控制植物深根特征的基因Dro1及其应用的制作方法

专利名称：控制植物深根特征的基因Dro1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种控制植物根的形态的新基因，以及使用该基因控制植物根形态的方法。更具体地，本发明涉及一种与植物深根性有关的新基因，以及使用该基因控制植物深根性的方法。
背景技术：
目前，世界人口在持续增加，主要是在发展中国家，因此提高粮食生产以供养人口是至关重要的。然而，由于近年来气候变迁，例如全球变暖和沙漠化，很难使农田获得稳定的降雨。结果，由于降雨量减少导致的干旱在全球范围内给作物生产造成了严重的损害。特别是谷物，例如水稻、小麦和玉米，这些几乎完全靠雨水种植的作物，受干旱损害更加严重。因此，作物育种的一个重要目标是使作物具有抗旱性。
对于作物，根是一个关键的表型，与取决于水和养分的吸收等的产量、以及地上部植物体的抗倒伏性、和避旱性相关。水稻是一种单子叶植物，其根系具有大量的冠根(crown root),在种子根发育后从节间伸出。水稻根系统的分布由冠根长度和其生长方向决定(Shigenori Morita, Ne no Dezain (Root design)，107 页，2003 (非专利文献 I))。在这两者中，冠根生长的方向在根系分布中尤其重要。具体地讲，冠根的侧向生长会导致浅根性，而垂直生长会导致深根性。与浅根植物相比，深根植物有更多的根向土层更深处分布。因此，当植物暴露于干旱条件时，植物可以通过从更深的土层吸收水分而避免干旱。所以，深根性是一种重要的性状(Yoshida and Hasegawa, Drought resistance in cropswith emphasis on rice,第 97-114 页· 1982 (非专利文献 2) ; Shigenori Morita, Ne noHatsuikugaku (根发育研究)第132页，2000 (非专利文献3))。因此，可以预期，通过将浅根型作物深根化，可提高避旱性，从而赋予作物抗旱性。作物有三种抗旱类型逃旱型(drought escape)、避旱型(drought avoidance)和耐旱型(drought tolerance)。一般地，作物在幼穗形成期(panicle formation)和出穗期(ear emergence)之间最容易受干旱损伤。逃旱型可以通过使作物早熟化，从而使少雨期与从成穗到出穗的时期不重叠来实现。这是最常用的开发抗旱栽培种的方法。有多种分离的基因可以用于控制出穗的时间(W001/032881(专利文献I);日本专利申请Kokai Publication No. (JP-A) 2002-153283 (未经审查公开的日文专利申请)(专利文献 2) ; JP-A (Kokai) 2003-339382(专利文献 3) ; JP-A (Kokai) 2004-089036 (专利文献4) ; JP-A(Kokai) 2004-290190(专利文献 5) ; JP-A(Kokai) 2005-110579 (专利文献 6))。然而，出穗期对于每种栽培种而言是确定的，如果每年在栽培期间降雨的变化都是恒定的话，它是有效的。可是问题在于，如果气候变化导致成穗期和出穗期之间发生干旱，植物将受到干旱的影响。耐旱型是在暴露于干旱时，通过控制细胞渗透压等而耐受干旱的性质。耐旱型可以简单地通过不给植物浇水加以评估。因此，通过分子生物学实验已经分离了大量与耐旱型相关的基因(JP-A(Kokai) 2007-222129(专利文献7);综述见Tran et al. ,Methodsin Enzymology 428:109-28. 2007 (非专利文献4))。然而,在大田条件下筛选耐旱型则并不简单，因为难以控制环境条件，例如土壤的水分含量。因此，耐旱型栽培种的育种较为滞后。而且，尽管耐旱型具有耐旱的能力，但是当干旱条件延长时，因为植物不能从土壤中吸收水分和营养，植物生长会受到抑制并且最终会被杀死。当最终的产品是谷粒时，重要的是使谷物产量最大化而不是使植物不死，因此这在粮食生产中成为了一个问题。避旱型的特征是通过避免干旱胁迫而获得抗旱性。上述的深根就是这样一种特征。在大田中，干旱一般从地表向深层土壤逐渐发展。在通常的农田中，深层土壤含有水分。因此，深根植物在干旱条件下可以通过利用深层土壤的水分而避免损伤。在日本，在旱稻栽培中已经开发出了具有深根的栽培种，从而避免由于雨季结束后由少雨/日晒导致的干旱的损伤。深根栽培种“ Yumenohatamochi ”已经作为一种高度抗旱的旱稻品种被开发出来,其具有优良的风味(Hideo Hirasawa et al. , Breeding Science 48:415-419. 1998 (非专利文献 5))。然而，旨在提闻深根的基因分尚尚未见报道。趋向性是控制根生长方向的重要因素，通过分子生物学技术使用突变体等已经分离了多种与趋向性有关的基因。趋向性是指根响应外界环境刺激弯曲延伸生长。趋向性包括向地性、向光性、向水性、向触性、向电性、向磁性和向化性。已经鉴定的拟南芥基因包括多种向地性基因(综述见 Morita and Tasaka Current Opinion in Plant Biology7(6) :712-718. 2004(非专利文献 6))，以及向水性基因 MIZl (Kobayashi et al. , Proc.·Natl. Acad. Sci. USA 104 (11): 4724-4729. 2007 (非专利文献 8))和 MIZ2 (Miyazawa etal. ,Plant Physiologyl49 (2) :835-840. 2009(非专利文献 9))。关于稻类植物，只有少量报道公开了与根的趋向性相关的基因。向光性基因CPTl(Haga et al.，Plant Cell17(1) :103-115. 2005(非专利文献 7))和冠根形成基因 Crlldnukai et al. , PlantCelll7 (5) :1387-1396. 2005 (非专利文献10))已经被报道与向地性相关。许多基因用失功能突变体或类似的方法分离。尚没有通过改变这些基因可赋予作物深根性质的报道。已经有旨在避旱的关于玉米和稻类植物深根的遗传学研究报道。关于玉米，Tuberosa等和Trachsel等发现了与根长有关的数量性状座位(QTL) (Tuberosaet al. , Plant Molecular Biology 48:697-712. 2002 (非专利文献 11) ; Trachsel etal. , Theoretical and Applied Genetics D0I10. 1007/s00122-009-1144-9. 2009(非专利文献12))。在水稻栽培种之间，在深根性、根长或根粗度等性状上存在广泛的自发突变(Uga Trachsel et al. , Breeding Science 59:87-93. 2009 (非专利文献 13))。通过使用分子标记的遗传分析，已经鉴定了与栽培种之间观察到的根形态突变有关的多种数量性状座位(QTL)(综述见 Price et al. , Journal of Experimental Botany53:989-1004. 2002(非专利文献14))。深根由两个性质决定根长度和根生长方向(角度)。大多数涉及深根的QTL的报道与根的长度有关(综述见Price et al.，Journal ofExperimental Botany 53:989-1004· 2002 (非专利文献 14) ；Courtois et al. , Euphytica134:335-345. 2003 (非专利文献 15) ; Zheng et al. , Theoretical and Applied Genetics107:1505-1515. 2003 (非专利文献 16) ; Li et al. , Theoretical and Applied Genetics110:1244-1252. 2005 (非专利文献17))。只有一个玉米中的QTL被报道涉及根生长的角度；然而，它只是简单地通过统计学程序进行了预测，基因尚没有被鉴定/分离(Omori F. andMano Y. Plant Root 1:57-65. 2007 (非专利文献18))。如上所述，尚没有关于基于自发突变成功地为根相关QTL鉴定/分离出基因的报道。一个似乎合理的解释是，与地上部分的性状不同，根系形态的表型难以精确而可重复地评估。而且，另一个问题是，大田条件下的实验研究需要付出高强度的努力(Yadav et al. , Theoretical and Applied Genetics95:619-632. 1997 (非专利文献 19))。用于评估植物深根的已知方法包括堑壕法(trench method)、土柱法(monolithmethod)和抽芯取样法(core sampling method)。这些方法适合于在大田中评估深根(Nemoto et al. , Breeding Science 48:321-324. 1998 (非专利文献 20) ; MasakataHirayama et al. , Nihon Sakumotsu Gakkai Kiji(Japanese Journal of CropScience) 76:245-252. 2007(非专利文献21))。堑壕法是一种测定每个深度处的根的粗度和数量的方法，在栽培植物后，从田地移除土壤。然而，堑壕法需要大量的劳力用于除去土壤，因此不适合评估大量的植物。在土柱法中，将两个铁框架插入栽培植物脚下的土壤内。挖取由此形成的方土柱(例如30cm宽x5cm厚x30cm深)，在每个深度处切出土壤块来评估根的长度和数量。在抽芯取样法中，将直径5-8cm、长度30-50cm的金属圆柱管插入到植物脚下或植物之间的土壤内；通过冲洗所得的土壤样品暴露出根，然后评估根的长度和数量。 这两种方法的采样均比堑壕法更简单，然而，由于插入部位不同而存在采样误差，这些方法不能精确地评估土壤中根的条件。作为在人工环境下(例如在温室中)评估大量植物的方法，已经开发出了一种用于评估在干旱胁迫条件下的深根性的方法，其中将植物种植并栽培在充满培养基的圆柱形培养容器内(直径5-10cm) (W0 2006/123392(专利文献8))。这种方法显示，当植物暴露于通过在栽培期间逐步降低水量造成的干旱胁迫时，深根性的栽培种与浅根性的栽培种相比，叶子衰老的程度较小。从上述结果可以看出，这种方法不是直接评估深根性，而是根据地上部分的衰老来评估深根性。这种方法的一个优点是评估简单，评估深根性时不需要洗去根上的土壤的步骤。然而，当栽培种的根系较长并且水平伸展时，栽培种会被错误地评估为具有深根性，因为它们的根会在到达圆柱边缘后会沿着圆锥体向下延伸。因此，尽管这种方法可以用于评估根的长度，这是构成深根性的一个特征，但是难以使用这种方法评估根生长的方向。还开发出了用于评估小麦的提篮法(basket method) (Oyanagi et al. , NihonSakumotsu Gakkai Kiji (Japanese Journal of Crop Science)62:565-570. 1993(非专利文献22))，作为一种仅评估根生长方向的简单定量方法。而且，先前有描述使用提篮法评估稻类植物的深根性的报道(Kato et al. ,Plant Soil 287:117-129. 2006 (非专利文献23))。在这种方法中，将网格状篮(mesh basket)用土填满并置于大田或花盆中。经过一段时期的栽培，通过测量延伸通过提篮的根相对于地表的生长角度评估深根性。这种方法能够简单地评估生长角度；然而当出于基因分离的目的要一次评估大量的样品时，它需要更多的空间和大量的水分控制。在上述环境下，用天然变异体分离与深根性相关的基因，并阐明这些基因的避旱效果，对于有效地开发具有更高避旱能力的栽培种是至关重要的。Drol (Deeper Rooting I)是一个与深根性相关的QTL,通过用籼型杂交水稻栽培种IR64作为轮回亲本回交热带粳稻旱稻栽培种Kinandang Patong,对其产生的后代株系(BC2F2)进行QTL分析，统计学预测它位于染色体9的长臂上(Uga et al.，The 2ndInternational Conference on Plant Molecular Breeding. 2007 (非专利文献 24) ; Ugaet al. , Nihon Ikusyu Gakkai Dai 112 Kai Kouenkai Youshisyu(112nd Meeting ofThe Japanese Society of Breeding, Program and Abstracts) PP. 188，2007 (非专利文献25);Uga et al. , Dai 27Kai Ne Kenkyu Syukai (27th Research Meeting of The JapaneseSociety for Root Research)，2007 (非专利文献 26) ; Uga et al. The 5th InternationalCrop Science Congress Abstracts 243p. 2008 (非专利文献))。