00mm〇l/L pH 3的磷酸氢二钠溶 液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化 酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯）固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ ml〇
[0054] 用lmol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.5,加入纯乙醇，使得乙醇所占体积是 总反应液体积的40%，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与 desB30的摩尔比约为1:2,搅拌反应60min，反应的温度为25°C。
[0055] 各加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.0,终止酰化反应，采用液相检测，根据公 式(酰化反应产率=(地特胰岛素类似物含量/desB30含量）X 100% )，计算出酰化反应产率 为 72.3%〇
[0056]实施例4地特胰岛素的制备
[0057] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mm〇l/L pH 3的磷酸氢二钠溶 液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度均为6mg/ml。将活化 酯（肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于纯乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为l〇mg/ ml〇
[0058] 平分desB30前体溶液，用lmol/L NaOH将desB30前体溶液，分别调pH至8.0、8.5、 9.0、9.5、10、10.5、11，均加入纯乙醇，使得所占体积是总反应液体积的40 %，用磁力搅拌器 缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:2,搅拌反应 60min，反应的温度为25°C。
[0059] 各加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.0,终止酰化反应，采用液相检测，根据公 式:酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X 100 %，计算出pH 8.0条件下的酰化 反应率为46%，纯度为58%，副产物为单酰化及二酰化；pH 8.5条件下的酰化反应率为 65 %，纯度为73 %，副产物为单酰化所及二酰化;pH 9.0条件下的酰化反应率为81.7 %，纯 度为87.2 %，副产物为二酰化;pH 9.5条件下的酰化反应率为73 %，纯度为79.8 %，副产物 为二酰化及三酰化;pH 10.0条件下的酰化反应率为71.5%，纯度为78% ;pH 10.5条件下的 酰化反应率为65.8%，纯度为72% ;pH 11.0条件下的酰化反应率为57%，纯度65%。
[0060]可见，酰化反应液的pH在8-11之间都可以发生酰化反应，其中pH偏8的条件下，易 产生A1，B1位单酰化产物，故pH为9.0与9.5较优。
[0061]实施例5地特胰岛素的制备
[0062] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶 液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化 酯（肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为l〇mg/ ml 〇
[0063] 用1111〇1/1似0!1将(^成30前体溶液调？!1至9.5，加入纯乙醇，使得所占体积是总反 应液体积的40%，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30 的摩尔比约为1:2,搅拌反应60min，反应的温度为25°C。
[0064] 加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.0,终止酰化反应，采用液相检测，根据公式： 酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X100%，重复试验5次，计算出酰化反应产 率分别为74.72%，73.58%，74%，74.78%，72.8%。
[0065]实施例6地特胰岛素的制备
[0066] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶 液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化 酯（肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为l〇mg/ ml〇
[0067] 用lmol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得所占体积是总反 应液体积的40%，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30 的摩尔比约为1:2,搅拌反应60min，反应的温度为25°C。
[0068] 加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.0,终止酰化反应，采用液相检测，根据公式： 酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X100%，重复试验5次，计算出酰化反应产 率分别为81.73%，80.6%，81.27%，82.38%，81.96%。
[0069] 对比实施例5和实施例6,根据统计学显著性差异计算，？ = 0.00021〈0.05，说明？!1 9.0与pH 9.5的酰化反应产率具有显著性差异，故desB30前体溶液的pH优选9.0。
[0070] 实施例7地特胰岛素的制备
[0071] 将重组人双链胰岛素前体(desB30)冻干粉末溶于100mm〇l/L pH 3的磷酸氢二钠 溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活 化酯（肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为l〇mg/ ml〇
[0072] 用lmol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得所占体积是总反 应液体积的40 %，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，平分混合液，缓慢加入活化酯，使活 化酯与desB30的摩尔比分别为4:1，3:1，2 :1，1:1，1:2，1:3，1:4，搅拌反应60min，反应的温 度为25°C。
[0073] 各加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.0,终止酰化反应，采用液相检测，根据公 式:酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X 100%，计算出，摩尔比为4:1时酰化 反应产率为45%，摩尔比为3:1时酰化反应产率为58%，摩尔比为2:1时酰化反应产率为 70%，摩尔比1:1时酰化反应产率为87.2%，摩尔比为1:2时酰化反应产率为76.5%，摩尔比 为1:3时酰化反应产率为63.8%，摩尔比为1:4时酰化反应产率为52%。
[0074]可以看出，加入的活化酯与desB30的摩尔比4:1-1:4之间，最优值为1:1，达到优化 的条件下亦可减少成本。活化酯加入量少，会导致desB30有未酰化的，活化酯加入量过高， 会导致产生大量的二酰化(图2)。
[0075]实施例8地特胰岛素的制备
[0076] 将重组人双链胰岛素前体(desB30)冻干粉末溶于100mm〇l/L pH 3的磷酸氢二钠 溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解（肉眼观察），使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活 化酯（肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯）固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为l〇mg/ ml〇
[0077]用lmol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得所占体积是总反 应液体积的40%，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30 的摩尔比约为1:1，搅拌反应 15111；[11、20111；[11、25111；[11、45111；[11、60111；[11，反应的温度为25°(3。
[0078] 加入lmol/L HC1调节反应液的pH至7.0,终止酰化反应，采用液相检测，根据公式： 酰化反应产率=(地特胰岛素含量/desB30含量）X 100%，计算出反应