插入PCAMBIA1301的Pst I酶切位点得到的质粒。
农杆菌菌株GV3101 :提及“农杆菌菌株GV3101”的参考文献R. Berres，L. Otten, B. Tinland, E. Malgarini-Clog, B. Walter. (1992)Transformation of vitis tissue by differentstrains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene. Plant Cell Reports 11, 192-195.。
实施例I、OsAKTl蛋白及其编码基因的获得
在TIGR 网站(http://rice, plantbiology. msu. edu)上输入 L0C_01g45990 得到一段编码水稻高亲和钾离子通道基因的DNA序列。根据植物分子生物学国际植物基因命名法委员会，(Commission for Plant Gene Nomenclature of the International Society forPlant Molecular Biology)的要求，将该DNA序列命名为OsAKTl基因，编码OsAKTl蛋白。OsAKTl蛋白如序列表的序列I所示(由935个氨基酸残基组成)。OsAKTl基因的开放阅读框如序列表的序列2所T]^(2808bp)。该基因具有11个外显子和10个内含子。
实施例2、OsAKTl蛋白的功能验证
分别将水稻品种“Dongjin”(用DJ表示)、osaktl突变体分别进行如下鉴定
一、分子鉴定
I、PCR 鉴定
分别提取植株幼苗的地下部分(根部)和地上部分(冠部)的总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，用Primerl和Primer2组成的引物对进行PCR扩增(靶序列约为llOObp)，以鉴定OsAKTl基因的表达量。采用OsACTIN基因为看家基因，用Primer3和 Primer4组成的引物对进行PCR鉴定(祀序列约为600bp)。
Primerl :5，-AATGGCTGGTGTCGTAAAGG-3，；
Primer2 :5’ -AGATGATCGCCGTCTCTGAT-3’。
Primerf :5’ -TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’ ；
Primer4 5，-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3，。
PCR扩增产物的O. 8%琼脂糖凝胶电泳图见图2。
2、Real-time PCR 鉴定
提取植株幼苗的总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，采用Primer5和 Primer6组成的引物对进行Real-time PCR,以鉴定OsAKTl基因的表达量。采用OsACTIN基因为看家基因，用Primer7和Primer8组成的引物对进行Real-time PCR鉴定。Real-time PCR 中使用 SYBR Green Master mix 和 ABI 7500 sequence detection system (Applied Biosystems)。数据的处理采用Comparative CT方法。以OsACTIN基因作为内对照对数据进行归一化。
Primer5 :5’ -TTGCGTTTGAATCGTACAGC-3’ ；
Primer6 :5’ -CCTTTACGACACCAGCCATT-3’。
Primer7 :5’ -TGGTCGTACCACAGGTATTGTGTT-3’ ；
Primer8 :5， -AAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3，。
以水稻品种“Dongjin”的根部中OsAKTl基因的表达量作为1，水稻品种“Dongjin” 的冠部、osaktl突变体的根部和冠部中OsAKTl基因的相对表达量见图3。
结果表明0sAKTl基因在水稻品种“Dongjin”中正常表达，而在osaktl突变体中表达量显著降低；与水稻品种“Dongjin”相比，osaktl突变体植株地下部分中OsAKTl基因的表达量降低了 98.91% ;与水稻品种“Dongjin”相比，osaktl突变体植株地上部分中 OsAKTl基因的表达量降低了 95. 73%。
3、osaktl突变体植株T-DNA插入拷贝数的Southern blot鉴定
提取osaktl突变体植株叶片的基因组DNA，用不同限制性内切酶进行消化后进行 1%琼脂糖凝胶进行电泳，采用非放射性地高辛标记的探针进行Southern blot鉴定，结果见图4。osaktl突变体的T-DNA片段是单拷贝插入的。
二、OsAKTl蛋白的功能验证
I、分组处理