IR64 是一个难以通过农杆菌转化方法导入基因的栽培种。目前，农杆菌转化方法被普遍用于稻类植物(日本专利No. 2649287(专利文献9))，其中使用去分化的培养组织(例如愈伤组织)作为植物样品。然而对于IR64，使用愈伤组织的方法仅能够获得非常低的转化效率。因此，还没有建立起用于IR64的基于愈伤组织的农杆菌转化方法(Hiei and Komarij Nature Protocols3:824-834. 2008(非专利文献28))。Hiei和Komari报道了一种方法，使用不成熟的胚代替愈伤组织作为植物样品，从而实现IR64的转化。然而，因为不成熟胚方法需要花期后的不成熟胚，因此必须一直在稻田或者温室中准备植物，以便在需要时可以立即获得不成熟的胚。例如，可以每两周播种一次，以便总是可以获得不成熟的胚；因此，必须有广阔的栽培面积和大量的劳动力用于维持植物。所以，建立基于愈伤组织的将基因转入IR64的农杆菌转化方法对于实现分子育种的实际使用是非常重要的。 先前技术文献专利文献[专利文献 1]W0 01/032881 (Plant photosensitive gene Hdl and use thereof)[专利文献 2] JP-A(Kokai) 2002-153283 (Plant anthesis-inducing gene Hd3aand use thereof)[专利文献 3] JP-A(Kokai) 2003-339382 (Plant anthesis-enhancing gene Ehdland use thereof)[专利文献 4] JP-A(Kokai) 2004-089036 (Plant anthesis-enhancing gene RFTland methods for predicting the time of bloom)[专利文献 5]JP-A(Kokai)2004-290190(Plant anthesis-controlling geneLhd4 and use thereof)[专利文献 6] JP-A(Kokai) 2005-110579 (Plant photosensitive gene Hd5anduse thereof)[专利文献 7]JP-A(Kokai)2007-222129(Methods for producing plantsresistant to environmental stress)[专利文献 8]W0 2006/123392 (Methods for assessing deep rooting ofplants)[专利文献 9] Japanese Patent No. 2649287[非专利文献][非专利文献 IjMorita S·，(2003) Ne no Dezain (Rootdesign)，pp. 107，Yokendo.[非专利文献 2] Yoshida S. and Hasegawa S. 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发明内容
本发明待解决的问题本发明是通过考虑上述情形实现的。本发明的一个目的是提供用于改变植物根形态，以通过提高避旱能力赋予植物抗旱性的方法。更具体地，本发明的一个目的是提供一种与植物深根性有关的新型基因，具有深根性性状的转化植物，用于产生这种植物的方法，和用于评估植物是否具有深根性性状的方法。解决问题的手段Drol的候选区域位于插入-缺失(InDel)标记ID0714和ID0717之间1，443kbp的染色体区域内(根据Nipponbare中的核苷酸序列)。根据RAP-DB预测，这个区域含有166个基因。尚未证明这些基因中包括任何先前报道与水稻和其它植物的深根性有关的基因或其同源物。因此，根据假定基因的功能来预测候选基因是不可能的。而且，因为两个栽培种IR64和Kinandang Patong的核苷酸序列尚未确定，因此也难以根据这些基因的核苷酸序列差异来预测基因。在上述情况下，本发明人尝试了鉴定和分离Drol基因。首先，本发明人使用大约4，500株植物的大规模分离群体，对在浅根水稻栽培种IR64和深根水稻栽培种Kinandang Patong的杂交植物中检测到的决定深根性的座位(Drol座位)进行高分辨率连锁分析。，为了能够一次测试数百株植物的深根率(穿出提篮底部区域的根数相对于穿出提篮的总根数的百分比)，对传统的提篮方法进行了改进。使得可以一次检查500株植物。然而，由于不可能一次检测比上数更大数目的植物。从一组从大规模群体中选出的杂交系中选出了数个株系，使用每个株系40株植物的表型/基因型数据逐步缩小候选区域。将候选区域从1，443kbp缩小到大约IOOkbp之后,发明人构建了 IR64和Kinandang Patong的细菌人工染色体(BAC)文库，并筛选了含有100-kbp候选区域的BAC0为了考虑是否有可能通过核苷酸序列比较缩小候选基因范围，对两 个栽培种的RAP-DB预测的基因的核苷酸序列进行了比较。然而，许多基因在其外显子核苷酸序列中都具有突变，因此不可能缩小候选基因。然后，本发明人总共进行了 5次连锁分析，同时根据候选区域核苷酸序列的突变产生了 DNA标记。结果，Drol基因区域被缩小到一个6. Okbp的区域，其位于插入-缺失(InDel)标记 Drol_INDEL09 (引物 5’-GCAGACGCTCGTAACACGTA-3’ (SEQID NO:4)和引物 5’ -GTGGCAGCTCCATCAACTCT-3’ (SEQ ID NO: 5))和酶切扩增多态性序列(CAPS)标记 Drol-CAPS05(引物 5’-GCACAAGATGGGAGGAGAGT-3’ (SEQ ID NO:6)和引物5’-CATGGGTGAGAATCGTGTTG-3’ (SEQ ID NO: 7)扩增的 DNA 用限制酶 Hinf I 进行处理)之间。该区域仅含有一个在RAP-DB中预测的假定基因。这个假定基因被推定编码一种功能未知的蛋白质。因为非常难以转化IR64，所以在用转化方法进行互补试验之前，对预测基因是否与深根性真实相关进行了评估。首先，评估该基因是否具有与深根相关的功能，该功能预测是根据假定基因的氨基酸序列在如下的几个网址进行功能搜索“SALAD数据库”基因组范围比较植物蛋白序列的数据库(salad, dna. affrc.go.jp/salad/)“Pfam” :蛋白结构域数据库(pfam. janeIia. org/)“PSORT” 预测蛋白疏水性和定位的网址(www.psort.org/)“InterPro”蛋白家族、结构域、功能位点数据库(www.ebi.ac.uk/interpro/)然而，使用任何这些网址都不能发现一个保守的结构域。然后，对基因进行检查，以显示它的外显子在IR64和Kinandang Patong之间是否有核苷酸序列变异。结果显示，IR64在外显子4具有一个Ib缺失,而Kinandang Patong在相同位置具有一个腺嘌呤。这个Ib缺失造成移框，产生一个提前终止密码子。本发明人怀疑该缺失降低了 IR64中候选基因的表达水平。因此，用萌发6天和12天时IR64和Kinandang Patong的叶片、叶鞘上部、叶鞘基部和冠根对表达水平进行评估。从这三种类型组织中提取总RNA，通过实时PCR确定基因表达水平。结果显示，在这两个栽培种中，基因在叶鞘的基部表达，而在冠根和叶片/叶鞘的上部则几乎不表达。比较IR64和Kinandang Patong之间的表达水平。样品显示，在第6和12天，两个栽培种之间的差异均仅小于2倍。该预测的基因是否是真实的Drol基因不能够通过表达水平上的结果来判断。然而，该基因仍然是一个候选基因，因为叶鞘基部包含冠根原基，这是冠根的雏形，或者因为该基因的功能在氨基酸水平上在这两个栽培种之间潜在地不同。接着，根据深根率和外显子4中Ib缺失之间的相关性评估该基因是否与深根性有关。对64个栽培种进行分析，包括IR64和Kinandang Patong, 22个由国家水稻研究所(Los Banos, Philippines; IR64也是由这个研究所开发的品种)开发的IR栽培系,和20个野生型品系(7 个 Oryza nivara 品系，12 个 O. rufipogon 品系，和 I 个 O. meridionalis 品系)，考察其在Ib缺失位点周围的核苷酸序列。核苷酸序列比较显示，仅IR64中在外显子4含有这个Ib缺失。因此，无法根据Ib缺失与深根率之间的相关性来判断该预测的基因是否是真实的Drol基因。对包括Kinandang Patong在内的14个粳稻品种的Drol互补DNA(cDNA)的核苷酸序列进行完全分析。核苷酸序列在所有这些品种之间均相同。同时，通过提篮法确定的深根率变化很大，从最低的Tupa729的15. 9%到最高的Kinandang Patong的83. 1%。这可能可以用存在其它负责深根的QTL加以解释，或者启动子区核苷酸序列的一些差异可能影响基因表达的调节。因此，在Kinandang Patong和Nipponbare之间对上游大约2. 2kb的核苷酸序列(到候选区域的5’上游末端为止)进行了比较。在两个位点发现了突变。一个位于5’ -非翻译区1，250bp上游；该位置的核苷酸在Nipponbare的核苷酸序列中是胸腺嘧啶，而在Kinandang Patong中被鸟嘌呤代替。在PLACE (植物顺式作用调节DNA元件数据库.'训ι dna. affrc. go. jp/PLACE/)上对该突变相邻的序列进行了分析，这是一个用于搜索启动子区的顺式元件的网址。该分析显示，在称作“GATA box”的模体中，胸腺嘧啶被鸟嘌呤代替。另一个突变是Kinandang Patong在5’非翻译区的上游1，189bp-l, 218bp缺失30bp。这些核苷酸序列的突变是造成栽培种之间深根突变的潜在原因。
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6. Ο-kbp区域中的预测Nipponbare基因的全长cDNA已经被提交，登录号为AK068870。因此，在 FOX 搜寻系统(FOX hunting system)(全长 cDNAOver-eXpressing 基因搜寻系统)中搜索Nipponbare基因。结果，搜索显示了 2个Tl代株系和2个T2代株系。然后，每个株系用5株植物确定这四个株系的深根率。多个植物被证明与作为对照的Nipponbare (野生型)相比具有显著更高的深根率。这个结果增加了被预测基因是真实的Drol基因的可能性。为了确认预测基因绝对是真实的Drol基因，本发明人通过将携带预测的基因(Kinandang Patong型Drol基因)的载体导入到IR64愈伤组织中产生了转化体。该转化效率是便于转化的栽培种例如Nipponbare的1/10或者更低。因此，本发明人在制备了超过10倍的用于转化的愈伤组织之后，进行了基因转移。对所得植物转化体的深根率进行了评估。用预测基因转化的植物被证明具有更高的深根率。上述的这两个实验显示，6. Okbp候选区域中的预测基因是真实的Drol。因此，本发明人第一次成功地鉴定并分离出深根基因Drol。进一步,本发明人使用IR64和近等基因系(Drol-NIL)评估由于Drol造成的深根是否与抗旱性提高相关，其中该近等基因系具有和IR64相同的遗传背景，只是Drol的相邻区域被Kinandang Patong的区域所代替。结果证明,Drol-NIL由于深根化而变得抗旱,在产量上与IR64相比有显著增加。根据上述发现，本发明提供了 [I],下面(a)-(e)中任一项的 DNA :(a)包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列的DNA ；(b)包含SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的编码区的DNA ；(c)编码包含SEQ ID NO:3，13和15中的任一氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(d)在严格条件下与包含SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA杂交，并且具有赋予植物深根性表型的活性的DNA ;或者
(e)编码包含与SEQ ID NO:3, 13和15中的任一氨基酸序列相比有一个或多个氨基酸替换、删除、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，并且具有赋予植物深根性表型的活性的DNA。[2], [I]的DNA，其中所述植物是单子叶植物。[3], [2]的DNA，其中所述单子叶植物是禾本科植物。[4], [3]的DNA，其中所述禾本科植物选自下组稻、麦类(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龙山稷、珍珠粟、埃塞俄比亚画眉草、甘蔗、猫尾草、草地早熟禾、鸭茅、意大利黑麦草、多年生黑麦草、苇状羊茅和百喜草。[5], [3]的DNA，其中所述禾本科植物选自下组水稻、高粱和玉米。[6], 一种载体，包含[1]-[5]中任一项的DNA。
