地特胰岛素或其类似物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胰岛素类似物的制备方法，尤其涉及由人双链胰岛素前体desB30的 B29位赖氨酸的ε-氨基选择性酰化生成地特胰岛素或其类似物的方法，属于胰岛素类似物 的制备领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，其基本病理特征 为绝对或相对性胰岛素分泌不足所引起的代谢紊乱。糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性 肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病，尤其是它所带来的视网膜病变、周围 神经病变、糖尿病肾病等并发症严重影响了人们的生活质量。
[0003] 胰岛素及其类似物是最直接和最有效的糖尿病治疗药物，中国胰岛素市场潜力巨 大。地特胰岛素 （Insulin detemir)是一种中性、可溶的长效胰岛素。它是原型胰岛素去除 了 B链第30位苏氨酸，通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链ε-氨基结合一个14碳的直链脂肪酸 而成，是一种胰岛素类似物。酰化的脂肪酸可稳定胰岛素分子的自身聚集，且与白蛋白可逆 性结合，使地特胰岛素从皮下注射部位吸收缓慢，作用持续时间延长，在控制血糖的同时能 减少低血糖的风险。
[0004] 由于胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物都具有位于Α1、Β1位置氨基酸的游离α-氨 基与Β29位赖氨酸侧链上的游离ε-氨基，这三种游离氨基均可与活性酯、酰卤或酸酐形成共 价键，从而形成单酰化胰岛素、双酰化胰岛素甚至三酰化产物。从诺和诺德申请的多项专利 中公开的酰化路线，首先利用二碳酸二叔丁酯(B0C)衍生保护胰岛素两条链的Ν末端α-氨 基，再利用肉豆蔻酸琥珀酰亚胺酯酰化Β29位赖氨酸的ε-氨基，最后利用TFA脱保护，生成地 特胰岛素。如果酰化剂过量会生成大量的二取代或者三取代衍生物，因此该工艺步骤繁琐、 副产物多，会增加下游纯化的难度，同时不利于整体收率的提高。ε -氨基选择性酰化专利 (中国专利CN1171742Α)中采用一步选择性酰化，在pH 10.5的碱性条件下，利用优选活化酯 (棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)进行酰化反应，酸性条件终止反应，该方法虽然在一定程度上 提升了酰化效率，其最终的酰化效率仍然不高，距规模化的工业应用尚有一定的距离，有待 改进。
[0005] 现有由胰岛素前体通过酰化反应制备地特胰岛素或其类似物的方法中不同程度 的存在酰化效率低、副产物多、成本高等缺点。因此，开发一种新的可产业化的酰化效率高、 副产物少，生产成本低的地特胰岛素或其类似物的高效制备方法，将为工业化应用奠定重 要的基础。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，该方 法将B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30,在未保护desB30蛋白双链N末端α-氨基的条件下，利用活化酯一步选择性地酰化Β29位赖氨酸的ε-氨基，从而生成地特胰岛素 或其类似物。本发明方法的选择性酰化具有效率高、酰化反应时间短、副产物少等优点。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0008] 本发明首先公开了一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，包括以下步骤：（1)将 人双链胰岛素前体desB30溶解于水相缓冲液中，得到desB30前体溶液，调节desB30前体溶 液的pH值，然后加入有机相，混匀得到混合溶液；（2)向混合溶液中加入活化酯溶液，进行选 择性酰化反应；（3)终止反应，分离纯化，即得;其中，步骤（1)调节desB30前体溶液的pH值至 8.0-11.0;优选的，步骤(1)调节desB30前体溶液的pH值至9.0-9.5，更优选为9.0。