正常水培液的配制方法114.25mg NH4NO3^50. 38mg NaH2PO4 · 2Η20、89· 25mgK2S04、 110. 75mg CaCl2、405mg MgSO4 ·7Η20、1· 88mg MnCl2 ·4Η20、92· 5 μ g(NH4)6Mo7024 ·4Η20、1· 17mg Η3Β03、437μ g ZnSO4 · 7Η20、388μ g CuSO4 · 5Η20、34· 75mgFeS04 · 7Η20、46· 53mg Na2EDTA,用去离子水定容至1L，用NaOH调节pH为5. 70-5. 80。
正常水培液中的K+浓度约为ImM。
低钾水培液甲的配制方法改变K2SO4的加入量，其它均同正常水培液。
低钾水培液甲中的K+浓度为100 μ Μ。
低钾水培液乙的配制方法改变K2SO4的加入量，其它均同正常水培液。
低钾水培液乙中的K+浓度为10 μ M0
第一组将消毒后浸种并催芽的水稻种子放置于用去离子水浸湿的滤纸上，在光照培养箱中培养7天，然后将幼苗移至正常水培液中培养10天后拍照、测量根冠长度并检测钾尚子含量。
第二组将消毒后浸种并催芽的水稻种子放置于用去离子水浸湿的滤纸上，在光照培养箱中培养7天，然后将幼苗移至低钾水培液甲中培养10天后拍照、测量根冠长度并检测钾离子含量。
第三组将消毒后浸种并催芽的水稻种子放置于用去离子水浸湿的滤纸上，在光照培养箱中培养7天，然后将幼苗移至低钾水培液乙中培养10天后拍照、测量根部和冠部长度并检测钾离子含量。
2、表型观察
水稻品种“Dongjin”、osaktl突变体的全植株照片见图5A,等位叶照片见图5B。 在正常水培液中培养10天后，水稻品种“Dongjin”和osaktl突变体的全植株表型和叶片表型均一致，生长状态良好。在低钾水培液中培养10天后，osaktl突变体表现出叶片失绿并出现褐色的的缺钾斑，而水稻品种“Dongjin”的叶片仍保能保持绿色，且突变体植株的根冠高度也显著低于水稻品种“Dongjin”。以上结果表明，OsAKTl基因参与了低钾通路，是低钾耐受基因。
根部和冠部长度的结果见图6。
3、根冠钾离子含量的测定
( I)将植株用双蒸水清洗干净，将地下部分(根部)和地上部分(冠部)分开，放置于 80°C烘箱中烘干四天，至其重量恒定。
(2)将烘干的地下部分和地上部分分别在分析天平上称量并记录干重，然后分别放入坩埚内。
(3)将坩埚放入马弗炉中，300°C烘烤I小时，然后将温度调至575°C再烘烤7小时， 关闭马弗炉，待其冷却至200°C以下后取出坩埚。
(4)每个坩埚中加IOmL O. IM HCl水溶液，以溶解剩余物。
(5)将步骤(4)得到的溶液用O. IM HCl水溶液稀释后作为待测溶液。
(6)用Z5000型原子吸收分光光度计面积法测定稀释溶液的钾浓度。采用KCl制作标准曲线。
(7)换算每g干重的植物材料中含有多少mg钾离子。
进行三次重复实验，每次重复实验中每个株系取3株植株，结果取平均值。
钾离子含量结果见图6。
图6中a :根部和冠部长度(cm) ；b :根部钾含量；c :冠部钾含量。在不同浓度钾离子浓度的水培液培养下，osaktl突变体根部和冠部的钾离子含量都低于野生型，说明 osaktl突变体对低钾敏感，OsAKTl是低钾耐受基因。在低钾(10 μ M)条件下培养10天后， 与水稻品种“Dongjin”相比，osaktl突变体植株根部的钾离子含量降低了 42. 95%。
实施例3、酵母异源表达OsAKTl蛋白
一、重组表达载体的构建
I、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤2合成的双链DNA分子为模板，用OsAKTl-F和OsAKTl-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
OsAKTl-F :5，-TTGAATTCATGGCGAGGTGGGGCGCCGCT-3’ ；
OsAKTI-R : 5 ’ -TTGTCGACCTAGCTCTTGCCTTTCATCTTCTC-3，。
3、用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切酵母表达载体p416_GPD，回收载体骨架 (约 5800bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒p416_0sAKTl。 根据测序结果对重组质粒p416-0sAKTl进行结构描述如下在酵母表达载体P416-GPD的 EcoRI和SalI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。
二、酵母的转化
将重组质粒p416_0sAKTl导入酵母突变菌株R5421，得到酵母转化子 R5421-0sAKTl，具体步骤如下
I、挑取酵母突变菌株R5421单克隆于YPDA液体培养基中，30°C、250r/min培养至 0D_ 约为 I. 6-1. 8。
2、将步骤I得到的菌液按1:10的体积比转接至新的YPDA液体培养基，30°C、9250r/min培养至0D600=0. 8-1. O,收集细胞沉淀。
3、将步骤2得到细胞沉淀悬浮于ddH20中，每个感受态细胞悬浮于60 μ I ddH20, 然后加入以下成分240 μ I 50g/100mL的PEG4000水溶液、36μL I. OM LiAc水溶液，IOyL 5. Omg/mL 的 SS-DNA (Sigma, D1626)，5 μ L 重组质粒 p416_0sAKTl (含 O. 1-10 μ g) ;30°C水浴 30分钟，42°C水浴25分钟，然后收集菌体并涂布于营养缺陷型平板上30°C培养2_3天。