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[8], 一种用[1]_[5]中任一项的DNA转化的植物，其具有深根性表型。[9], 一种通过将[1]_[5]中任一项的DNA或[6]的载体导入植物细胞内而产生的转化植物，其具有深根性表型。[10]. —种转化植物，其是通过如下的步骤(a)-(d)获得的(a)将[1]-[5]中任一项的DNA或6的载体导入植物细胞中；(b)确定步骤(a)中的植物细胞内的[1]_[5]中任一项的DNA的拷贝数；(c)选择含有单拷贝的被导入的DNA或载体的转化植物细胞；和(d)从步骤(C)中选择的转化植物细胞再生植物， 并且其具有深根性表型。[11], 8-[10]中任一项的植物，其中所述植物是单子叶植物。[12]. [11]的植物，其中所述单子叶植物是禾本科植物。[13]. [12]的植物，其中所述禾本科植物选自下组水稻、麦类(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龙山稷、珍珠粟、埃塞俄比亚画眉草、甘蔗、猫尾草、草地早熟禾、鸭茅、意大利黑麦草、多年生黑麦草、苇状羊茅和百喜草。[14]. [12]的植物，其中所述禾本科植物选自下组水稻、高粱和玉米。[15]. —种转化植物，其是[8]_[14]中任一项的转化植物的后代或克隆。[16].从[8]_[15]中任一项的转化植物分离的细胞。[17]· [8]-[15]中任一项的转化植物的繁殖材料。[18].从[8]_[15]中任一项的转化植物分离的器官。[19].从[16]的细胞、[17]的繁殖材料和[18]的器官中的至少一个制备的加工食品。[20]. —种用于产生[8]和[11]_[13]中任一项的转化植物的方法，其包括下述步骤将[1]-[5]中任一项的DNA或[6]的载体导入植物细胞，以及从该植物细胞再生植物。[21]. [20]的方法，其进一步包括选择具有单拷贝的[1]_[5]中任一项的DNA的转化植物细胞或转化植物的步骤。[22]. —种用于评估植物是否具有深根性表型的方法，其中当分子量或核苷酸序列相同时则判定测试植物具有深根性表型，该方法包括下面的步骤(a)-(c)
(a)从测试植物制备DNA样品；(b)从该DNA样品扩增包含[1]-[5]中任一项的DNA的区域；和(c)将扩增的DNA片段的分子量或核苷酸序列与[1]_[5]中任一项的DNA进行比较。[23]. —种用于评估植物是否具有深根性表型的方法，其中当获得了扩增产物时则判定测试植物具有深根性表型，该方法包括使用包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID N0:9的核苷酸序列的引物并使用从该测试植物制备的基因组DNA作为模板进行PCR的步骤。[24]. —种用于评估植物是否具有深根性表型的方法，其中当获得了扩增产物时则判断测试植物不具有深根性表型，该方法包括使用包含SEQ ID N0:10的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的引物并使用从该测试植物制备的基因组DNA作为 模板进行PCR的步骤。[25]. —种用于选择具有深根性表型的植物的方法，其包括如下的步骤(a)和
(b)(a)通过将任意植物与具有深根性表型的植物进行杂交产生栽培种；和(b)通过[22]_[24]中任一项的方法评估步骤(a)中获得的植物是否具有深根性表型。[26]· —种蛋白质，其由[1]-[5]中任一项的DNA编码。[27]. —种抗体，其结合[26]的蛋白质。[28]· —种DNA，其包含至少15个与[1]-[5]中任一项的DNA或其互补序列互补的连续核苷酸。[29]· —种DNA，其包含SEQ ID NO:4-11中任一项的核苷酸序列。发明效果本发明提供了控制植物例如稻的深根性的Drol基因，和用该基因转化的植物。本发明的基因可用于操作植物根系形态，从浅根性向深根性改变，或者从深根性向浅根性改变。具体地，通过例如操纵Drol基因将浅根性植物变成深根性植物从而提高避旱能力可以赋予抗旱性。干旱导致世界粮食产量严重减产。主要的海外企业已经集中于开发抗旱作物。另一方面，通过操纵Drol基因将深根性植物变成浅根性植物可以赋予耐湿性。在日本，农业政策改变，推荐在休耕水稻田进行旱栽培。然而，因为稻田的排水效力差，对于没有耐湿性的大豆和玉米而言湿害成为了问题。因此，为了提高耐湿性，对作物的浅根化也进行了研究。在这些国际和国内环境下，通过使用控制植物根形态的基因开发抗旱或抗湿害的作物品种是非常重要的。附图简述图I的图片显示了使用改良提篮法对每个谱系的深根性进行的评估。不锈钢提篮上安置有环。这个环被布置在如下的位置，使得当根相对于地表以50度角或者更深的角度延伸时，判定该根是深根。在每个图例中，第一和第二个缩写分别是指谱系名称和代数。图2的曲线图显示了在导入了携带有Drol的载体或单独的载体的TO代IR64转化体中深根率的分布。图3的曲线图显示了在导入了携带有Drol的载体或单独的载体的Tl代IR64转化体中，深根率与对应于转化载体的拷贝数的信号强度(实时PCR)之间的关系。单拷贝是指在TO代被导入只有单一拷贝的Drol的谱系，而多拷贝是指在TO代被导入多个Drol拷贝的谱系。单拷贝谱系在Tl代中分离成缺失型(O拷贝)、杂合型(I个拷贝)和纯合型(2个拷贝)，并且根据拷贝数将信号强度分成3种类型。然而，与Southern分析不同，实时PCR由于其原理即使植物间的拷贝数相同也不一定总是给出相同的信号强度。每个曲线图中的缩写表示各个克隆的谱系编号。图4的曲线图显示了深根率在Fox谱系和Nipponbare中的分布。图5的图形显示了高粱和玉米直系同源物的分析结果。Drol,水稻(KinandangPatong) ;SbDrolLl,Drol在高粱中的直系同源物；ZmDrolLl,Drol在玉米中的直系同源物。图6的照片显示了大田中Drol-NIL的深根与IR64和Kinandang Patong的深根的比较结果。白色数字显示了地表以下的土壤深度。白色虚线指示根系分布区域的轮廓。
图7的曲线图显示了在抗旱试验中试验田里土壤水势的时间进程。“经灌溉的”和“干旱的”分别指示灌溉区域和干旱胁迫区域。圆括号中显示了监视水势的土壤深度。在干旱胁迫区域中，在25cm 土壤深度下，播种大约70天后，观察到土壤干燥的快速进展。图8的照片显示了在干旱胁迫条件下IR64和Drol-NIL的抗卷叶性的时间依赖性差异。植物照片从正上方拍摄。图片顶部显示的天数是在干旱胁迫区域中终止灌溉之后胁迫处理的天数。图9的曲线图和图片显示了 IR64和Drol-NIL在干旱胁迫条件下叶片温度、气孔导度和光合速率的差异。A显示了水稻植物在终止灌溉35天后的视图。右起第一和第二列是IR64 ;第三和第四列是Drol-NIL。B显示了终止灌溉35天后水稻植物的温度分布的图像(从图A所述的相同植物获取的红外热成像图像)。右起第一和第二列是IR64 ;第三和第四列是Drol-NIL。颜色差异提示如下颜色越暖，温度越高；颜色越冷，温度越低。该图片提示IR64和Drol-NIL的叶片温度之间存在差异(Drol-NIL的叶片温度平均比IR64低O. 7° C)。冷色在Drol-NIL中的分布更加广泛，提示Drol-NIL的叶片温度低于IR64。C显示了在干旱胁迫区域中终止灌溉之后Drol-NIL的叶片温度变化。数值是相对于IR64的叶片温度，是用Drol-NIL的平均叶片温度减去IR64的平均叶片温度而确定的。可以发现，DioI-NIL的叶片温度在每个测量日期均低于IR64。D显示了在干旱胁迫区域中终止灌溉之后IR64和Drol-NIL之间气孔导度的差异。*表示Drol-NIL的气孔导度以5%的水平显著大于IR64。E显示了在干旱胁迫区域中终止灌溉之后IR64和Drol-NIL之间光合速率的差异。*表示Drol-NIL的光合速率以5%的水平显著大于IR64。

图10的示意图和照片显示了在干旱胁迫条件下栽培的IR64和Drol-NIL的产量确定结果。A显示了在干旱胁迫区域中种植收获的IR64和Drol-NIL之间的各种表型差异。纵向的棒表示标准偏差。*、**、或***表示Drol-NIL分别以5%，1%,或O. 1%水平显著大于IR64。B的照片显示了在干旱胁迫区域收获的IR64和Drol-NIL的平均穗。图11的图片显示了用于测试抗旱的实验田解剖后的侧面，可见干旱胁迫区域内IR64和Drol-NIL之间根系分布的差异。每个谱系的上图显示了试验田的剖视图，下图显示了冲洗掉额外的表层土之后获得放大图片，用于观察根是否穿过砂砾层(gravelstratum)。箭头指示穿过了砂碌层的Drol-NIL的根。图中显示,在IR64中，没有根穿过砂砾层到达更深层，但是在Drol-NIL中，有很多根穿过砂砾层并到达更深层。
图12的曲线图显示了大田土壤中水势的时间进程。图13的照片显示了在施肥或未施肥田地中播种120天后植物的外观。上图显示了包括各个区域的整体图。下图是从上获得的各个区域的放大图。在IR64中，在施肥和未施肥区域中均观察到了卷叶。同时，Drol-NIL则没有显示卷叶。图14的照片显示了用于评估Drol基因缺失的PCR标记。在每个退火温度下，左右泳道分别显示了 IR64和Kinandang Patong的结果。实施本发明的模式 本发明提供了下面(a)-(e)中任一个的DNA :(a)包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列的DNA ；(b)包含SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的编码区的DNA ；(c)编码包含SEQ ID NO:3，13和15中的任一氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(d)在严格条件下与包含SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA杂交，并且具有赋予植物深根性表型的活性的DNA ;或者(e)编码如下蛋白质，并且具有赋予植物深根性表型的活性的DNA，所述蛋白质包含与SEQ ID N0:3，13和15中任一个的氨基酸序列相比有一个或多个氨基酸替换、删除、添加和/或插入的氨基酸序列。在下文中，上述DNA也偶尔地称作“本发明的DNA”或“Drol基因”。同时，由本发明DNA编码的蛋白质有时被称作“本发明的蛋白质”或“Drol蛋白”。这里，“包含”既指“包括”也指“由…组成”。同时，上面(e)的DNA也可以称为(e)编码如下蛋白质，并且能够赋予植物深根性性状的DNA，所述蛋白质在SEQ IDNO:3, 13和15中任一个的氨基酸中具有至少一个突变，所述突变选自一个或多个氨基酸替换、删除、添加和/或插入。而且，本发明的DNA可以称作“分离的DNA”。水稻栽培种Kinandang Patong的Drol基因的基因组DNA核苷酸序列在SEQ IDNO: I中显示；cDNA的核苷酸序列在SEQ ID NO: 2中显示；由该核苷酸序列编码区编码的蛋白的氨基酸序列(Drol蛋白)在SEQ ID NO:3中显示。SEQ ID NO: I核苷酸序列中的蛋白编码区由264_2，685位核苷酸组成。同时，SEQ ID N0:2核苷酸序列的蛋白编码区由264-1019位核苷酸组成。而且，SEQ ID NO: 17显示了 Kinandang Patong的Drol基因和其上游的包括启动子区的核苷酸序列。与Nipponbare中对应的区域的序列(SEQ IDNO: 18)比较，KinandangPatong的序列(SEQ ID NO: 17)在Drol基因上游大约I. 2kb处有一个单核苷酸替换和一个30个核苷酸的缺失。具体地，Nipponbare中“GATA”基序的“T”(SEQ ID NO: 18核苷酸序列第6位的核苷酸)在Kinandang Patong中被“G”替换(SEQ ID NO: 17核苷酸序列第6位的核苷酸)。此外，SEQ ID NO: 18中第7-36位的30个核苷酸在Kinandang Patong的相应区域中缺失。SEQ ID NO: 12显示了高粱来源中的Drol基因的编码序列(OTS)的核苷酸序列，同时SEQ ID NO: 13显示了由该核苷酸序列编码区编码的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 12的核苷酸序列的蛋白编码区(⑶S序列)由第1-789位核苷酸组成。
