专利名称：表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的重组痘病毒rMVA-mep及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程疫苗领域，涉及表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的重组痘病毒rMVA-mep及其应用。
背景技术：
日本脑炎病毒(简称乙脑)属于黄病毒科黄病毒属，是一种以蚊虫为媒介传播的人畜共患的病毒性疾病。对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。因此，控制猪的乙脑不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。目前用于猪的乙脑疫苗包括弱毒苗和灭活苗，但是有关它们的安全性、生产和使用费用等问题越来越突出。WHO正在呼吁改善和研制新型乙脑疫苗，乙脑病毒的E蛋白与病毒和细胞受体结合、膜融合有关，也是引起中和抗体及宿主保护的主要免疫蛋白。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)。它是 T 细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)和 B 细胞抗原受体(B cell receptor,BCR)与抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别被称为T细胞表位和B细胞表位。作为理想的免疫原，抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位，才能诱导出高度特异性的体液及细胞免疫反应，从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用，赋予较广泛的保护性。目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展，因此表位疫苗成为近年来病毒新型疫苗研究的热点。E蛋白表位研究Takada K等Q002)通过JEV E蛋白在小鼠体内特异性的⑶8+CTLs反应，证明60Cyhasvtdi68是ε蛋白上主要的ctl表位。Lin等Q004)应用噬菌体展示肽库鉴定了 JEV囊膜蛋白的模拟表位，同单抗2H2结合的模拟表位拥有一个保守的基序X(I) (D/E) (Y/T/S)W2)，该基序位于E蛋白区域III的外侧表面。闫丽萍等Q007)用融合蛋白进行免疫学反应性扫描，鉴定出了 9个E蛋白线性抗原表位El (1-16)、E10-4 (77-84)、El 1-2 (83-94)、E19 (145-164)、E33 057-272)、E39-2(309-316)、E45-3(359-362)、E48-1(377-384)、E49 (385-400)。多表位疫苗(multi-印itope vaccine)也称鸡尾酒式疫苗，是同时携带多个与目标抗原相关的及辅助性表位的疫苗。多表位疫苗是由基于抗原表位的氨基酸序列制备的，是近年发展起来的一种独特的疫苗设计思路，代表了一种疫苗设计的新方向，对它的研究是基因工程疫苗研究领域里的热点之一。与传统疫苗相比，多表位疫苗有很多优势能被具有多种遗传背景的MHC分子识别、结合，从而得到高效的递呈；在细胞免疫方面具有独特的优势，可有效应对病原微生物的变异和免疫反应中的诸多不利因素。
抗原表位的选择为了使机体获得最佳的免疫保护，需综合考虑机体的免疫应答特征和疾病的特殊性，有针对性的选择目的表位。体液免疫和细胞免疫共同构成了机体的免疫应答系统。体液免疫主要是通过B细胞产生的抗体来发挥作用的，故可以选择特异性B细胞表位来定向诱导宿主的体液免疫应答。细胞免疫应答包括CD4+辅助性T细胞(分为Thl与Th2两个亚群)应答和CD8+细胞毒性T细胞应答，因此可根据机体对病原体的免疫应答特点，选择特异性的Thl表位、Th2表位或CTL表位诱导机体免疫应答向Thl、Th2或CTL应答类型定向发展。考虑到多表位疫苗的保护范围，可将目标抗原上的多个B细胞表位和外源性(或内源性)T细胞表位同时考虑进来，以诱导特异的体液和细胞免疫，从体液和细胞免疫水平发挥预防控制作用，这种设计可以拓宽多表位疫苗的保护谱。若选择的表位来自抗原分子的保守氨基酸区域，则可提供不同毒株之间的交叉免疫保护，可有效应对宿主自身基因的高频突变所造成的免疫逃避问题。据此构建具有交叉保护作用的可准确到达靶标的复合型多表位疫苗，可能是预防具有多血清型及高突变率病毒(如禽流感病毒)感染的有效途径。