营养缺陷型平板的制备方法将6. 7g无氨基酸酵母氮源、O. 77g-Ura DOSupplement,20g葡糖糖、15g琼脂粉和7. 455g KCl溶于水并用水定容至1L，用NaOH调 pH=5. 8。
三、对照酵母转化子的获得
用酵母表达载体P416-GH)代替重组质粒P416-0SAKT1进行步骤二，得到酵母转化子 R5421-p416-GPD。
四、酵母互补实验
AP固体培养基的制备方法将20mL 50X盐溶液、ImL 1000X微量元素溶液、 ImLlOOOX 维生素溶液、O. 77g_Ura DO Supplement、IOmL IOOXUra 母液和 20g 葡萄糖混合，加入KCl (通过加入量不同，使得培养基中的K+浓度不同)，用Arginine调到pH=6. 5。
50 X 盐溶液含有 400mM H3PO4^OOmM L-arginineUOOmM MgSO4 和 IOmM CaCl2 的水溶液。
1000X 微量元素溶液含有 500 μ g/ml Η3Β04、50 μ g/ml CuSO4UOO μ g/ml ΚΙ、 400 μ g/mlMnS04、200 μ g/ml Na2MoO4 和 400 μ g/ml ZnSO4 的水溶液。
1000 X 维生素溶液含有 10 μ g/ml biotin (生物素)、10g/ml nicotinic acid (烟草酸)、10g/ml inositol (肌醇)和 lg/ml pantothenic acid (泛酸)的水溶液。
100 XUra母液含有2g/L Ura (尿嘧啶)的水溶液。
将野生型酵母R757 (阳性对照)、酵母转化子R5421_0sAKTl (在图7中用 “R5421+0sAKTl 表示”)、酵母转化子 R5421_p416_GPD (在图 7 中用 “R5421+p416” 表示)以及酵母突变菌株R5421 (阴性对照)培养于AP固体培养基(K+浓度分别为50mM、10mM、5mM、 ImM、500 μ Μ、250 μ Μ、100 μ M或50 μ Μ)上，分别稀释不同梯度点斑进行培养，观察不同材料的菌斑的生长情况。
结果见图7。酵母突变菌株R5421和酵母转化子R5421-p416-GPD在ImM K+浓度以下均不能生长，而酵母转化子1 5421-0^1(1'1在5(^1 K+浓度时仍然可以生长。结果表明，OsAKTl蛋白介导了酵母细胞膜的K+转运。
实施例4、转基因拟南芥植株表型检测
—、过表达载体构建
I、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用0sAKTl_UN1301F和0sAKTl_UN1301R 组成的弓I物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
0sAKTl-UN1301F :5’ - TTAGATCTATGGCGAGGTGGGGCGCCGCT-3’
0sAKTl-UN1301R :5’ - TTCCCGGGCTAGCTCTTGCCTTTCATCTTCTC-3>。
3、用限制性内切酶Bgl II和SmaI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Bam HI和SmaI双酶切1301-Ubiq质粒，回收载体骨架(约11800bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果， 对重组质粒甲进行结构描述如下在1301-Ubiq质粒的Bam HI和SmaI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。
二、过表达载体转化拟南芥
I、将步骤一得到的重组质粒转化农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
2、将步骤I得到的重组农杆菌乙通过花浸泡法转化ataktl突变体，收获T1代种子。
3、将T1代植株自交并收获种子(T2代种子)，将T2代种子培育为T2代植株。
4、将T2代植株在含50mg/L潮霉素的MS培养基上进行潮霉素抗性筛选，对于某一 T1代植株，如果其T2代植株在潮霉素抗性筛选中显示3:1的分离比，该T1代植株为单拷贝 OsAKTl基因过表达植株。
5、将单拷贝OsAKTl基因过表达植株的T2代植株自交并收获种子(T3代种子)，将 T3代种子培育为T3代植株。
6、将T3代植株在含50mg/L潮霉素的MS培养基上进行潮霉素抗性筛选，对于某一 T2代植株，如果其T3代植株均为潮霉素抗性植株，该T2代植株为纯合的OsAKTl基因过表达植株，该植株及其自交后代为一个OsAKTl基因过表达株系。
三、转空载体拟南芥的获得
用1301-Ubiq质粒代替重组质粒甲进行步骤二，得到转空载体植株。
四、耐逆性鉴定