SEQ ID NO: 14显示了玉米来源的Drol基因中的CDS的核苷酸序列，同时，SEQ IDNO: 15显示了由该核苷酸序列编码区编码的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 14的核苷酸序列的蛋白编码区(⑶S序列)由第1_768位核苷酸组成。本发明的Drol基因具有赋予植物深根性性状的活性。这里“深根性性状”是指作为植物地下器官的根相对于地表以一个深角度在土壤中延伸的性质。这里，“深角度”的意思是根相对于地表的角度至少为50°，优选地60°，更优选地70°，再更优选地80°或者更大。DNA是否具有赋予植物深根性性状的活性可以通过制备用Drol基因转化的植物并确定该植物相对于地表的角度加以确认。植物相对于地表的角度可以通过多种方法加以评估，例如提篮法和本文实施例中介绍的改良提篮法，以及堑壕法、土柱法和抽芯取样法；然而这些方法并不仅限于此。 编码本发明Drol蛋白的DNA包括基因组DNA、cDNA和化学合成的DNA。这些基因组DNA和cDNA可以通过本领域技术人员已知的常规方法加以制备。基因组DNA可以例如如下制备。从具有深根性的水稻栽培种(例如Kinandang Patong)、高粱或玉米提取基因组DNA制备基因组文库(可以使用载体如质粒、噬菌体、粘粒，BAC和Pl人工染色体(PAC)，但不限于此)；扩增文库，并通过使用从编码Drol蛋白的DNA(例如具有SEQ ID NO: I, 2, 12, 14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA)制备的探针进行菌落或噬菌斑杂交进行文库筛选。作为另一选择，这些基因组DNA的制备可以通过使用制备成特异针对编码Drol蛋白的DNA(例如包括SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA)的引物进行PCR来实现。同时，cDNA可以例如如下制备。使用从具有深根性的水稻栽培种(例如KinandangPatong)植物提取的mRNA合成cDNA，并插入到载体(例如λ ZAP)内以构建cDNA文库；然后扩增文库，并通过菌落或噬菌斑杂交进行文库筛选。作为另一选择，cDNA可以用如上所述的相同方式通过PCR加以制备。另一方面，可以制备化学合成的DNA，例如通过使用市场上可以获得的寡核苷酸合成仪来制备。作为另一选择，编码本发明Drol蛋白的DNA可以通过从具有深根性的高粱(例如叶片和叶鞘)或玉米(例如叶片和叶鞘)提取基因组DNA或mRNA加以制备。0025本发明包括编码在功能上与SEQ ID NO:3，13和15中任一个的Drol蛋白等价的蛋白的DNA。这里，“功能上与Drol蛋白等价”的意思是感兴趣的蛋白具有赋予植物深根性性状的功能。优选的DNA是单子叶植物来源的DNA，更优选地是来源于禾本科(Gramineae)、百合科(Liliaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、掠桐科(Palmae)、天南星科(Araceae)、姜科(Zingiberaceae)和兰科(Orchidaceae)的DNA,更优选地是来自水稻、麦类(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏该(Job’ s tears)(薏米))、玉米、黍(millet)、粟(foxtail millet)、稗(Japanese millet)、高梁(sorghum)、龙山稷(finger millet)、珍珠粟(pearl millet)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、甘鹿、猫尾草(timothy)、草地早熟禾(Kentucky bluegrass)、鸭茅(orchardgrass)、意大利黑麦草(Italian ryegrass)、多年生黑麦草(perennial ryegrass)、華状羊茅(tall fescue)和百喜草(Bahia grass)的 DNA,特别优选地是水稻、高粱和玉米来源的DNA。这些DNA包括例如编码如下蛋白质的突变体、衍生物、等位基因、变异体和同源体该蛋白质具有赋予植物深根性性状的功能，并且在氨基酸序列上与SEQ ID NO:3，13和15中任一个的氨基酸序列相比具有一个或多个(例如2，3，4，5，10，20，30，40，50，或100个
残基)氨基酸替换、删除、添加和/或插入。本领域众所周知的用于制备编码具有被改变氨基酸序列的蛋白质的DNA的方法包括定点突变法(Kramer, ff. and Fritz, H. -J. (1987) Oligonucleotide-directedconstruct ion of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods inEnzymology, 154:350-367)。在自然界中，核苷酸序列突变也会导致其所编码的蛋白质的氨基酸序列突变。如上所述，编码与自然发生Drol蛋白的氨基酸序列相比在氨基酸序列上有一个或多个氨基酸替换、删除或添加的蛋白质的DNA包含在本发明的DNA之内，只要它们编码的蛋白质具有与天然存在的Drol蛋白(SEQ ID NO:3, 13和15中任一个的氨基酸序列)等价的功能即可。这些DNA包括例如包含SEQ ID NO: 16的核苷酸 序列的DNA。包含SEQ IDNO: 16的核苷酸序列的DNA与包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的DNA相比，在核苷酸序列上在每个5’和3’端具有一个Ι-bp添加。DNA还在自5’端起373位bp处(在SEQ ID NO: 2为自5’端起372位bp处)具有一个G代替A的替换。因为该核苷酸替换，由这种包含SEQID NO: 16核苷酸序列的DNA编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列相比，在第37位处具有一个由谷氨酸取代赖氨酸的非同义氨基酸替换。本发明还提供了这样的蛋白质，其包含SEQ ID N0:3的氨基酸序列的第37位的赖氨酸被谷氨酸代替的氨基酸序列。本发明还提供了编码这种蛋白质的DNA(例如包括SEQ ID NO: 16的核苷酸序列的DNA)。即使核苷酸序列具有突变，在某些情况下，该突变也不会对蛋白的氨基酸序列造成任何突变(突变简并性)(mutation degeneracy)。这种突变体(简并突变体)也包含本发明的DNA之内。本领域技术人员众所周知的其它用于制备编码与SEQ ID N0:3，13和15中任一个的Drol蛋白在功能上等价的蛋白质的DNA的方法包括使用杂交技术(Southern, E.Μ. (1975) Journal of Molecular Biology, 98，503)或PCR技术(Saiki, R. K. et al. , (1985)Science, 230，1350-1354; Saiki, R. K. et al. , (1988) Science, 239，487-491)的方法。具体地，本领域的技术人员可以容易地使用Drol基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列)或其一部分作为探针，或者使用与Drol基因(SEQ IDNO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列)特异杂交的寡核苷酸作为引物，从水稻或其它植物分离与Drol基因高度同源的DNA。本发明的DNA还包括此类编码在功能上与Drol蛋白等价的蛋白质，可以通过使用杂交或PCR技术加以分离的DNA。为了分离这种DNA，杂交反应优选地在严格条件下进行。本领域的技术人员能够适当地选择严格杂交条件。例如，可以在含有25%甲酰胺，或者在更严格条件下含有50%甲酸胺，和 4x SSC, 50mM Hepes (pH 7· O)，IOxDenhardt ’ s 溶液，和 20 μ g/ml 变性鲑鱼精子DNA的杂交溶液中在42° C过夜进行预杂交；然后添加标记探针，并通过在42° C过夜温育进行杂交。杂交后的清洗可以用如下条件的清洗溶液和温度进行例如大约“2xSSC, O. 1%SDS, 50° C”，“2x SSC, O. 1%SDS, 42。C”, “Ix SSC, 0. 1%SDS, 37。C”;更严格的条件为大约 “2x SSC, O. 1%SDS, 65。C”，“0. 5x SSC, 0. 1%SDS, 42。C” ；再更严格的条件为大约“0. 2x SSC，0. 1%SDS，65° C”。随着杂交严格度的提高，预期可以分离与探针序列相似度更高的DNA。然而，上述的SSC、SDS和温度条件组合仅仅是举例，本领域的技术人员可以通过合适地组合上述和其它决定杂交强度的元素(例如探针浓度、探针长度或杂交反应时间)可以实现相似的强度。因此，由这种分离的DNA编码的蛋白质可预期在氨基酸水平上与Drol蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3，13或15)高度相似。而且，该DNA预期在核苷酸序列水平上与编码Drol蛋白的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: I, 2，12，14，16或17)高度相似。高度相似是指在整个氨基酸或核苷酸序列上的序列同一性为至少50%或更高，优选地70%或更高，更优选地90%或更高(例如91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或更高)。这种氨基酸序列或核苷酸序列相同度可以用Karin and Altschul的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:2264-2268，1990; Proc Natl Acad Sci USA 90:5873，1993)加以确定。根据 BLAST算法已经开发出了被称作BLASTN和BLASTX的程序(Altschul SF, et al. , J Mol Biol215:403, 1990)。当用BLASTN分析核苷酸序列时，参数可以设定为例如得分(score)=100，字长(wordlength)=12。或者，当用BLASTX分析氨基酸序列时,参数可以设定为例如得分=50和字长=3。当使用BLAST和间隙BLAST程序时，可以使用每个程序的默认参数。具体的程序是这些分析方法已知的。
本发明的DNA可以用于例如制备重组蛋白和产生具有深根性性状的植物转化体。重组蛋白的制备通常是通过将编码本发明蛋白的DNA插入到合适的表达载体中，将载体导入到合适的细胞内，培养转化的细胞，和纯化表达的蛋白。重组蛋白可以作为和其它蛋白的融合蛋白加以表达，以便使纯化更容易，例如作为与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白，使用大肠杆菌作为宿主(New England Biolabs，USA，pMAL载体系列)，作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白(Amersham Pharmacia Biotech, pGEX载体系列)，或者加组氨酸标签(Novagen，pET series)。宿主细胞没有特别限制,只要该细胞适合于表达重组蛋白即可。除了上述的大肠杆菌之外，可能使用例如酵母、各种植物或动物细胞、昆虫细胞等。载体可以通过各种领域技术人员已知的方法导入到宿主细胞内。例如，使用钙离子的导入方法可以用于导入到大肠杆菌中(MandeI, M. &Higa, A. (1970) Journal of MolecularBiology,53,158-162;Hanahan, D. (1983)Journal of Molecular Biology, 166，557-580)。在宿主细胞内表达的重组蛋白可以通过本领域技术人员已知的方法从宿主细胞或其培养物上清纯化和回收。当作为与上述的麦芽糖结合蛋白等的融合蛋白表达时，重组蛋白可以容易地利用亲和力来纯化。作为另一选择，可以通过如下文所述的技术来产生导入了本发明DNA的植物转化体。本发明的蛋白质可以从这类植物制备。因此，本发明的植物转化体不但包括导入了本发明DNA来赋予植物深根性性状的植物，还包括导入了本发明DNA以便制备本发明蛋白质的植物。它们在下文有描述。所得的重组蛋白可用于制备与该蛋白结合的抗体。多克隆抗体可以例如如下地加以制备。将用于免疫的动物例如家兔用本发明的纯化蛋白或其部分肽进行免疫；一定时期后，采集它们的血液，并除去血凝块。同时，单克隆抗体可如下制备。使骨髓瘤细胞与来自用上述蛋白或肽免疫的动物的产抗体细胞融合；分离产生感兴趣抗体的单克隆细胞(杂交瘤细胞)；并从该细胞获得抗体。所得的抗体可用于纯化或检测本发明的蛋白质。本发明包括可与本发明蛋白结合的抗体。这些抗体可用于检测植物中Drol蛋白的表达位点，或者评估植物物种是否表达Drol蛋白。例如,Kinandang Patong型Drol蛋白的第227-251位的氨基酸序列是具有深根性性状的栽培种的特征序列。因此，特异识别该整个序列或其部分的抗体可用于评估植物物种是否表达Kinandang Patong型Drol蛋白(其是否具有深根性性状)。本发明还提供了包括Drol基因的载体和转化细胞。关于本发明的载体，例如，当宿主是大肠杆菌时，只要载体具有用于在大肠杆菌中扩增的“ori”从而使载体能够在大肠杆菌(例如JM109、DH5 a、HBlOl和XLlBlue)等宿主中大量扩增和制备，并且进一步具有选择基因用于筛选转化的大肠杆菌(例如药物耐受基因，可允许用药物(氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等)加以区分)即可，载体没有限制。这些载体包括例如Μ13载体，pUC载体，pBR322, pBluescript和pCR-Script。除了上述载体之外，也可以使用例如pGEM-T，pDIRECT和pT7进行亚克隆和cDNA切取。当使用载体产生Drol蛋白时，表达载体是特别有用的。当表达载体在例如大肠杆菌中表达时，它应当具有上述特征以便能够在大肠杆菌中扩增。此外，当使用大肠杆菌例如JM109，DH5 α，ΗΒ101,或XLl-Blue作为宿主时，载体必须具有允许其在大肠杆 菌中高效表达的启动子，例如IacZ启动子(Ward etal. Nature 341:544-546，1989;FASEBJ. 6:2422-2427, 1992)，araB 启动子(Better et al. Science 240:1041-1043，1988)，或 T7启动子。其它载体实例包括 PGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress 系统” (QIAGEN)，pEGFP,和 pET。进一步，载体可以包含用于多肽分泌的信号序列。当希望使产生的多肽进入大肠杆菌的外周质时，可以使用PelB信号序列(Lei, S. P. etal. J. Bacteriol. 169:4379(1987))作为多肽分泌的信号序列。例如，可以使用氯化钙或电穿孔方法将载体导入到宿主细胞内。用于在植物体表达的载体包括pMHl，pMH2, pCAMBIA
