抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克 隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED)是由冠状病毒属的猪流行性 腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性猪肠 道传染病，此病以猪的呕吐、腹泻、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征。1978年，该病 在比利时与英国被首次报道。随后，在匈牙利、意大利、中国、日本、泰国、美国和韩国等国 家也陆续发现该病。自2010年底以来，PEDV变异体给中国养猪行业造成巨大的经济损 失。2013年，美国也爆发PEDV变异病毒。近年来，PEDV是引起中国和美国仔猪死亡的一 个重要病原体。PEDV基因组全长约为28kb，包含7个开放阅读框能够编码4个主要的结构 蛋白：纤突蛋白（spike, S)、包膜蛋白（envelope, E)、膜糖蛋白（membrane, M)、核衣壳蛋白 (nucleocapsid，N)和3种非结构蛋白：复制酶la和lb，0RF3。其中N蛋白在PEDV的结构 蛋白中所占的比例较大，具有较强的抗原性，不仅能够诱导宿主T细胞和B细胞免疫反应， 而且在病毒感染早期，机体内能够产生较高水平的抗N蛋白抗体（孙东波，冯力，时洪艳， 等，2006)。N蛋白为螺旋病毒粒子提供一个结构基础，是一个与基因组相关联的碱性磷蛋 白。
[0003] 猪感染PEDV后，如果仅依据临床症状、病理变化和流行病学很难做出正确的诊 断，特别是与传染性胃肠炎（TGE)不易区别，必须依靠实验室技术才能作出正确诊断。目前 诊断PEDV感染的方法有间接血凝试验（IHA)、免疫电镜（IEM)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、 免疫荧光（IF)、RT-PCR等，其中免疫荧光和酶联免疫吸附试验较为常见（邓祖丽颖，2013 ; 郑逢梅，赵军，霍金耀，等，2013)。但这些现有的诊断技术较为耗时、耗力，无法在临床上 广泛应用。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体， 该单克隆抗体可用于快速准确地诊断猪流行性腹泻病毒（PH)V)。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0006] 在本发明的一个方面，提供了一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体。
[0007] 优选的，所述猪流行性腹泻病毒N蛋白具有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
[0008] 更优选的，所述抗体是由杂交瘤细胞株CCTCC NO. C2014136分泌的单克隆抗体。
[0009] 在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，其包含编码SEQ ID NO. 1所示氨基 酸序列的核苷酸序列。
[0010] 所述重组载体的空载体包括原核表达载体或真核表达载体。
[0011] 在本发明中，原核表达载体优选pCold I DNA原核表达载体。
[0012] 在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，其包含上述重组载体。
[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经 表达而制得。
[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步 骤：
[0015] 构建含猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的重组表达载体；
[0016] 将所述重组表达载体转化入宿主细胞进行诱导表达，得可溶性的猪流行性腹泻病 毒重组N蛋白；
[0017] 将所述重组N蛋白纯化后免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0瘤细胞融 合，筛选获得分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞；
[0018] 将所述杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，小鼠腹部胀大后，采集腹水，即得抗猪流行性 腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体。
[0019] 在本发明的另一方面，还提供了一种诊断猪流行性腹泻病毒感染的试剂盒，包含 上述单克隆抗体。
[0020] 在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备诊断猪流行性腹泻病毒感 染的产品中的应用。
[0021] 在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备预防猪流行性腹泻病毒感 染的产品中的应用。
[0022] 本发明抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，与猪流行性腹泻病毒具有良好 的反应性，适用于快速准确地诊断PEDV，同时为监测、预防PEDV提供重要的技术支撑，具有 很好的应用前景。
【附图说明】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0024] 图1是本发明实施例1的PEDV N基因 PCR扩增（1A)及构建原核表达载体后 PCR(IB)及酶切鉴定（1C)结果图；
[0025] 图2是本发明实施例1纯化的N蛋白表达产物SDS-PAGE(2A)和重组N蛋白的 westernblot(2B)结果图；
[0026] 图3是本发明实施例3抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗ELISA效价鉴定结果图；
[0027] 图4是本发明实施例4猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体特异性鉴定图；
[0028] 图5是本发明实施例5抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗Western blot分析结果 图；
[0029] 图6是本发明实施例5抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗IFA分析结果图。
[0030] 本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞系，已于2014年8月5日保藏于中国典型培养 物保藏中心（简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心），保藏号为 CCTCCNO. C2014136,其分类命名为杂交瘤细胞株2B8。