病毒表达系统历史上，痘苗病毒(Vaccinia virus,W)曾经为人类抗病毒斗争做出过巨大贡献， 曾作为预防天花的有效疫苗在世界范围内被广泛应用，为人类在全世界范围内消灭天花做出了决定性的贡献。痘苗病毒具有极高的免疫效率，但是它也具有明显的副作用。由于痘苗病毒的副作用，人们在六、七十年代就开始了痘苗病毒的致弱工作。1960年至1974年间，德国教授Anton Mayr领导的研究小组通过将鸡胚成纤维细胞(CEF)传代的方法，成功地将从Ankara地区分离得到的痘苗病毒CVA株致弱。传到516 代时，这株致弱毒株被命名为MVA (Modified Vaccinia Ankara)。MVA不但继承了 CVA良好的免疫原性，以及对天花保护性高的特点，同时在哺乳动物体内不能有效繁殖，所以MVA还具有对人和动物毒副作用小的特点。动物实验(鸡、兔和小鼠)显示，MVA对新生动物不产生任何副作用，甚至对于免疫缺陷的动物同样没有副作用。与亲本VV相比，MVA在许可细胞系中的产量远高于前者，表现出明显的宿主细胞适应倾向。研究表明，限制MVA宿主范围(Host Range, HR)的基因突变主要分布在基因组左端，已知的有KIL基因和SPI-I基因，本发明中利用的是KlL基因。由于MVA的基因组庞大而复杂，不可能通过基因拼接直接将外源基因插入到病毒基因组中。因此，必须依靠转移载体的协助，通过痘病毒DNA复制过程中发生的体内同源重组将外源基因导入痘病毒基因组。Staib等近期报道了利用RK-13生长限制筛选重组MVA的新方法。早先的研究已表明，RK-13是MVA的非许可宿主细胞，但如果在MVA基因组中补偿KIL基因，则可特异地恢复其在RK-13中的增殖。pGEM-KIL载体质粒中包含了表达宿主范围基因KIL的组件，以其作为瞬时选择标记，同时在KIL基因两侧又设置了重复的DNA序列，当重组基因插入MVA 基因组后，可通过在RK-13中选择性生长，获得无野生型病毒混杂的重组病毒，此时再感染 BHK-21细胞，在没有选择压力的条件下，KIL基因经基因组内部重组后很快被去除。此方法省却了传统方法需要使用抗生素和生色底物以及软琼脂培养的繁琐环节，相对简化了筛选过程。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的重组痘病毒rMVA-m印。本发明的另一目的是提供含有该重组痘病毒rMVA-m印的药用组合物。
本发明的又一目的是提供重组痘病毒rMVA-m印应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种重组转移载体pGEM-KlL-m印，包含表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的DNA序列SEQ ID NO. 1，以及MVA转移载体pGEM-KIL ；所述的MVA转移载体pGEM-KIL保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 5340，保藏日期为2011-10-13。一种重组痘病毒rMVA-m印，由所述的重组转移载体pGEM-KlL_m印转染被野生型MVA感染的原代仓鼠肾细胞BHK-21，并先后经RK-13细胞和BHK-21细胞传代纯化所得。该重组痘病毒rMVA-m印通过如下步骤得到(1)所述的重组转移载体pGEM-KlL-m印转染已被痘苗病毒野毒MVA感染的原代仓鼠肾细胞BHK-21，得到的培养液命名为BHK-21-m印；(2)将BHK-21-m印在兔肾细胞RK-13上传代若干代，直至不再存在痘苗病毒野毒MVA，得到的培养液命名为RK-13-m印；(3)将RK-13-m印感染原代仓鼠肾细胞BHK-21，并传代至重组病毒中宿主限制性基因KlL已缺失，从而得到重组痘病毒命名为rMVA-m印。所述的重组痘病毒rMVA-m印保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 5322，保藏日期为2011-10-13。一种药用组合物，包含所述的重组痘病毒rMVA-m印以及药学上可接受的载体和辅料。所述的重组转移载体pGEM-KlL-mep在制备预防和/或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。所述的重组痘病毒rMVA-mep在制备预防和/或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。所述的药用组合物在制备预防和/或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。