坐寸ο除了大肠杆菌之外，也可以使用其它来源的表达载体作为产生Drol蛋白的载体，例如哺乳动物来源(例如 pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic AcidsRes. 18(17) :5322 (1990))，pEF，和 pCDM8)，昆虫细胞来源(例如 “Bac-to-BAC 杆状病毒表达系统”(GIBC0-BRL)和pBacPAK8)，植物来源(例如pMHl和pMH2)，动物病毒来源(例如pHSV, pMV,和pAdexLcw)，逆转录病毒来源(例如pZIPneo)，酵母来源(例如“Pichia表达试剂盒” (Invitrogen)，pNVll和SP-QOI)，和枯草杆菌来源(例如pPL608和pKTH50)。例如在动物细胞如CH0、COS和ΝΙΗ3Τ3细胞中，载体必须具有一个在这些细胞内表达必需的启动子，例如 SV40 启动子(Mulligan et al. Nature277:108 (1979)), MMLV-LTR启动子，EFla 启动子(Mizushima et al. Nucleic Acids Res. 18:5322 (1990))，或CMV启动子。更优选地，载体包括一个用于选择转化体的基因(例如能够通过药物(例如新霉素或G418)加以区分的抗药性基因)。具有这些特征的载体的实例包括pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 和 p0P13。本发明的转化细胞可以用作例如表达或生产本发明蛋白的生产系统。这些蛋白生产系统包括体外和体内系统。当使用真核细胞时，可以使用例如动物细胞、植物细胞或真菌细胞，作为宿主细胞。已知的动物细胞包括哺乳动物细胞(除了上述的CHO细胞、COS细胞和NIH3T3细胞之夕卜，还有其它细胞例如3T3，myeloma细胞，BHK (幼仓鼠肾)，HeLa和Vero)，两栖动物细胞(例如非洲爪蛙卵母细胞(Valle, et al.，Nature (1981) 291，358-340))，和昆虫细胞(例如sf9, sf21,和 Tn5 细胞)。在 CHO 细胞中，DHFR 基因缺失的 CHO 细胞 dhfr-CHO (Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1980) 77，4216-4220)和 CHO K-I (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60，1275)可以优选地用在本发明中。CHO细胞对于大规模表达是特别优选的。植物细胞包括例如下述植物来源的细胞以及已知作为蛋白生产系统的烟草来源的细胞。有可能从细胞培养愈伤组织。同时，真菌细胞包括酵母细胞，例如酵母属细胞如酿酒酵母；丝状真菌细胞，例如曲霉属如黑曲霉，但并不仅限于此。本发明还提供了导入了本发明DNA或载体的上述细胞。而且，本发明涉及被Drol基因转化的植物，其具有深根性性状。 植物是否具有深根性性状可以通过将其与对照进行比较加以评估。这里，只要与对照相比，植物转化体的根在土壤中相对于地表以更深的角度延伸，即使该角度差异非常小，转化体就可被判定为“具有深根性性状”。植物转化体的根在土壤中相对于地表是否以更深的角度延伸可以通过上述的方法加以评估。这里，“对照”是指与本发明植物转化体具有相同的类型，但是没有人工导入本发明DNA或不具有任何本发明DNA的植物。这里，对照没有特殊的限制，只要它是与本发明植物转化体类型相同但没有导入本发明DNA或不具有任何本发明DNA的植物即可。因此，本发明的“对照”还包括人工导入了非本发明DNA的植物。这些植物包括，但不仅限于，例如与本发明植物转化体类型相同，但是用除本发明DNA之外的DNA、本发明DNA中导入了导致功能丧失的突变的DNA、对本发明DNA进行改造变成抑制其功能的DNA、或者仅含有本发明DNA的不足以发挥该DNA功能的一部分的DNA片段转化了的植物。用本发明DNA转化的植物没有特殊的限制，只要它们具有深根性性状即可，并可以在任何其它部分含有修饰。这些位于任何其它部分中的修饰包括例如穗形改变，但不仅限于此。植物转化体可以用本发明的DNA通过如下程序加以制备。将DNA或插入有DNA的载体导入到植物细胞。然后，从所得的转化植物细胞再生植物。在本发明中，优选的载体是能够在植物细胞中表达所插入基因的载体，包括上述的载体(例如pMHl，pMH2和pCAMBIA载体);然而，载体并没有特殊限制。本发明的载体可以包括例如启动子(例如花椰菜花叶病毒35S启动子)，用于在植物细胞内组成性基因表达。当使用这种启动子时，设计本发明的DNA可操作地连接在启动子的下游的DNA。然后，将设计的包含该DNA的载体导入到植物细胞内。通过再生所得转化的植物细胞可以获得表达本发明DNA的植物转化体。因此，本发明还提供了将本发明DNA操作连接在启动子下游而得到的DNA。这里，“可操作地连接”的意思是启动子序列与本发明的DNA连接，从而当转录因子与启动子序列结合时可诱导DNA的表达。除了上述之外，有可能使用具有在受到外界刺激时能够以可诱导的方式激活的启动子的载体。可导入前述DNA或载体的植物物种没有特殊的限制，包括例如单子叶植物。单子叶植物包括但不仅限于属于禾本科、百合科、凤梨科、棕榈科、天南星科、姜科和兰科的植物。属于禾本科的植物包括但不仅限于水稻、麦类品种(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龙山稷、珍珠粟、埃塞俄比亚画眉草、甘蔗、猫尾草、草地早熟禾、鸭茅、意大利黑麦草、多年生黑麦草、苇状羊茅和百喜草。可导入前述DNA或载体的植物细胞没有特殊的限制，可以处于任何形式，只要它们能够用于再生植物即可。例如，可以使用悬浮培养的细胞、原生质体、叶片切片、愈伤组织和萌发的种子。将前述DNA或载体导入到植物细胞内可以用本领域技术人员已知的方法进行，例如聚乙二醇法、电穿孔、农杆菌介导的方法和基因枪方法。在农杆菌介导的方法中，例如Nagel 等(Nagel, R. et al. FEMS Microbiol. Lett. 67，1990，325-328)的方法，可以通过将插入了 DNA的表达载体导入到农杆菌中，并通过直接感染或叶盘方法用农杆菌感染植物细胞，从而将DNA导入到植物细胞内。上述载体包含表达启动子，从而例如使本发明的DNA在导入到植物体内后能够在植物体内表达。一般地，本发明的DNA位于启动子的下游，而终止子进一步位于该DNA的下游。用于本目的的重组载体由本领域的技术人员根据植物类型和导入的方法适当地加以选择。 上述启动子包括例如来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S和来自玉米的遍在蛋白启动子(JP-A (Kokai) H02-79983)。上述终止子的实例可以是花椰菜花叶病毒来源的终止子和胭脂氨酸合酶基因的终止子；然而，启动子和终止子并没有限制，只要它们在植物内发挥功能即可。从植物细胞再生植物可以根据植物的类型通过本领域技术人员已知的方法来进行。实例包括如下的方法，但不仅限于对于水稻，Fujimura等的方法(Fujimura. et al. Tissue CultureLett. 2, 1995, 74);对于小麦，Harris等的方法(Harris, R. et al. Plant CellReports. 7, 1988, 337-340)和 Ozgen 等的方法(Ozgen,Μ· et al.Plant CellReports. 18, 1998, 331-335)对于大麦，Kihara和 Funatsuki 的方法(Kihara, M. and Funatsuki, H. BreedingSci. 44, 1994, 157-160)和 Lurs 和 Lorz 的方法(Lurs, R. and Lorz, H. Theor. Appl.Genet. 75，1987，16-25);对于玉米，Shillito等的方法(Shillito, R. D.，et al. Bio/Technology, 7, 1989, 581-587)和 Gordon-Kamm 等的方法(Gordon-Kamm，ff. J. et al. PlantCell. 2(7), 1990，603—618);对于高梁，Wen等的方法(Wen, F. S. , et al. Euphytica. 52, 1991, 177-181)和Hagio 的方法(Hagiο, T. Breeding Sci. 44, 1994, 121-126);对于黑麦，Castillo等的方法(Castillo A. M. ,Vasil V. ,Vasil I. K. (1994)Nature Biotechnology 12:1366-1371.);对于燕麦，Cho等的方法(Cho M. J.，WEN J.，LEMAUX P. G.，(1999) Plant science148:9-17.);对于珍珠粟，0，Kennedy等的方法(O，Kennedy Μ. Μ. , Burger J. Τ. , BothaF.C. (2004)Plant Cell Reports 22:684-690.);对于草地早熟禾，Ha等的方法(Ha C. D. , Lemaux P. G. , Cho M. J. (2001) In VitroCellular&Developmental Biology-Plant 37:6-11·);
对于鸭茅，CHO等的方法(CHO M. J. , CHOI H. ff. , LEMAUX P. G. (2001)Plant cellreports 20:318-324.);对于意大利黑麦草，Ye等的方法(Ye X. , Wang Z. Y. , Wu X. , PotrykusI. , Spangenberg G. (1997)Plant Cell Reports 16:379-384.);对于黑麦草，Spangenberg等的方法(Spangenberg G. , Wang Z. Y. , Wu X. , NagelJ.,Potrykus I. (1995)Plant science 108:209-217.);对于華状羊茅，Wang等的方法(Wang Z. Y. , Takamizo T. , Iglesias V. A. , OsuskyM. , Nagel J. , Potrykus I.,Spangenberg G. (1992)Nature BiotechnologylO:691-696.);和对于百喜草，Smith等的方法(Smith R. L. , Grando M. F. , Li Y. Y. , SeibJ. C. , Shatters R. G. (2002)Plant Cell Reports 20:1017-1021·)。 可以导入本发明DNA的植物可以是外植体，或者可以将DNA导入到从这些植物制备的培养细胞中。本发明中的“植物细胞”包括例如叶、根、茎、花、种子内的胚子叶、不成熟的胚的植物细胞；愈伤组织、悬浮培养的细胞；和萌发的种子，但不仅限于此。为了高效地选择出通过导入本发明DNA而被转化的细胞，优选地将重组载体与合适的选择标记基因或包含选择标记基因的质粒载体一起导入到植物细胞内。用于本目的的选择标记基因包括例如抵抗抗生素潮霉素的潮霉素磷酸转移酶基因，抵抗卡那霉素或庆大霉素的新霉素磷酸转移酶基因，和抵抗除草剂草胺膦的乙酰转移酶基因。将导入了重组载体的细胞置于含有合适的选择剂(取决于所导入的选择标记基因的类型)的已知选择培养基上，然后培养。