【具体实施方式】
[0031] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F. Μ.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京： 科学出版社，2004)中所述的方法进行。
[0032] 为了快速准确地诊断PEDV，本发明研制出了能够与猪流行性腹泻病毒N蛋白具有 良好反应性的单克隆抗体。具体通过如下过程获得特异性的单克隆抗体：
[0033] 1、根据猪流行性腹泻病毒JS-2013株核苷酸序列信息，设计一对扩增N基因全长 的引物。提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物N-F、N-R扩增全长N基因，将其克 隆到Pcold- I表达载体上，经酶切、测序鉴定正确后，将该质粒转入感受态细胞BL21 (DE3) 中，利用IPTG诱导表达。用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化，获得可溶性重组N蛋白，作为 制备后续单克隆抗体的免疫原。
[0034] 2、将纯化后重组N蛋白作为免疫原，免疫6周龄雌性BABL/c小鼠。首次免疫使用 完全弗氏佐剂，二免选用不完全弗氏佐剂，重组N蛋白与弗氏佐剂1:1比例混合，首次免疫 蛋白量加倍。第三、四次直接免疫重组N蛋白。融合前3~4d，腹腔注射纯抗原加强免疫。 取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0瘤细胞按5:1的比例融合，筛选阳性杂交瘤细胞，采用 有限稀释法经4次亚克隆选取分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞，按10 6个细胞/只免 疫8周龄BABL/c小鼠，7天后采取小鼠腹水，获得单克隆抗体。
[0035] 实施例1重组表达猪流行性腹泻病毒N蛋白
[0036] 根据猪流行性腹泻病毒JS-2013株核苷酸序列信息，设计一对扩增N基因全长 (1326bp，N基因全长序列如SEQ ID N0. 2所示）的引物，由上海生工生物工程股份有限公 司合成。上游引物序列为：N-F :5' -GCTCGGTACCCTCGAGATGGCTTCTGTCAGITTTCAGGATC-3'（S EQ ID N0.3);下游引物序列为 N-R:5'-ATTCGGATCCCTCGAGTTAAITTCCTGTGTCGAAGATCTCG-3 '彼0 10勵.4)，酶切位点为乂11〇1。提取病毒基因组8嫩，反转录合成(^嫩，用引物1^、 N-R扩增全长N基因，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定回收，通过PCR扩增出大小约 1300bp的N基因，与预期结果相符（图1A)。载体pCold I DNA用Xhol酶切后与PCR产物 各 100ng，用 5X In-Fusion HD Enzyme Premix50°C连接 15min 后转化 DE3 感受态细胞，均 匀涂布于含氨苄抗性的LB琼脂平板上，37°C培养14h~16h挑取菌落摇菌，PCR和酶切鉴 定重组表达质粒是否正确，PCR鉴定结果如图1B所示，扩增出了大小约1300bp的N基因， 酶切鉴定结果如图1C所示，获得了 1300bp左右的N基因酶切片段。将PCR鉴定正确的质 粒送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。测序结果表明载体构建成功。经测序 鉴定正确的阳性表达载体质粒命名为pCoId I-N。
[0037] 原核表达、纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白程序如下：
[0038] 将鉴定为阳性的pCold I-N/DE3细菌接种2XYT培养基，接种比例1 :100,经37°C 振荡摇菌至菌液0D值达到0. 6后，加入IPTG至终浓度为0. 5mM，15°C继续诱导12h。离心收 集菌液并用PBS清洗2遍后，破菌缓冲液重悬后，超声至菌液澄清，离心去除超声沉淀，纯化 上清，按照His-Binding-Resin蛋白纯化试剂盒说明书纯化表达的N蛋白，并使用Bradford 蛋白质定量试剂盒对目的蛋白进行定量分析。将纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印 到PVDF膜上，与PEDV阳性猪血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG和 ECL显色。SDA-PAGE与Weatern blot结果显示，原核表达纯化的重组蛋白大小约为52kDa， 与预期蛋白大小相符（图2)，猪流行性腹泻病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 图2中，图2A为pCold I DNA原核表达载体表达猪流行性腹泻病毒重组N蛋白的SDS-PAGE 电泳结果图，其中Μ为蛋白质分子量标准；1为0. 5mM IPTG诱导表达菌液超声沉淀；2为 0. 5mM IPTG诱导表达菌液超声上清；3为纯化重组N蛋白；图2B为鼠抗His标签单克隆抗 体Western blot鉴定重组蛋白结果图，其中Μ为蛋白质分子量标准；1为pCold I DNA空 载体诱导产物；2为纯化的重组N蛋白。
[0039] 实施例2抗猪流行性腹泻病毒N蛋白鼠源单克隆抗体的制备
[0040] 如实施例1中纯化制备的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白作为免疫原，免疫小鼠，用 于制备单克隆抗体。选择6周龄BABL/c雌性小鼠，免疫表达纯化的N蛋白。首次免疫以纯 化的N蛋白作为免疫原，与弗氏完全佐剂1:1比例混合后，按50ug/只（200ul/只）的抗原 量经腹腔注射。两周后，再经腹腔注射，用弗氏不完全佐剂处理同一剂量抗原，每隔两周重 复免疫一次。每次免疫前，眼眶采血，ELISA鉴定抗体效价。第三次免疫开始，不加佐剂。融 合前3~4d，腹腔注射纯抗原加强免疫。取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合，进行单克隆抗体制 备。融合两周后，间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，具体方法如下：
[0041] 1、包被：纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pCold I DNA表达载体His标签蛋 白分别包被ELISA酶标板，每孔包被量为200ng/100 μ L，4°C包被过夜。
[0042] 2、洗涤：用含有5%。tween-20的PBST洗涤3次，200 μ L