茄子隐花色素基因SmCRY1及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及茄子光信号通路中的关键酶及其编码基因，具体 涉及一种茄子隐花色素基因 SmCRYI及其用途。
【背景技术】
[0002] 蓝光和近紫外光可以使植物产生蓝光反应，隐花色素在植物中的主要作用就是作 为蓝光和近紫外光的受体，来调节植物的生长发育。在拟南芥中存在3个隐花色素基因 CRY1，CRY2和CRY3,其中研究比较多的主要是CRY1和CRY2XRY1和CRY2蛋白在蓝光照射条件 下发生磷酸化，这种磷酸化是特异的依赖于蓝光并随着蓝光光强的增强而增加，而红光和 远红光并没有这种效果。CRY1和CRY2蛋白的磷酸化和其功能发挥也是密切相关的，筛选到 的CRY1和CRY2功能缺失的cryl和cry2突变体中，有多数是因为突变位点干扰了CRY蛋白的 磷酸化。
[0003] 对隐花色素 CRY1生理功能的了解主要是通过分析其功能缺失突变体cryl及过表 达转基因材料CRYl-ox实现的，对它们的表型分析显示，随着蓝光强度的增强，与野生型相 比，cryl下胚轴长度显著高于野生型，表现为弱敏感反应，而相反的CRYl-ox与野生型相比， 其下胚轴长度表现为对蓝光的超敏感的反应。CRYl-ox幼苗在蓝光下还表现为子叶面积增 大和花色素苷的过量积累，而cryl突变体在上述两个表型上与CRYl-ox相反。
[0004] 目前已从很多植物中克隆得到CRY基因，如拟南芥、大豆、玉米、番茄等。茄子是重 要的蔬菜作物，但相关研究相对比较滞后。目前，未有任何与茄子CRY1基因及其编码蛋白的 相关文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于填补茄子CRY1基因的空白；提供一种茄子隐花色素 CRY1的cDNA 以及氨基酸序列;进一步地，本发明提供了茄子SmCRYI基因在不同组织器官的表达模式。本 发明还提供了 SmCRYI转入拟南芥后表型发生改变的结果。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明涉及一种茄子CRY1蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
[0008] 第二方面，本发明还涉及一种编码所述茄子CRY1蛋白的SmCRYI基因，所述SmCRYI 基因的cDNA序列包括：
[0009] (a)如SEQ ID NO. 1第1~2037位所示的碱基序列；或
[0010] (b)与SEQ ID NO. 1第1~2037位所示的碱基序列具有至少70%的同源性的碱基序 列;或
[0011] (C)能与SEQ ID NO. 1第1~2037位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。
[0012] 优选的，所述cDNA序列包括SEQ ID NO.1第1~2037位所示的核酸序列中1~90个 核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸。
[0013]第三方面，本发明涉及一种用于扩增所述SmCRYl基因的引物对，所述引物对的碱 基序列如SEQIDN0.3、SEQIDN0.4所示。
[0014]第四方面，本发明还涉及一种SmCRYl基因在植物组织中表达量的定量分析方法， 所述方法包括如下步骤：
[0015] S1、获得植物组织，提取其总RNA;
[0016] S2、以所述总RNA为模板，反转录获得CDNA;
[0017] S3、以cDNA第一条链为模板，分别用SmCRYl基因与内参基因 Actin(⑶984779.1)的 特异性引物扩增进行荧光定量分析，获得所述SmCRYl基因在植物组织中表达量；
[0018] 所述扩增SmCRYl基因的特异性引物的碱基序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID N0.6所 示;所述扩增内参基因 Actin(⑶984779.1)的碱基序列如SEQIDN0.7、SEQIDN0.8所示。
[0019] 第五方面，本发明还涉及一种SmCRYl基因在基因工程改良植物品质中的用途。
[0020] 优选的，所述基因工程改良植物品质指的是基因工程改良植物在弱光中生长不 良。
[0021 ]优选的，所述植物包括拟南芥、大豆、玉米或番茄。
[0022] 在本发明中，术语"SmCRYl基因编码序列"指SEQ ID NO. 1所示的第1~2037位核苷 酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 1所示的第1~2037位核苷酸中，有 一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的 简并性，所以与SEQ ID NO. 1所示的第1~2037位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列 也能编码出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0023]该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmCRYl相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1所 示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于）：通常为1~90个核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。
[0024]在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmCRYl基因产物的表达模式， 即分析茄子SmCRYl基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
[0025]此外，根据本发明的茄子SmCRYl核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或 表达蛋白质的同源性基础上，筛选茄子SmCRYl相关同源基因或同源蛋白。
[0026] 为了得到与茄子SmCRYl相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库，这些 探针是在低严谨条件下，用32P对茄子SmCRYl相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适 合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方 法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自 Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal ·。这种筛选方法可以识别与前子SmCRYl相关的基因 家族的核苷酸序列。
[0027]本发明的茄子SmCRYl相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组 法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其 是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所 制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR 扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0028]当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其 克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0029] 此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0030] 光信号能调控许多次生代谢途径，例如花青素的合成。茄子是广泛种植的蔬菜作 物，紫色茄子的果皮含有丰富的花青素。近年来的研究结果表明，紫色茄子的抗氧化保健作 用在常见蔬菜作物中是最好的。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0032] 1、本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状，克隆蓝光受体SmCRYl基因，为今后 利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有 很大的应用价值。
[0033] 2、本发明的茄子CRY1基因转拟南芥的转基因植株SmCRYl/cryl-104、拟南芥突变 株cry 1-104、拟南芥野生型WT-同置于蓝光下培养（30ymol/m2/sec)，结果显不：cryl-104 在蓝光下的下胚轴显著高于野生型WT，而转基因植株SmCRYl/cryl-104部分恢复了这一表 型。
【附图说明】
[0034]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0035] 图1为本发明的茄子CRY1蛋白与番茄CRY1蛋白的氨基酸序列同源比较(FASTA)结 果；
[0036] 图2为本发明的茄子CRY1基因在不同组织的表达情况；
[0037] 图3为转SmCRYl基因植株的RT-PCR检测；
[0038]图4为转SmCRYl基因对拟南芥突变株cryl-104的表型恢复情况。
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0040] 实施例1、茄子SmCRYl基因的克隆
[00411 1.植物材料的获得
[0042]本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。实验材料栽培于上海市 闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子 的叶片用于提取RNA。
[0043] 2.RNA 的提取
[0044] 采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司）。用甲 醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NAN0DR0P 1000 Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。
[0045] 3.基因的全长克隆
[0046] 基于Genbank中CRY1基因的保守序列设计一对简并引物。将提取RNA进行反转录 (Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit:宝生物工程（大连）有限公司），以第 一链cDNA为模板，利用引物
[0047] FI (SEQ ID ^.3):57 -ATGTCAGGTGGTGGWKGYAGYATAGTAT-37
[0048]