这样，可以获得被转化植物的培养细胞。接着,在驯化培养基(acclimation medium)中培养从转化细胞再生的植物体。然后使该驯化的再生植物在通常的培养条件下生长，以获得具有深根性性状的植物，在它们成熟并且结实之后便能够获得种子。具体地，本发明提供了用于产生转化植物的方法，其包括如下的步骤(a)和(b)。本发明还提供了用于赋予植物深根性性状的方法，其包括下面的步骤(a)和(b)(a)将本发明的DNA(Drc)I基因)或携带该DNA (Drol基因)的载体导入植物细胞；和(b)从在步骤(a)中导入了该DNA或载体的植物细胞再生植物。上述用于产生转化植物的方法还可以包括步骤(c)选择被赋予了深根性性状的植物。在以这种方式再生和生长的转化植物中导入的外来DNA的存在可以通过已知的PCR方法或Southern杂交方法加以确认，或者通过分析植物体中DNA的核苷酸序列来确认。这种情况下，可以根据已知的方法从转化植物提取DNA,例如通过J. Sambrook等(Molecular Cloning, the 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。在使用PCR方法分析再生植物体中存在的包含本发明的DNA外来基因时，用从上述的再生植物体中提取的DNA作为模板进行扩增反应。扩增反应还可以在含有合成寡核苷酸引物的反应混合物中进行，该合成的寡核苷酸包括根据本发明DNA的核苷酸序列适当地选择的核苷酸序列。在扩增反应中，DNA的变性、退火和延伸反应可以重复数十次，以获得含有本发明DNA序列的DNA片段扩增产物。通过对含有扩增产物的反应混合物进行例如琼脂糖凝胶电泳，可以分离各种种类的DNA片段，借此能够确认是否有某个DNA片段与本发明的DNA相对应。本发明还涉及通过将Drol基因或携带Drol基因的载体导入到植物细胞内产生的具有深根性性状的转化植物。本发明还涉及用于产生转化植物的方法，其包括将Drol基因或携带Drol基因的载体导入到植物细胞内的步骤。进一步，在本发明的优选实施方案中，转化植物包括通过下面的步骤(a)-(d)产生的，并具有深根性性状的 转化植物。在本发明的另一个优选实施方案中，用于产生转化植物的方法包括如下步骤(a)将Drol基因或携带Drol基因的载体导入到植物细胞中；(b)确定步骤(a)中的植物细胞内人工导入的Drol基因或携带Drol基因的载体的拷贝数；(c)选择人工导入的Drol基因或携带Drol基因的载体的拷贝数为1(含有单拷贝的基因或载体)的转化植物细胞；和(d)从步骤(C)中选择的转化细胞再生植物。在上述方法中，在植物从包含Drol基因的转化植物细胞再生之后，可以确定植物体内人工导入的Drol基因或携带Drol基因的载体的拷贝数，以选择拷贝数为I的植物。因此，本发明涉及通过下面的步骤(a)-(c)产生的转化植物，其具有深根性性状。本发明还涉及用于产生转化植物的方法，其包括如下步骤(a)将Drol基因或携带Drol基因的载体导入到植物细胞中，并从该植物细胞再生植物；(b)确定步骤(a)中植物内人工导入的Drol基因或携带Drol基因的载体的拷贝数；和(c)选择人工导入的Drol基因或携带Drol基因的载体的拷贝数为I的转化植物；将Drol基因或携带Drol基因的载体导入植物细胞并从转化植物细胞再生植物可以通过上述的方法实现。同时，转化植物细胞或转化植物中Drol基因或携带Drol基因的载体的拷贝数可以通过例如Southern印迹分析、实时PCR方法、核苷酸序列分析等加以确定。然而，这些方法并不仅限于这些实例。这里，“拷贝数”是指通过转化导入到植物体内的Drol基因或携带该基因的载体的数目。具体地，这里，“拷贝数”不包括植物中内源Drol基因(内源基因)的数目。如这里的实施例中所述，本发明人从其中人工导入的Drol基因的拷贝数为I的转化植物(TO代)产生了 Tl代植物，并检查了深根率与估算的Tl中Drol基因拷贝数之间的关系。结果证明，在Tl代中，纯合型植物(人工导入的Drol基因的拷贝数2)的深根率比缺失型植物(人工导入的Drol基因的拷贝数0)和杂合型植物(人工导入的Drol基因的拷贝数1)的深根率更大。因此，本发明特别优选的植物包括人工导入的Drol基因的拷贝数为2 (纯合型)的Tl代转化植物，其从人工导入的Drol基因的拷贝数为I的TO代转化植物产生。具体地，在特别优选的实施方案中，本发明包括使用如下方法产生的转化植物，该方法除了包括上述步骤(a)-(d)或(a)-(c)之外还包括下述的步骤。在另一个特别优选的实施方案中，本发明包括用于产生转化植物的方法，其除了包括上述步骤(a)-(d)或(a)-(c)之外还包括下述的步骤-通过使在步骤(d)或(C)中获得的植物转化体杂交产生植物；和-从上述步骤获得的植物中选择对Drol基因而言为纯合的植物。通过杂交从TO代植物产生Tl代植物的方法是本领域技术人员已知的。通过杂交产生的植物中Drol基因的拷贝数(缺失型、杂合型和纯合型)可以通过本领域技术人员已知的方法加以确定，例如Southern印迹分析和实时PCR方法。一旦生成了在染色体中导入了本发明DNA的转化植物，可以通过从该植物进行有性和无性繁殖获得其后代。作为另一选择，可以从该植物、其后代或克隆分离的细胞、器官或繁殖材料(例如种子、果实、切穗、块茎、块根、插枝(Stock)、愈伤组织和原生质体)大规模产生植物。本发明包括人工导入了本发明DNA的植物细胞；包含该细胞的植物；该植物的器官(例如花、叶、根、茎等)；该植物的后代和克隆；和该植物和其后代和克隆的繁殖材 料。这些植物细胞、包含该细胞的植物、该植物的器官、该植物的后代和克隆、和该植物和其后代和克隆的繁殖材料可以用于赋予植物深根性性状。同时，本发明的转化植物包括例如单子叶植物。单子叶植物包括，但不仅限于，属于禾本科、百合科、凤梨科、棕榈科、天南星科、姜科和兰科的植物。属于禾本科的植物包括，但不仅限于，稻和麦类(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龙山稷、珍珠粟、埃塞俄比亚画眉草、甘蔗、猫尾草、草地早熟禾、鸭茅、意大利黑麦草、多年生黑麦草、苇状羊茅和百喜草。进一步，本发明涉及从下述的至少一种获得的加工食品本发明的细胞、繁殖材料和器官。这里，加工食品是指可供人类食用的形式的产品，其通过对植物，例如稻、和麦类(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龙山稷、珍珠粟、埃塞俄比亚画眉草、甘蔗和猫尾草，或其部分(细胞、繁殖材料、器官等)进行人工加工而产生。在本发明中，加工包括如下处理，例如煮、煨、煸炒、蒸、油炸和粉碎，但不仅限于。“粉碎”包括脱粒和碾米。本发明的加工食品包括由上述处理中的至少一种产生的加工食品。本发明优选加工食品的一个实例是通过对水稻种子进行脱粒和碾米，随后加热获得的加工食品。具体地，本发明的加工食品包括，但不仅限于，通过碾米获得的烹饪好的大米产品(包括冷冻米饭和无菌米饭)，米粉、米饼、米线、日式碎块小年糕、日本米饼、小甜饼、味噌(发酵的大豆糊)、酱油、豆腐(发酵的大豆凝乳)、面包、荞麦面、小麦面条、面团、面条例如中国面条(生面条(raw noodle)、干面条、煮面条等)、谷类食品和玉米片。作为商业产品的本发明加工食品的外观没有特殊限制。外观的实例包括在环境温度或低温下销售流通，并且在食用/饮用时用加热厨具例如微波炉加热到室温或更高温度的产品形态。具体地，作为商业产品的配置包括，但不仅限于可以在便利店、超市、熟食店等出售的便当、饭团和熟面条。本发明的加工食品可以处于容器包装形式。例如，食物可以包装在模压塑料容器中，或者包装在蒸煮袋等中，在密封后灭菌。本发明的“从细胞、繁殖材料或器官的至少一种获得的加工食品”还可以称为“从细胞、繁殖材料或器官的至少一种产生的加工食品”，“包含细胞、繁殖材料或器官中至少一种的加工食品”，或者“通过对细胞、繁殖材料或器官中的至少一种进行加工获得的加工食
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进一步，本发明提供了用于评估植物是否具有深根性性状的方法，其包括如下所述的步骤(a)-(c)，其中当分子量或核苷酸序列相同时则判定测试植物具有深根性性状或者潜在具有深根性性状(a)从测试植物制备DNA样品；(b)从DNA样品扩增本发明DNA(Drol基因)的全部或一部分区域；和(c)将扩增的DNA片段与本发明DNA(Drc)I基因)的分子量或核苷酸序列进行比 较。这种优选的Drol基因部分是包括Drol基因的第4外显子，更优选从Drol基因第4外显子的5’端起第116位bp的核苷酸(SEQ ID NO: 2核苷酸序列第943位的核苷酸)的区域(例如包括SEQ ID NO: 2核苷酸序列第943位核苷酸的由至少100，50，40，30，20，10,9，8，7，6，5，4，3，2或I个核苷酸构成的区域)，但不仅限于此。本发明人揭示,在KinandangPatong中，从Drol基因外显子4的5’端开始第116位bp的核苷酸(SEQ ID NO: 2核苷酸序列第943位的核苷酸)是腺嘌呤，而在IR64中该核苷酸被删除。因此，测试植物是否具有深根性性状可以通过检查这一核苷酸的存在与否加以评估。具体地，本发明提供了用于评估植物是否具有深根性性状的方法，其包括检测在SEQID NO: 2核苷酸序列第943位核苷酸是否存在的步骤，其中当检测到该核苷酸时，则判定测试植物具有深根性性状。单核苷酸缺失可以通过比较包含全部或部分Drol基因的区域的核苷酸序列或分子量来检测。进一步，本发明涉及用于评估植物是否具有深根性性状的方法，其包括用包含SEQID N0:8和9核苷酸序列的引物并以从测试植物制备的基因组DNA为模板进行PCR的步骤。在这些方法中，当获得扩增产物时，则判定测试植物具有深根性性状。进一步，本发明涉及用于评估植物是否具有深根性性状的方法，其包括用包含SEQID NO: 10和11核苷酸序列的引物并以从测试植物制备的基因组DNA为模板进行PCR的步骤。在这些方法中，当获得扩增产物时，则判定测试植物具有深根性性状。进一步，本发明提供了用于在评估植物是否具有深根性性状时使用的引物。这种引物包括，但不仅限于，包含SEQ ID NO:8-11中的任一核苷酸序列的DNA。这里，“评估植物是否具有深根性性状”不仅意味着评估迄今已经在栽培的栽培种是否具有深根性性状，还意味着评估通过杂交或使用遗传工程技术新近开发出的栽培种是否具有深根性性状。在本发明用于评估植物是否具有深根性性状的方法中，通过测试植物是否具有编码功能Kinandang Patong型Drol蛋白的DNA对其进行评估。可以通过检查基因组DNA的与Drol相当的区域的分子量的差异，或者核苷酸序列的差异来评估植物是否具有编码功能性(Kinandang Patong 型)Drol 蛋白的 DNA。在本发明的评估方法中，首先，制备(提取)DNA样品，然后从DNA样品扩增相应于Drol基因的DNA区域。接着，将从具有深根性性状的栽培种Drol基因的DNA区域扩增的DNA片段的分子量与从测试植物DNA样品扩增的DNA片段的分子量进行比较。当分子量相同时，则判定测试植物具有深根性性状。作为另一选择，将从具有深根性性状的栽培种Drol基因的DNA区域扩增的DNA片段的核苷酸序列与从测试植物DNA样品扩增的DNA片段的核苷酸序列进行比较。当核苷酸序列相同时，则判定测试植物具有深根性性状。DNA样品可以通过本领域技术人员已知的方法加以制备(提取)。这些优选的制备方法包括例如通过CTAB方法提取DNA的方法。待通过本发明评估方法评估的DNA样品没有特别限制。一般地，将从测试植物提取的基因组DNA用作DNA样品。而且，待收集的基因组DNA的来源没有特别限制，它们可以从任何植物组织中提取，例如穗、叶、根、茎、种子、胚乳、麸或胚芽。然而，来源并不仅限于这些实例。在本发明的评估方法中，通过PCR等方法扩增本发明Drol基因的DNA区域。本发明“Drol基因的DNA区域”是指相应于Drol基因基因组DNA区域的一部分(例如SEQ IDNO: I的DNA区域)。待扩增的区域可以是整个基因组DNA或基因组DNA的一部分(例如编码蛋白质的ORF区域或其一部分)。本领域的技术人员能够通过合适地选择反应条件等进行PCR。在进行PCR时，扩增的DNA产物可以用同位素如32P、荧光染料、生物素等标记的引物加以标记。作为另一选择，在进行PCR时，可以通过向PCR混合物添加用同位素如32P、荧光染料、生物素等标记的核苷酸底物来标记扩增出的DNA产物。而且，也可以在PCR之后通过使用Klenow酶等与用同位素32P、荧光染料、生物素等标记的核苷酸底物连接来标记扩增出的DNA片段。 将用这种方法获得标记DNA片段通过加热等方法变性，并在含有变性剂如尿素或SDS的聚丙烯酰胺凝胶中电泳。使用SDS作为变性剂的SDS-PAGE是本发明中有利的分级技术。SDS-PAGE 可以根据 Laemmli 的方法(Laemmli (1970)Nature 227, 680-685)进行。在电泳之后，通过用X-射线胶片放射自显影、荧光探测扫描仪等检测DNA片段的活动性并进行分析。当不使用被标记的DNA时，DNA片段可以通过在电泳之后用溴化乙锭、银染等对凝胶进行染色加以检测。例如，使用包含SEQ ID N0:8和9核苷酸序列的引物从具有深根性性状的栽培种(例如Kinandang Patong)和测试植物扩增DNA片段。通过比较它们的分子量评估可以评价植物是否具有深根性性状。当分子量相同时，则判定测试植物具有深根性性状。作为另一选择，可以通过直接确定测试植物中相应于本发明DNA的DNA区域的核苷酸序列，并与具有深根性性状的栽培种的核苷酸序列进行比较，评估植物是否具有深根性性状。当核苷酸序列相同时，则判定测试植物具有深根性性状。这里，“相同”意味着，对于两个等位基因，基因的分子量或其核苷酸序列或氨基酸序列与具有深根性性状的植物都相同。因此，“相同”不包括如下情况，即等位基因其中一个的分子量、核苷酸序列或氨基酸序列与具有深根性性状的植物相同，但是另一个与具有深根性性状的植物不同。上述电泳分析可以根据传统的方法进行。例如，通过在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上施加电压进行电泳，然后对分离的DNA图谱进行分析。同时，核苷酸序列可以用例如市场上可以获得的DNA测序仪加以确定。而且，被鉴定具有深根性性状的植物可以通过本发明的评估方法早期选出。具体地，本发明提供了用于筛选具有深根性性状的植物的方法，其包括如下所述的步骤(a)和(b)(a)通过将任意植物与具有深根性性状的植物进行杂交产生栽培种；和(b)通过这里所述的用于评估测试植物是否具有深根性性状的方法评估步骤(a)中获得的植物是否具有深根性性状。
