神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇特异性控制剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇 特异性控制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 柑桔是重要的经济作物，随着我国农业产业结构调整，柑桔产业规模不断扩大，已 经逐渐成为多地区的支柱产业。桔小实绳(Bactrocera dorsalis)由于其极强的环境适应 能力和入侵扩散能力，严重危害多种重要经济果蔬，尤其是柑桔。目前，桔小实蝇已成为柑 桔产业健康发展的巨大威胁。目前，桔小实蝇已对市面上的有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯和阿 维菌素等农药产生了严重的抗药性;农药残留严重污染环境，对食品安全造成了隐患;农药 的特异性较低，威胁到有害生物天敌，有加剧农业有害生物爆发的风险。
[0003] 短神经肽F(short neuropeptide F,sNPF)序列在不同种昆虫中具有较高保守性， 其功能在昆虫中参与调控了进食、生长、应激反应、嗅觉、生殖、激素分泌、学习及记忆等多 种生理活动。sNPF受体(sNPFR)属于G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR) 家族。目前，50%以上的临床用药以及正在研发中的药物以GPCR为作用靶标。据统计，全球 20种最畅销药物中就有12个以GPCR为靶标，每年的销售总额达500多亿美元。因此，该类受 体的整个信号传递系统在药物开发和设计中占有极其重要的地位。由于短神经肽在昆虫生 理活动中的重要作用，以其受体(sNPFR)作为潜在靶标创制害虫特异的杀虫剂来达到控制 桔小实蝇的方法受到越来越多的重视，也具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇特异性控制剂中的 应用。
[0005] 在本发明的第一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF基因及其编码的蛋白质，所 述桔小实蝇神经肽sNPF基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，其编码的蛋白质的氨基酸 序列如SEQ ID N0:10所示。
[0006] 在本发明的另一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF基因的扩增方法，包括如下 步骤:提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板采用巢式PCR的扩增方法，第一轮 扩增的引物为sNPF-1-F和sNPF-1-R，第二轮扩增的引物为sNPF-2-F和sNPF-2-R，所述引物 的序列为：
[0007] sNPF-1-F:GGAAAACAAAGCTGTACCAAC，
[0008] sNPF-1-R:CTGCTTTTGCCAATTATATAG，
[0009] sNPF-2-F：CAGCGTTCAAAATGTTCATGTC,
[0010] sNPF-2-R：GCATTTAATTTTTAGCTTGTGC 〇
[0011]在本发明的另一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽(也称sNPFR配体)基 因及其编码的蛋白质，所述桔小实蝇神经肽sNPF配体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11~14所 示，所述核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 15~18所示。
[0012] 在本发明的另一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF受体基因及其编码的蛋白 质，所述桔小实蝇神经肽sNPF受体基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:19所示，其编码的蛋白 质的氨基酸序列如SEQ ID N0:20所示。
[0013] 在本发明的另一方面，提供一种桔小实蝇神经肽SNPF受体基因的扩增方法，包括 如下步骤:提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板采用巢式PCR的扩增方法，第 一轮扩增的引物为sNPFR-1-F和sNPFR-1-R，第二轮扩增的引物为sNPFR-2-F和sNPFR-2-R， 所述引物的序列为：
[0014] sNPFR-1-F：GCAATCATAATGGATGCAGTAG,
[0015] sNPFR-1-R：CAAGTGGCTGACTAGTTTCAG,
[0016] sNPFR-2-F：GTGCAACAAAAGCACACATGAATG,
[0017] sNPFR-2-R：CAAGTGGCTGACTAGTTTCAG 〇
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种前述的桔小实蝇神经肽sNPF基因及其编码的蛋白 质、桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽基因及其编码的蛋白质、或者桔小实蝇神经肽sNPFR基因及 其编码的蛋白质，在实蝇神经调节方面的应用，在实蝇防治上的应用，或者在制备实蝇杀虫 剂方面的应用。