[0009] 步骤(2)所述活化酯溶液是将活化酯溶解于有机相中，使活化酯的浓度为8_12mg/ ml，优选为10mg/ml (活化酯溶液要现配现用）。
[0010] 步骤(2)所述选择性地酰化反应中，活化酯与人双链胰岛素前体desB30的摩尔比 为4:1-1:4,优选为2:1-1:2,更优选为1:1。其中，所述活化酯选自肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯、 棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯、辛酸N-琥珀酰亚胺基酯中的任意一种;所述有机相选自乙腈、甲 醇或乙醇中的任意一种，优选为乙醇。
[0011] 步骤(2)所述选择性地酰化反应是在未保护人双链胰岛素前体desB30蛋白双链N 末端α_氨基的条件下，利用活化酯酰化人双链胰岛素前体desB30的B29位赖氨酸的ε-氨基； 其中，当活化酯为肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯时，人双链胰岛素前体desB30经一步选择性酰化， 得到的目的产物是地特胰岛素。
[0012] 本发明所述制备方法中，步骤(2)所述选择性酰化反应的时间为15-60min，优选为 25-60min，更优选为25-45min。所述选择性酰化反应的温度为室温，即15-30°C，优选为25 〇C。
[0013] 步骤(1)所述水相缓冲液为磷酸氢二钠缓冲液;优选的，所述磷酸氢二钠缓冲液的 浓度为50-120mmol/L，pH值为2-4;更优选的，所述磷酸氢二钠缓冲液的浓度为100mmol/L， pH值为3 〇
[0014]步骤（1)所述desB30前体溶液中，人双链胰岛素前体desB30的终浓度为4-8mg/ml， 优选为6mg/ml。步骤（1)所述有机相的体积是混合溶液总体积的30-50%，优选为40% ;其 中，所述有机相选自乙腈、甲醇或乙醇中的任意一种，优选为乙醇。
[0015] 本发明所述制备方法中，步骤(3)所述终止反应为调节反应液的pH值至6.5-7.5， 优选为7.0。本发明加入lmo 1 /L HC1调节反应液的pH值。
[0016] -步酰化反应首先需氨基去质子化，其次酰基的供体需要较高的活化能。本发明 中当desB30前体溶液的pH在8-11的范围内，优选pH为9,使胰岛素前体在水溶液中ε-氨基处 于未离子化，而α_氨基则被重新离子化的状态。本发明通过实验发现，desB30前体溶液的pH 值在8-11之间都可以发生酰化反应;其中pH值偏8的条件下，易产生A1，B1位单酰化产物;而 pH为9.0与9.5的酰化反应产率较高，pH 9.0的酰化反应产率为81.7%，pH 9.5的酰化反应 产率为73% ;根据统计学显著性差异计算，p = 0.00021〈0.05，说明pH 9.0与pH 9.5的酰化 反应产率具有显著性差异。因此，本发明中desB30前体溶液的pH优选9.0。
[0017] 本发明还发现，活化酯与desB30的摩尔比在4:卜1:4之间都可以发生酰化反应;活 化酯与desB30的摩尔比在2:1-1:2之间时酰化反应产率达70%-87.2%。活化酯加入量少， 会导致desB30有未酰化的；活化酯加入量过高，会导致产生大量的二酰化。因此，最优选为 活化酯与desB30的摩尔比为1: 1，酰化反应产率达到87.2%，达到优化的条件下还可减少成 本。
[0018] 本发明通过实验发现，在优选的条件下，酰化反应进行25min即可达到86.8%的酰 化率，时间继续加长，对酰化率的影响不大，酰化反应45min的酰化率为86%、60min的酰化 率为85.7%。
[0019] 本发明通过将人双链胰岛素前体desB30在不同的缓冲液下溶解然后与活化酯进 行酰化反应，结果表明，磷酸氢二钠的效果比硼酸好，因为硼酸溶液存在下会产生一个较大 脱氨杂峰，影响酰化率。因此，本发明的水相缓冲液优选为磷酸氢二钠缓冲液。
[0020] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0021] 本发明建立了一种采用活化酯一步选择性酰化胰岛素前体desB30的B29位赖氨酸 侧链ε_氨基转化成地特胰岛素或其类似物的方法。利用该方法酰化目的产物的得