本发明的筛选方法可以额外地包括如下步骤(C)选择在步骤(b)被判断具有深根性性状的植物。可以通过本领域技术人员已知的方法将具有深根性性状的植物和任意植物杂交。被判断具有深根性性状的植物可以通过本发明的筛选方法早期选出。本发明还提供了用于早期选择被判断具有深根性性状的植物的方法。这里，“早期”是指例如抽穗之前的阶段，优选地在紧接萌发之后的阶段。通过使用本发明的筛选方法，具有深根性性状的植物品种的育种可以在比过去更短的时间周期内实现。可用于本发明评估或筛选方法的植物包括例如单子叶植物，但并不仅限于此。单子叶植物包括，但不仅限于，属于如下科属的植物禾本科、百合科、凤梨科、棕榈科、天南星科、姜科和兰科。属于禾本科的植物包括，但不仅限于，水稻、麦类品种(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龙山稷、珍珠粟、埃塞俄比亚画眉草、甘蔗、猫尾草、草地早熟禾、鸭茅、意大利黑麦草、多年生黑麦草、苇状羊茅和百喜草。 本发明还提供了如下的DNA (寡核苷酸)，其包含至少15个(例如16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25个)与本发明的Drol基因的核苷酸序列或其互补序列互补的连续核苷酸。这里，“互补序列”是指相对于由碱基对[A:T]和[G:C]构成的双链DNA中一条链序列的相对链的序列。而且，“互补”的意思不仅包括与至少15个核苷酸的连续核苷酸序列完全互补的核苷酸序列，还包括在核苷酸序列水平上有至少70%的同一性，优选地至少80%，更优选地90%，再优选地95%或者更多(95%, 96%, 97%, 98%,或99%)的同一性。这些DNA可以用作检测或分离本发明DNA的探针，或者作为用于扩增DNA的引物。这些引物包括，但不仅限于，如下所述的引物系列由包含SEQ ID NO: 4和5的核苷酸序列的引物组成的引物系列，用于扩增Dro 1-INDEL09，Dro 1-INDEL0 是一个在 IR64 和 Kinandang Patong 之间具有多态性的 InDel标记；由包含SEQ ID NO: 6和7的核苷酸序列的引物组成的引物系列，用于扩增Dro 1-CAPS05，Dro 1-CAPS05 是一个在 IR64 和 Kinandang Patong 之间具有多态性的 CAPS 标记；由包含SEQ ID NO:8和9的核苷酸序列的引物组成的引物系列，其用于扩增SNP02-KP, SNP02-KP 是一个 Kinandang Patong 基因组 DNA 特异的标记；由包含SEQ ID NO: 10和11的核苷酸序列的引物组成的引物系列，其用于扩增SNP02-IR64, SNP02-IR64是一个IR64来源的基因组DNA特异的标记；进一步，本发明涉及来自Drol基因的20-100个连续核苷酸，其包括用植物(例如水稻)来源的基因组DNA作为模板用上述引物扩增的完整或部分DNA片段。这些DNA可以用于评估测试植物具有深根性还是浅根性。当使用本发明的寡核苷酸作为探针时，它们优选地在适当标记之后使用。标记方法包括例如使用T4多核苷酸激酶用32P磷酸化寡核苷酸的5’端的方法，和通过DNA聚合酶例如Klenow酶使用随机引物六聚体寡核苷酸等作为引物将用同位素如32P、荧光染料、生物素等标记的底物核苷酸掺入到寡核苷酸中的方法(随机引发方法等)。本发明的寡核苷酸可以例如用市售的寡核苷酸合成仪来制作。也可以制备限制酶处理等获得的双链DNA片段作为探针。
进一步，本发明涉及赋予植物深根性性状的药剂，其以可表达的方式包含Drol基因或携带该基因的载体。在本发明药剂中使用的DNA的类型没有特别限制，DNA可以是cDNA或基因组DNA。此外，有可能不仅使用编码水稻来源Drol蛋白的DNA，还使用编码与该蛋白结构相似的蛋白的DNA(例如突变体、衍生物、等位基因、变异体和同源体)，只要它们在被导入到植物体内时能够赋予植物深根性性状即可。包含在本发明药物试剂的DNA可以被插入在载体内。载体没有限制，只要它们能够允许被导入的基因在植物细胞内表达即可。例如，有可能使用含有允许在植物细胞内稳态基因表达的启动子(例如马铃薯SK2几丁质酶基因的启动子，花椰菜花叶病毒35S启动子等)的载体，或者含有可以被外界刺激诱导活化的启动子的载体。本发明的药剂可以是上述的DNA或者插入了上述DNA的载体，它们可以和其它用于向植物细胞内导入的成分混合。例如，上述的DNA、插入了上述DNA的载体、导入了上 述DNA的农杆菌和包含它们的生化试剂和溶液也包含在本发明的药剂内。进一步，本发明涉及用本发明DNA转化的植物，其具有抗旱性。本发明还涉及从上述植物分离的细胞、繁殖材料和器官。此外，本发明涉及从上述细胞、繁殖材料和器官的至少一种获得的加工食品。而且，本发明涉及用于产生抗旱的转化植物的方法，其包括将本发明的DNA或载体导入到植物细胞中，并从该植物细胞再生植物的步骤。本发明还涉及评估植物是否抗旱的方法，其包括如下所述的步骤(a)-(c)，当分子量或核苷酸序列相同时，则判定测试植物是抗旱的。(a)从测试植物制备DNA样品；(b)从DNA样品扩增包含本发明DNA的区域；和(c)将本发明DNA的分子量或核苷酸序列与扩增的DNA片段进行比较。本发明还涉及用于评估植物是否抗旱的方法，其包括用包括SEQ ID N0:8和9的核苷酸序列的引物以从测试植物制备的基因组DNA为模板进行PCR的步骤，其中当PCR产生扩增产物时，则判定测试植物是抗旱的。进一步，本发明涉及用于评估植物是否抗旱的方法，其包括用包括SEQID NO: 10和11的核苷酸序列的引物以从测试植物制备的基因组DNA为模板进行PCR的步骤，其中当PCR产生扩增产物时，则判定测试植物是不抗旱的。此外，本发明涉及用于选择抗旱植物的方法，其包括如下步骤(a)通过将任意植物与抗旱植物杂交产生栽培种；和(b)通过上述用于评估植物是否抗旱的方法评估在步骤(a)中产生的植物是否抗旱。根据本文的描述，可以实现抗旱转化植物的产生，植物抗旱性的评估，和抗旱植物的选择。植物是否抗旱可以通过测量叶片温度加以评估。这里，只要植物转化体的叶片温度在人工干旱胁迫条件下(在干燥环境下)与对照相比降低，即使温度下降非常小，则判定植物“抗旱”。这里，叶片温度是指植物叶片表面的温度。植物通过气孔吸收二氧化碳用于光合作用。同时，细胞内的水分通过气孔蒸发到大气中。结果导致水分损失。这种现象称作蒸腾作用。关于这些联系，Takai等已经报道，叶片温度与光合速率和气孔扩张程度(气孔导度)负相关(Takai et al. , Field Crops Research doi : 10. 1016/j. fcr. 2009. 10. 019. 2009) 气孔开放越大，蒸腾作用越活跃。蒸腾作用从叶表面带走热量，导致叶片温度降低。当植物活跃地进行光合作用时，它打开气孔，蒸腾作用变得活跃。这导致叶片表面的温度降低。同时，在干旱胁迫下，植物通过关闭气孔抑制蒸腾作用，以保持细胞水势。这会阻碍光合作用并提高叶片温度。抗旱植物即使在干旱条件下也能够开放气孔和进行光合作用，与干旱敏感植物相比，叶片温度更低。Hirayama等报道，用叶片温度作为指标来选择抗旱水稻株系可以有效地开发抗旱水稻栽培种(Hirayama et al. , Breeding Science 56:47-54.2006)。如这里的实施例中所述，植物叶片温度是否低可通过使用红外热成像仪等装置在干旱胁迫下对其进行测试而简单地加 以评估。同时，光合作用和气孔扩张程度可以通过使用光合成/蒸腾作用测量系统等装置在干旱胁迫下进行简单的测量来加以评估，如本文实施例中所述。进一步，已经知道，一般的植物在暴露于干旱胁迫时会显示卷叶。特别地，已知水稻叶子会卷曲成针状。然而，本发明的转化植物即使在干旱胁迫下也很少显示卷叶。具体地，本发明涉及用本发明DNA转化的、在干旱胁迫下可抵抗卷叶的植物。本发明还涉及从上述植物获得的细胞、繁殖材料和器官。本发明还涉及从上述细胞、繁殖材料和器官中至少一种获得的加工食品。进一步，本发明涉及用于产生在干旱胁迫下抗卷叶的转化植物的方法，其包括向植物细胞中导入本发明DNA或载体并从该植物细胞再生植物的步骤。本发明还涉及用于评估植物在干旱胁迫下是否抗卷叶的方法，其包括下述的步骤(a)-(c)，当分子量或核苷酸序列相同时，则判定测试植物在干旱胁迫下抗卷叶(a)从测试植物制备DNA样品；(b)从DNA样品扩增包括本发明DNA的区域；和(c)将本发明DNA的分子量或核苷酸序列与扩增的DNA片段进行比较。本发明还涉及用于评估植物在干旱胁迫下是否抗卷叶的方法，其包括使用包含SEQ ID N0:8和9核苷酸序列的引物以及从测试植物制备的基因组DNA作为模板进行PCR的步骤，当PCR产生了扩增产物时，则判定测试植物在干旱胁迫下抗卷叶。进一步，本发明还涉及用于评估植物在干旱胁迫下是否抗卷叶的方法，其包括使用包含SEQ ID NO: 10和11核苷酸序列的引物以及从测试植物制备的基因组DNA作为模板进行PCR的步骤，当PCR产生了扩增产物时，则判定测试植物在干旱胁迫下不抗卷叶。此外，本发明涉及选择在干旱胁迫下抗卷叶的植物的方法，其包括如下步骤(a)通过将任意植物与在干旱胁迫下抗卷叶的植物进行杂交产生栽培种；和(b)通过上述用于评估植物在干旱胁迫下是否抗卷叶的方法评估步骤(a)中产生的植物在干旱胁迫下是否抗卷叶。根据本文的描述，可以实现在干旱胁迫下抗卷叶的转化植物的产生、植物在干旱胁迫下是否抗卷叶的评估和在干旱胁迫下抗卷叶的植物的选择。这里，抗卷叶性是指抵抗由干旱胁迫导致的卷叶。当水稻叶脱水时，叶片内部表皮马达细胞(epicuticular motor cell)的膨胀压降低，结果叶片卷曲，从而使表皮侧呈凹形。植物是否抗卷叶可以简单地通过测试其叶片在干旱胁迫下是否卷曲来加以评估。
这里，只要植物转化体中叶片卷曲的程度与对照相比减少，即使程度差异很轻微，也可以判定植物“抗卷叶”。进一步，在干旱胁迫条件下，作物一般经常严重不稔，使得成熟的颗粒数目和实粒重量降低。这导致最终的粮食产量减少。然而，即使在干旱胁迫下，本发明的转化植物与不具有本发明DNA的植物(对照)相比，也能够产生更大数量的实粒或者更重的实粒(实粒数目或实粒重量的减少被抑制)。具体地，本发明涉及用本发明DNA转化的植物，其与对照相比在干旱胁迫下可产生更大数量的实粒或者更重的实粒。这种植物也称作经过改良从而可以在干旱胁迫下减少实粒数量损失或者实粒重量损失的植物。作为另一选择，该植物可以称作经过改良从而在干旱胁迫下具有更大数量的实粒或者更重的实粒的植物。进一步，本发明涉及从上述植物分离的细胞、繁殖材料和器官。本发明还涉及从上述细胞、繁殖材料和器官中至少一种生产的加工食品。 而且，本发明涉及用于产生与对照相比在干旱胁迫下产生更大数量的实粒或更重的实粒的转化植物的方法，其包括将本发明的DNA或载体导入到植物细胞内并从植物细胞再生植物的步骤。此外，本发明涉及用于评估植物在干旱胁迫下与对照相比是否产生更大数量的实粒或更重的实粒的方法，其包括下述的步骤(a)-(c)，其中当分子量或核苷酸序列相同时，则判定测试植物与对照相比在干旱胁迫下生更大数量的实粒或更重的实粒(a)从测试植物制备DNA样品；(b)从DNA样品扩增包括本发明DNA的区域；和(c)将本发明DNA的分子量或核苷酸序列与扩增的DNA片段进行比较。本发明还涉及用于评估植物在干旱胁迫下与对照相比是否产生更大数量的实粒或更重的实粒的方法，其包括使用包含SEQ ID N0:8和9核苷酸序列的引物以及从测试植物制备的基因组DNA作为模板进行PCR的步骤，其中当PCR产生了扩增产物时，则判定测试植物在干旱胁迫下与对照相比产生更大数量的实粒或更重的实粒。