分别对如下植株进行鉴定随机选取的2个转OsAKTl基因拟南芥单拷贝纯合株系 (株系I、株系2、株系3)的T3代种子、转空载体植株的T3代种子、ataktl突变体的种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子。
将拟南芥种子放置于MS培养基上，22 °C光照培养箱中连续光照(光强 60 μ mol · m_2 · s—1) 4天，然后分成两组，分别移苗至MS培养基和低钾培养基(用LK表示)上，继续在光照培养箱中培养7天后拍照，分子鉴定(提取总RNA并反转录为cDNA，用 0sAKTl-UN1301F和0sAKTl_UN1301R组成的引物对进行PCR鉴定)并检测钾离子含量(将全植株进行钾离子含量测定，方法同实施例2的步骤二的3)。
MS 培养基配方将 I. 65g NH4NO3U. 9g ΚΝ03、0· 17g ΚΗ2Ρ04、0· 37g MgSO4 · 7H20、 0. 332g CaCl2,22. 3mg MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、 0. 025mgCuS04 · 5H20、0. 025mg Na2MoO4 · 2H20、0. 83mg KI、6. 2mg H3BO3, 27. 8mg FeSO4 · 7H20 和37. 3mg Na2EDTA溶于水并用水定容至1L。
低钾培养基与MS培养基的差异在于去除I. 9g KN03、1. 65g NH4N03、0. 332gCaCl2 和 0. 17g KH2PO4，加入 706mg Ca(NO3)2 和 144mg NH4H2PO4。
PCR鉴定图谱见图8。照片见图9。钾离子含量见图10。
在MS培养基中，各个株系的表型均没有显著差异。在LK培养基中，各个转OsAKTl 基因植株的生长状态显著优于ataktl突变体，与哥伦比亚生态型拟南芥无显著差异，转空载体拟南芥和aktl突变株的表型没有显著差异。
权利要求
1.一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤^fOsAKTl蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株；所述OsAKTl蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述编码基因为如下I)或2)或3)或4)的 DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第I至2805位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述编码基因通过表达载体导入所述目的植物。
4.如权利要求I或3中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述双子叶植物为拟南芥。
6.OsAKTl蛋白或其编码基因在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用；所述OsAKTl蛋白是如下(a)或(b):Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列I衍生的蛋白质。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述编码基因为如下I)或2)或3)或4)的 DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第I至2805位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.权利要求I至5中任一所述方法在植物育种中的应用。
10.OsAKTl蛋白在参与生物体中的K+转运中的应用；所述OsAKTl蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加2且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列I衍生的蛋白质。
全文摘要
本发明公开了OsAKT1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。本发明提供了一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤将OsAKT1蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株；所述OsAKT1蛋白获自水稻(Oryza sativa)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明可用于提高植物耐低钾能力，为培育适用于钾贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。
文档编号C12N15/29GK102978216SQ20121052132
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者王毅, 武维华, 李娟 , 龙雨 申请人:中国农业大学