[0019] 本发明的有益效果是:本发明提供的桔小实蝇神经肽sNPFR的配体多肽与SNPFR具 有很好的结合能力，证明本发明提供的配体具有体外活性，提供的配体多肽和编码该配体 多肽的DNA可以用于针对该GPCR开发药物，例如桔小实蝇神经调节剂。通过利用按照本发明 的重组G蛋白-偶联受体蛋白的表达的受体结合测定系统，可以筛选对桔小实蝇sNPFR特异 性的激动剂和拮抗剂(对模式配体有促进作用的为激动剂，反之，起拮抗作用的为拮抗剂）， 所获得的激动剂或拮抗剂可以用于桔小实蝇的防治，在制备实蝇杀虫剂方面有良好的应用 前景。
【附图说明】
[0020] 图1为桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽对sNPFR的活性测定结果图。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022] 主要试剂及生产者：
[0023] 2 XPrimeSTARMax Premix(Takara公司，日本）
[0024] RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(天根公司，中国）
[0025] pGEM-T Easy Vector(Promega公司，美国）
[0026] DNA连接试剂盒(Takara公司，日本）
[0027] Trans5a感受态细胞(Transgen公司，中国）
[0028] DNA回收试剂盒(Takara公司，日本）
[0029] pcDNA3.1( + )质粒（Invitrogen公司，美国）
[0030]酶NotI(NEB公司，美国）
[0031] 质粒DNA提取试剂盒(QIAGEN，德国）
[0032] DMEM/F-12medium(Gibco公司，美国）
[0033] T4DNA连接酶（Takara公司，日本）
[0034] 基因组DNA提取试剂盒(天根公司，中国）
[0035]水母素 Aequorin质粒由美国堪萨斯州立大学提供
[0036] ViaFect转染试剂(Promega公司，美国）
[0037] 腔肠素 Coelanterazine Η储存溶液（Life-technologies公司，美国）
[0038] 本发明实施例中的各序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0039] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建 议的条件。
[0040] 实施例一、桔小实蝇神经肽sNPF及其受体的开放阅读框序列的获得
[0041] 1、桔小实蝇神经肽sNPF及其受体的开放阅读框序列引物设计及扩增
[0042] 基于基因组及转录组数据，采用生物信息学方法，经过对果蝇sNPF(Genbank N〇.AY626808)和其sNPFR(Genbank No.NP524176)反复分析及比对，设计桔小实蝇神经肽 sNPF及其受体(sNPFR)的巢氏PCR特异性引物，序列如下：
[0043]
[0044] 用RNA提取试剂盒提取桔小实蝇总RNA，用反转录试剂盒反转录为cDNA。
[0045] 扩增桔小实蝇神经肽sNPF序列：50ul的反应体系包含24yL去离子水，20yL 2X PrimeSTAR Max Premix,引物sNPF-1-F(如序列表中SEQ ID N0:1 所示）、sNPF-1-R(如序列 表中SEQ ID N0:2所示)各2yL(浓度均为10μΜ)，2yL桔小实蝇cDNA模板。第一轮PCR扩增条件 如下：预变性:98°C反应2min，随后，98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸1.5min，循环35 次，最后72°C延伸10min。取第一轮PCR扩增得到的扩增产物2yL作为第二轮PCR扩增的模板， 扩增引物用sNPF-2-F(如序列表中SEQ ID N0:3所示)和sNPF-2-R(如序列表中SEQ ID N0:4 所示），50ul的反应体系的其余组分与第一轮扩增时相同，第二轮PCR扩增条件与第一轮相 同。
[0046]扩增桔小实蝇神经肽sNPFR序列：50ul的反应体系，以及第一、二轮的PCR扩增条件 与前述扩增sNPF序列时相同，只需将第一轮的引物换为sNPFR-1-F(如序列表中SEQ ID N0: 5所示）、sNPFR-1-R(如序列表中SEQ ID N0:6所示），第二轮的引物换为sNPFR-2-F(如序列 表中SEQ ID N0:7所示）、sNPFR-2-R(如序列表中SEQ ID N0:8所示）即可。
[0047] 2、扩增产物构建到T载体上
[0048]将前述扩增的桔小实蝇神经肽sNPF和sNPFR产物分别构建到T载体上，操作步骤如 下：
[0049] 1)连接:将桔小实蝇神经肽sNPF扩增产物或者sNPFR扩增产物连接到pGEM-T Easy Vector上，具体操作见DNA连接试剂盒。
[0050] 2)转化:在超净工作台将2.5yL步骤1)得到的连接产物加入到50yL的Trans5a感受 态细胞中，混勾，置冰上冰浴30min。42°(3水浴热击65sec，再放入冰浴中5min。加入无氨节