专利名称：钾氢泵蛋白及其编码基因和它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种钾氢泵蛋白，还涉及钾氢泵蛋白的编码基因，以及含有钾氢泵基因的重组载体和细胞，以及钾氢泵蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。
背景技术：
钾氢泵(K+/H+antiporter)是细胞中负责K+/H+交换的一种跨膜运输蛋白，广泛存在于细菌、人和高等植物的质膜及许多真核生物细胞器的膜中。质膜H+-ATPase用水解ATP的能量把H+从细胞质中泵出细胞，产生跨质膜的H+电化学势梯度，提供能量，驱动质膜上的钾氢泵蛋白，使H+顺其电化学势进入细胞，同时K+逆其电化学势排出细胞。钾离子能够通过维持细胞的渗透压，作 为胞内酶的激活剂PH的调节剂以及刺激胞内积累相容性溶质的第二信使来保证细胞的正常生理活动。钾氢泵蛋白通过K+外排来保持细胞内的低K+水平和PH值的稳定，是生物细胞耐受盐碱的关键因子，另外它在细胞器的发生及离子均衡过程中，还执行体积和渗透调节的功能，是保持细胞离子均衡的关键因子。与钠氢泵相比，目前关于钾氢泵的发现和研究报道还比较少。
发明内容
本发明的发明人基于对钾氢泵的分子生物学研究，意外地发现从嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)中得到了一种钾氢泵蛋白及其编码基因，另一方面还提供了含有钾氢泵基因的重组载体和细胞，以及钾氢泵蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。本发明提供了一种钾氢泵蛋白，其中，该钾氢泵蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者该钾氢泵蛋白具有将SEQ ID No:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有钾氢泵蛋白活性的氨基酸序列。本发明还提供了一种钾氢泵基因，其中，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。另外，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有本发明提供的钾氢泵基因。本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的钾氢泵基因。本发明还提供了得到的钾氢泵蛋白及其编码基因、含有该基因的重组载体及转基因细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。钾氢泵蛋白在耐盐碱植物培育等方面具有重要的应用潜力。通过克隆得到钾氢泵基因，并通过转基因的操作将微生物来源的钾氢泵基因导入到植物细胞中，获得耐盐碱性提闻的转基因植株成为可能。
图1 显示了重组载体 pUC18-BpOF4-cha 导入的大肠杆菌 K12 (pUC18-BpOF4_cha)的耐碱性的测定结果，其中，将重组载体pUC18-BpOF4-cha导入的大肠杆菌K12 (pUC18-BpOF4-cha)分别接种到 pH 为 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS,HEPES 和TRICINE, 5N NaOH调节)的LB液体培养基中(100 μ g/ml氨苄青霉素)，培养12小时后测定0D_，以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)。图2显示了钾氢泵缺失的大肠杆菌K12 ( Λ cha)以及导入重组载体pUC18-BpOF4-cha的K12 (Acha) (pUC18-BpOF4_cha)耐碱性的测定结果，其中，将导入重组载体pUC18-BpOF4_cha的K12 (Acha) (pUC18-BpOF4_cha)和钾氢泵缺失的大肠杆菌K12 ( Δ cha)分别接种到 pH 为 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS、HEPES 和 TRICINE,5N NaOH调节)的LB液体培养基中，培养12小时后测定0D_，以大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)。
具体实施例方式以下本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明提供了一种钾氢泵蛋白，其中，该钾氢泵蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者该钾氢泵蛋白具有将SEQ ID No:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有钾氢泵蛋白活性的氨基酸序列。优选地，所述钾氢泵蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列。相应地，本发明还提供了一种钾氢泵基因，其中，该基因具有SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，所述基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。本发明提供的钾氢泵基因是从嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmusOF4)中克隆得到的。此外，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有本发明提供的钾氢泵基因。在本发明中，所述“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒，粘粒,曬菌体及反转录病毒等。本发明优选大肠杆菌pUC18质粒。本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的钾氢泵基因。所述转基因细胞为原核细胞或真核细胞，优选可以是大肠杆菌、枯草杆菌或烟草BY2细胞，最优选大肠杆菌。此外，本发明还提供了本发明提供的钾氢泵蛋白及其编码基因、及含有钾氢泵基因的重组载体和转基因细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。所述生物为植物或微生物。实施例1编码钾氢泵的核苷酸序列的克隆(1)嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)总DNA的提取和纯化取嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)的新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50毫摩尔/升Tris缓冲液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25毫摩尔/升乙二胺四乙酸(EDTA) (pH 8.0)，混匀后于37°C放置20分钟，然后加入2毫升10%十二烷基硫酸钠(SDS)，55°C放置5分钟，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次抽提的上清溶液，加入2倍体积乙醇，沉淀DNA。将沉淀回收的DNA先后用70体积％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后，将所得DNA溶于0.5毫升TE缓冲液(pH 8.0,10毫摩尔/升Tris，I毫摩尔/升EDTA)，加入10毫克/毫升RNA酶(RNase) 3微升，37°C保温I小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取上清液加入2倍体积乙醇，沉淀回收DNA，先后用70体积％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后，真空干燥DNA沉淀，用去离子水溶解，得总DNA溶液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为 A26tl/A28tl = 1.818，A260/A230 = 2.052。