有益效果1、本发明应用的痘苗病毒转移载体是经过改造的，有一定的宿主限制性。该痘苗病毒转移载体中包含了表达宿主限制范围基因的KIL组件，以其作为瞬时选择标记，同时在KIL基因两侧又设置了重复的DNA序列，当重组基因插入MVA基因组后，可通过在RK-13中选择性生长，获得无野生型病毒混杂的重组病毒，此时再感染BHK-21细胞，在没有选择压力的条件下，KIL基因经基因组内部重组后很快被去除。此方法省略了传统方法需要使用抗生素和生色底物以及软琼脂培养的繁琐环节，相对简化了筛选过程，如此得到的重组痘苗病毒，是野毒核酸与外源基因的重组。2.本发明利用痘苗病毒表达系统构建表达外源基因的重组痘病毒rMVA-mep 将Japanese encephalitis virus E protein多表位抗原基因克隆入痘苗病毒表达系统中，转染BHK-21细胞后进行PCR鉴定和Wfestern-blotting实验，结果表明外源多表位抗原基因在BHK-21细胞中高效表达。3.本发明构建的重组痘病毒疫苗与传统的原核表达系统表达目的蛋白作为疫苗相比，有如下优点一是重组痘苗病毒疫苗在动物体内产生的蛋白抗原具有天然构象，能最大程度的发挥抗原表位的作用；二是病毒本身及收获病毒过程中附带的细胞营养液等不会对动物产生不可预测的免疫干扰；三是重组痘苗病毒疫苗能够方便快速大量获得，能有效地节省时间和成本，可见具有明显的优势。
图1、多表位基因(m印)的SOE-PCR扩增与重组质粒pMD18-T_m印的酶切鉴定其中 M 表示 Marker 2000，1S0E-PCR 扩增产物 037bp)，2重组质粒pMD18-T-m印酶切鉴定(pMD18_T载体2680bp ；目的片段437bp)。图2:重组病毒的纯化A图为对BHK-21-m印转接于RK-13细胞传代鉴定目的基因为437bp，痘苗病毒野毒特征性基因为700bp左右，宿主限制性基因KlL 为 1332bp ；1 :RK-13-m印-6，2 :RK-13-mep-4 ；3 :RK-13-mep-3 ；4:RK-13-mep-l ；M 表示 Marker 2000 ；2、3、4泳道三者中同时含有三种基因，1泳道只有目的基因，无痘苗病毒特征性基因和宿主限制性基因，证明重组痘病毒在RK-13细胞上传代至第六代已经得到初步纯化， MVA野毒已经不存在。B图为对RK-13-m印-6进行PCR鉴定6 用KlL特异引物鉴定，结果含有KlL基因；7:用m印特异引物鉴定，结果含有m印基因；8 用MVA野毒特异性基因引物鉴定，结果不含有MVA野毒特异基因；M 表示 Marker 2000 ；证明重组痘病毒在RK-13细胞上传代至第六代已经得到初步纯化，MVA野毒已经不存在。C图为RK-13-m印-6转接于BHK-21细胞传代鉴定10 :BHK-21-mep-6 ；11 :BHK-21-mep-4 ；两者中只有目的基因；12 :BHK-21-mep-2 ；13 :BHK-21-mep-l ；两者中既含有目的基因也含有宿主限制性基因Kll ；M 表示 Marker 2000 ；证明RK-13-m印-6在BHK-21细胞上传代已经丢失KlL基因，重组毒得到充分纯化，纯化产物命名为rMVA-m印。图3 重组痘病毒表达目的基因的蛋白印记M为低分子量蛋白质Marker1 原核表达系统peU8-m印表达目的蛋白rMEP作阳性对照；2 :BHK-21-mep-6 表达目的蛋白；3 :BHK-21-mep-l 表达目的蛋白；4 :BHK-21细胞(未感染任何病毒)作空白对照；1、2、3泳道三者的目的条带大小和浓度一致，空白对照中无任何条带，说明重组痘病毒rMVA-m印能顺利表达目的蛋白并且具有一定的稳定性。图4:免疫程序示意图。图5 JEV抗体水平。图6 JEV抗体亚型IgGl水平。图7 JEV抗体亚型IgG2水平。图8 细胞因子(IFN-γ禾口 IL-4)水平。图9 淋巴细胞增殖水平。生物材料保藏信息MVA转移载体pGEM-KIL，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 5340，保藏日期为2011-10-13，分类命名为大肠埃希氏菌hcherichiacoli ο重组痘病毒rMVA-m印，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 5322，保藏日期为2011-10-13，分类命名为豆苗病毒。