(2)钾氢泵基因的克隆分析嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)的基因组信息后，设计钾氢泵基因的上下游引物，其中上游引物为5 ’ -TATGACCATGATTACATGTTAAGTTCTATCAA-3，，下游引物为5 ’ -CAG GTCGACTCTAGACTATAAGCTTTGTTCTTC-3 ’。通过高保真的核酸聚合酶Pyrobest (Takara),以上述提取的嗜喊芽抱杆菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)基因组为模板扩增出钾氢泵基因的全长。通过I %琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的大小，并将PCR产物送至诺赛基因公司测序，最后得到1485bp的如SED ID NO:1所示的核苷酸序列。实施例2编码钾氢泵的基因功能验证(I)重组克隆载体pUC18-BpOF4_cha的构建利用Cycle-pure Kit纯化上述得到的PCR产物。利用Fast clone Kit将纯化的PCR产物和pUC18连接，将构建好的 重组载体pUC18-BpOF4-cha通过化学转化法导入到大肠杆菌K12BW25113中。通过含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB平板的筛选以及PCR验证得到含有重组载体pUC18-BpOF4-cha插入的阳性克隆大肠杆菌K12 (pUC18-BpOF4_cha)，经测序证实pUC18-BpOF4-cha插入的扩增序列与钾氢泵的核苷酸序列完全一致。(2)大肠杆菌K12BW25113钾氢泵缺失体的构建通过设计含有待敲除基因的上下游同源臂的DNA片段的引物扩增打靶基因，利用大肠杆菌入噬菌体具有和宿主不同的λ Red重组系统将目的基因快速准确的敲除。通过敲除大肠杆菌K12BW2511的钾氢泵基因，得到大肠杆菌K12BW25113钾氢泵基因(Acha)缺失的突变体E.coli K12 ( Δ cha)，钾氢泵基因被卡那霉素基因取代。(3)重组载体pUC18-BpOF4_cha导入的大肠杆菌K12(pUC18-Bp0F4_cha)的耐碱性的测定将重组载体pUC18-BpOF4_cha导入的大肠杆菌K12 (pUC18-BpOF4_cha)分别接种到 pH 为 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS、HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 调节)的 LB液体培养基中(100 μ g/ml氨苄青霉素)，培养12小时后测定0D_，以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)，结果如图1所示。(4)钾氢泵缺失的大肠杆菌K12 ( Δ cha)以及导入重组载体pUC18-BpOF4_cha的K12 ( Δ cha) (pUC18-BpOF4_cha)耐喊性的测定将导入重组载体pUC18-BpOF4_cha 的 K12 ( Δ cha) (pUC18-BpOF4_cha)和钾氢泵缺失的大肠杆菌K12 ( Δ cha)分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5 (含有50mM的CAPS,HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中，培养12小时后测定0D_，以大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)，结果如图2所示。从图1中可以看出，导入重组载体？此18-8 0 4-(*&的大肠杆菌1(12在？!1为8.0、8.5,9.0和9.5的LB液体培养基中(100 μ g/ml氨苄青霉素)，12小时后测定OD6tltl明显高于导入PUC18空载体的大肠杆菌K12，这也证明了钾氢泵基因(BpOF4-cha)的导入能够提高大肠杆菌K12的耐碱性。从图2中可以看出，导入重组载体pUC18-BpOF4_cha的大肠杆菌K12(Acha)在pH
8.0，8.5，9.0 和 9.5 (含有 50mM CAPS, HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 调节)的 LB 液体培养基中，12小时后测定0D_明显高于导入大肠杆菌钾氢泵的缺失体K12，这也证明了钾氢泵基因(BpOF4_cha)的导入能够提高大肠杆菌K12 ( Λ cha)的耐碱性。综上所述，本申请提供的钾氢泵基因在耐盐碱生物的培育等方面具有重要的应用潜力。通过克隆得到钾氢泵基因，并通过转基因的操作将微生物来源的钾氢泵导入到植物细胞中，获得耐盐碱性提高的 转基因植株成为可能。
权利要求
1.一种钟氧栗蛋白，其特征在于，该钟氧栗蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者该钾氢泵蛋白具有将SEQ ID No:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有钾氢泵蛋白活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的钾氢泵蛋白，其中，该蛋白具有SEQID No:2所示的氨基酸序列。
3.一种钾氢泵基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其中，该基因具有SEQID No:1所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求3所述的基因。
6.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求3所述的基因。
7.根据权利要求6所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为原核细胞或真核细胞。
8.权利要求1所述的钾氢泵蛋白、权利要求3所述的基因、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的转基因细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中 ，所述生物为植物或微生物。
全文摘要
本发明涉及一种钾氢泵蛋白，其中，该钾氢泵蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者该钾氢泵蛋白具有将SEQ ID No2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有钾氢泵蛋白活性的氨基酸序列。此外，还涉及钾氢泵蛋白的编码基因，其中，该基因具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。还涉及含有钾氢泵基因的重组载体和细胞，以及钾氢泵蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。
文档编号C12N15/63GK103087163SQ20111033795
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者马延和, 翟磊, 薛燕芬 申请人:中国科学院微生物研究所