具体实施例方式实施例11.获取 Japanese encephalitis virus E protein 多表位抗原基因并克隆入PMD18-T 载体本发明选择了 E蛋白上6个能诱导机体产生中和抗体的B细胞表位，氨基酸残基分别位于 75-92，149-163，258-285，356-362，373-399，397-403。以及一个 CTL 表位和一个Th表位，氨基酸残基分别位于60-68和436-445，见表1。根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则，设计合成10条引物，见表2。采用重叠延伸PCR(SOE)合成JEVE蛋白的多表位基因，命名为m印，将其克隆到pMD18-T载体，测序分析正确获得阳性质粒，命名为pMD18-T_m印，该m印基因序列为SEQ ID No. 1。重叠延伸PCR (SOE)扩增体系为 5 X SP Buffer 10 μ L，dNTP (2. 5mM) 2 μ L，引物 F1、F2、F3、F4、F5、Rl、R2、R3、R4、R5 各 1 μ L，PrimeSTAR DNA 聚合酶 0. 5 μ L，去离子水补至50 μ L0重叠延伸PCR(SOE)扩增条件95°C预变性5min，扩增条件为94°C 30s，57°C 30s，72°C 30s，35cycles，72°C延伸 IOmin0
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表1各表位的特点
权利要求
1.一种重组转移载体pGEM-KlL-mep，其特征在于包含表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的DNA序列SEQ ID NO. 1，以及MVA转移载体pGEM-KIL ；所述的MVA转移载体pGEM-KIL 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 5340，保藏日期为 2011-10-13。
2.一种重组痘苗病毒rMVA-mep，其特征在于由权利要求1所述的重组转移载体 pGEM-KlL-m印转染被野生型MVA感染的原代仓鼠肾细胞BHK-21细胞，并先后经RK-13细胞和BHK-21细胞传代纯化所得。
3.根据权利要求2所述的重组痘苗病毒rMVA-m印，其特征在于该重组痘苗病毒 rMVA-mep通过如下步骤得到(1)所述的重组转移载体pGEM-KlL-mep转染已被痘苗病毒野毒感染的原代仓鼠肾细胞BHK-21，此培养液命名为BHK-21-m印；(2)将BHK-21-m印在兔肾细胞RK-13上传代若干代，直至不再存在痘苗病毒野毒所得培养液命名为RK-13-m印；(3)将RK-13-m印感染原代仓鼠肾细胞BHK-21细胞，并传代至重组病毒中宿主限制性基因Kll已缺失，从而得到重组痘苗病毒命名为rMVA-m印。
4.根据权利要求3所述的重组痘苗病毒rMVA-m印，其特征在于所述的重组痘苗病毒rMVA-mep保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 5322，保藏日期为 2011-10-13。
5.一种药用组合物，其特征在于包含权利要求2所述的重组痘苗病毒rMVA-mep以及药学上可接受载体和辅料。
6.权利要求1所述的重组转移载体pGEM-KlL-m印在制备预防和/或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。
7.权利要求2所述的重组痘苗病毒rMVA-mep在制备预防和/或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。
8.权利要求5所述的药用组合物在制备预防和/或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的重组痘病毒rMVA-mep及其应用。一种重组转移载体pGEM-K1L-mep，包含表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的DNA序列SEQ ID NO.1，以及MVA转移载体pGEM-K1L。一种重组痘病毒rMVA-mep，由所述的重组转移载体pGEM-K1L-mep转染被野生型MVA感染的原代仓鼠肾细胞BHK-21，并先后经RK-13细胞和BHK-21细胞传代纯化所得。所述的重组痘病毒rMVA-mep可在制备预防和/或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。
文档编号C12R1/93GK102392048SQ201110338030
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者冯秀丽, 周斌, 曹瑞兵, 王凤娟, 茅翔, 陈溥言 申请人:南京农业大学