进一步，本发明还涉及用于评估植物在干旱胁迫下与对照相比是否产生更大数量的实粒或更重的实粒的方法，其包括使用包含SEQ ID NO: 10和11核苷酸序列的引物以及从测试植物制备的基因组DNA作为模板进行PCR的步骤，其中当PCR产生了扩增产物时，则判定测试植物在干旱胁迫下与对照相比不产生更大数量的实粒或更重的实粒。此外，本发明涉及用于选择在干旱胁迫下与对照相比产生更大数量的实粒或更重的实粒的植物的方法，其包括如下步骤(a)通过将任意植物与在干旱胁迫下与对照相比产生更大数量的实粒或更重的实粒的植物进行杂交而产生栽培种；和(b)通过上述用于评估植物在干旱胁迫下与对照相比是否产生更大数量的实粒或更重的实粒的方法评估步骤(a)中产生的植物在干旱胁迫下与对照相比是否产生更大数量的实粒或更重的实粒。根据本文的描述，可以实现上述植物的产生、评估和选择。这里，“产生更大数量的实粒或更重的实粒”的意思是，与没有本发明DNA的对照相t匕，在干旱胁迫下实粒的数量更多，或者在干旱胁迫下实粒的重量更大。这里，只要与对照相比，实粒的数量更多或者实粒的重量更大，即使差异非常小，也判定植物“产生更大数量的实粒或更重的实粒”。植物实粒的数量可以通过例如计数所收获的谷穗中除不稔谷穗之外的实粒的数量而容易地加以确定。然而，确定方法并不仅限于该实例。同时，植物实粒的重量可以通过例如对除不稔谷穗之外所收获的谷穗中的实粒称重而容易地加以确定。然而，确定方法并不仅限于该实例。SEQ ID NOs相应的各个序列的列表如下SEQ ID NO: I, Kinandang Patong Drol 基因的基因组 DNA 核苷酸序列；SEQ ID NO: 2, Kinandang Patong Drol 基因的 cDNA 核苷酸序列；SEQ ID NO:3, Kinandang Patong Drol 蛋白的氨基酸序列； SEQ ID N0:4和5，用于扩增在IR64和Kinandang Patong之间有多态性的InDel标记Drol-INDEL09的引物系列；SEQ ID N0:6和7，用于扩增在IR64和Kinandang Patong之间有多态性的CAPS标记Drol-CAPS05的引物系列；SEQ ID N0:8 和 9，用于扩增 Kinandang Patong基因组DNA特异标记 SNP02-KP 的引物系列；SEQ ID NO: 10和11，用于扩增IR64基因组DNA特异标记SNP02-IR64的引物系列；SEQ ID NO: 12,高粱Drol基因的CDS核苷酸序列；SEQ ID NO: 13,高粱Drol蛋白的氨基酸序列；SEQ ID NO: 14，玉米Drol基因的CDS核苷酸序列；SEQ ID NO: 15,玉米Drol蛋白的氨基酸序列；SEQ ID NO: 16,在FOX搜寻系统中使用的Nipponbare的cDNA核苷酸序列[这一序列与根据基因组DNA核苷酸序列确定的cDNA序列(SEQ IDN0:2的核苷酸序列)相比，在5’和3’端各具有Ibp添加。而且，该cDNA在自其核苷酸序列5’端373位bp处(自SEQID NO: 2的5’端372位bp处)有一个A变成G的核苷酸取代。]SEQ ID NO: 17, Kinandang Patong Drol基因的核苷酸序列和其包含启动子区域的上游序列；和SEQ ID NO: 18，Nipponbare中与SEQ ID NO: 17相应的区域的核苷酸序列。本文通过提述并入这里索引的全部先前技术文献。
实施例在本发明中，对提篮法进行了改进，以便能够对深根性进行简单、可重复、且节省空间的评估。而且，为了将候选核苷酸序列导入到IR64中，对基于愈伤组织的农杆菌转化方法进行了改进，并将将基因导入到了 IR64中。通过图位克隆方法(map-based cloning)分离和鉴定了深根性基因Drol的核苷酸序列。因此，本发明人开发了一种通过用基因容易地修饰深根性而赋予植物避旱能力的技术。下文中，将参考实施例对本发明进行具体的介绍，但是不应理解为本发明仅限于此。
「实施例IlDrol基因座位的鉴定两个水稻栽培种Kinandang Patong(—种菲律宾旱稻品种)和IR64(由国际水稻研究所(International Rice Research Institute)开发的水田稻)由国际水稻研究所提供。两个栽培种彼此杂交，以获得用于基因分离的材料。在通过两个栽培种杂交产生的BC2F2群体中，一个群体的第9染色体分离但是其它染色体区域则尽量固定于IR64纯合型，该群体分离成浅根性植物和深根性植物。IR64和Kinandang Patong分别显示浅根性表型和深根性表型。因此认为该分离涉及了负责Kinandang Patong的深根性的基因。从该观点出发，发明人对群体进行了彻底的评估，将植物分成浅根型和深根型，以研究其基因型。结果显示，与深根性有关的数量性状座位(QTL)位于第9染色体上(Uga et al. , The 2ndInternational Conference on Plant Molecular Breeding. 2007)。使用能够定量评估深根性的提篮法进行了详细的遗传分析。具体地，在直径15cm的塑料篮中填满土壤并埋置在 花盆(pot)中。播种后，将水稻植株培养到大约8叶龄。根据深根率对深根性进行评估，深根率由穿出提篮底部的根数相对于从每个提篮中穿出的总根数的百分比确定。当相对于地表以超过53°的角度向下延伸时，根就会穿出提篮底部。IR64的平均深根率是1.6%，而Kinandang Patong的平均深根率是72. 6%。为了将与深根有关的QTL定位成单个基因座位，从BC2F2群体中选出8株在QTL附近区域内有重组的植物。然后，从自交后代(BC2F3)中选出自交固定系(BC2F4)15对于每个固定系，在花盆中培养20-23株植物。通过由提篮法确定的深根率推导基因型。在BC2F4系中，QTL周围区域固定于IR64型的植株显示的平均深根率为2.6%，这与IR64的深根率几乎相当。同时，QTL周围区域固定于Kinandang Patong型中的植株显示的平均深根率为40. 4%。从这些结果可以清晰地确定它们的QTL基因型。QTL被作为单一的座位定位到InDel标记ID07_14和ID07_17之间。因此，QTL被命名为深根相关座位 “Drol ”(Deeper Rooting I) (Uga et al. , Nihon Ikusyu Gakkai Dai 112KaiKouenkai Youshisyu (112nd Meeting of The Japanese Society of Breeding, Programand Abstracts)PP. 188, 2007;Uga et al. , Dai 27Kai Ne Kenkyu Syukai(27th ResearchMeeting of The Japanese Society for Root Research), 2007;Uga et al. , The 5thInternational Crop Science Congress Abstracts 243p. 2008)。进一步，通过基于简单重复序列(SSR)标记公开信息(International Rice Genome Sequencing Project 2005)的多态性分析，对位于该区域中两个InDel标记之间的SSR标记进行了评估。Drol的候选区域被缩小到位于SSR标记RM24393和RM7424之间的608kbp区域。「实施例21高分辨率连锁分析为了通过图位克隆方法分离Drol基因，从由4，560株植物构成的BC3F2群体中选择了 359株在候选区域内具有重组的植物。为了用所选植物的后代缩小候选区域，必须一次对大量的植物进行深根率评估。由此，本发明人开发了一种评估方法，能够进行水培而无需将提篮埋置在花盆里。在本发明人开发的改良提篮法中，将填满土的直径7. 5cm的定制不锈钢提篮置于水培养基中，而不是埋在花盆里。这样，该方法能够在相当于现有方法所需面积四分之一的空间内对水稻的深根性进行评估。在改良提篮法中，深根定义为相对于地表以超过50°的角度向下延伸(图I)。使用改良提篮法，通过对每个株系评估大约40株植物确定深根率。根据深根率的频率分布预测每个株系中Drol的基因型。为了缩小基因区域，通过筛选选择DNA标记。关于位于,从OryzaSNP联合会的主页(http://irfRc.irri. org/index. php option=com content&task=view&id=14&Itemid=106)提取与 IR64和Kinandang Patong近缘的栽培种Azucena中Drol附近的SNP的信息用于设计CAPS标记。对CAPS标记的多态性进行测试。结果，有6个标记在IR64和Kinandang Patong之间存在多态性，并使用这6个多态性标记进行作图。而且,构建了 IR64和Kinandang Patong的BAC文库，并筛选含有候选区域的克隆。对选择到的克隆通过核苷酸测序进行分析。利用所得的序列信息制备11种类型的InDel标记和CAPS标记，用于在IR64和KinandangPatong之间产生多态性。使用这些标记从359个株系中选择重组系。通过连锁分析，将Drol基因区域缩小到一个6. O-kbp区域内，其位于一个 In Del标记Drol_INDEL09 (引物:5，-GCAGACGCTCGTAACACGTA-3， (SEQ ID NO:4)和 5，-GTGGCAGCTCCATCAACTCT-3， (SEQ IDN0:5))和一个CAPS标记Drol-CAPS05(引物5’-GCACAAGATGGGAGGAGAGT-3’ (SEQ ID NO:6)和 5’-CATGGGTGAGAATCGTGTTG-3’ (SEQ ID NO: 7);扩增的 DNA 用限制酶 Hinf I 消化)之间。对包含该候选区域的基因组核苷酸序列进行RAP-DB分析，显示存在一个预测基因。发现该预测基因在IR64序列的外显子4中具有一个Ι-bp缺失，造成移框，导致一个终止密码子。[实施例3]用于鉴定Drol基因的互补实验并评估Drol基因过表达植物中的深根率3. I用于鉴定Drol基因的互补实验通过RAP-DB预测的基因被假定是Dro I。将涵盖Dro 16. O-kbp候选区域的Kinandang Patong 来源 8. 7-kbp KpnI-NotI 片段及其上下游区域插入到 pPZP2H_lac (Fuseet al. ,Plant Biotechnology 18:219-222，2001)中，并通过农杆菌 EHAlOl 导入到 IR64 的愈伤组织中。具体地，IR64的转化如下。(诱导用于农杆菌感染的愈伤组织)将经灭菌的IR64种子置于含有2，4_D的愈伤组织诱导培养基中，在30_33° C在连续光照下培养I周。然后，切割愈伤组织并转移到新鲜的愈伤组织诱导培养基中。将该程序重复三次以形成愈伤组织。所用的愈伤组织诱导培养基是从NBPRCH40 (Hiei and KomariNature Protocols 3:824-834. 2008)修改而来，NBPRCH40 在 Hiei and Komari 中是用于预培养愈伤组织，用于在选择出用不成熟胚法转化的愈伤组织之后将植物转化体再分化。愈伤组织诱导培养基具有如下的组成IOOmL IOx N6 主要盐(major salts), IOmL IOOx Fe-EDTA, ImL 1，000xB5 微量盐(minor salts) , ImL I, OOOx B5 维生素，30g/L 麦芽糖，0. 5g/L 酪蛋白氨基酸，0. 5g/L 脯氛酸,2mg/L 2, 4-D 和 5g/L Gelrite (pH 5. 8)。(农杆菌感染)在感染之前，将愈伤组织转移到新鲜培养基中。预培养3天后，将愈伤组织浸没在农杆菌悬浮液中。然后将愈伤组织转移到2N6-AS培养基中(Hiei and Komari, NatureProtocols 3:824-834. 2008)，并在 23。C 黑暗共培养。(除菌和被转化愈伤组织的筛选)共培养之后除去农杆菌。然后为了选择转化细胞，将经转化的愈伤组织置于含有药物(25mg/L潮霉素和400mg/L羧苄青霉素)的愈伤组织(选择)培养基中。30-33° C连续光照培养I周后，切割愈伤组织，并转移到新鲜培养基中。这个程序重复3次，以选择转化细胞。
(转化体再分化)将在选择培养基中生长的愈伤组织转移到再分化培养基中。在28° C连续光照下培养I周-10天后，将出芽的愈伤组织转移到新鲜的再分化培养基中。这个程序重复2次，以选择被转化的植物。再分化培养基的组成如下100mL IOx N6主要盐，IOmLIOOx Fe-EDTA, ImL I, OOOx B5 微量盐，ImLl, OOOx B5 维生素，30g/L 麦芽糖，30g/L 山梨醇，2g/L酪蛋白氨基酸，O. 5g/L脯氨酸，O. 02mg/L NAA, 5g/L, 2mg/L细胞分裂素，和5g/LGelrite (pH 5. 8)。潮霉素和羧苄青霉素向制备培养基的添加浓度分别为25mg/L和300mg/L0(^JH^(Naturalization))将再分化转化体转移到并在生根培养基中(MS培养基(4g/L Gelrite (pH5. 8)，补 充25mg/L潮霉素和200mg/L羧苄青霉素))28° C连续光照下培养。在确认根生长之后，对转化植物进行驯化。对通过潮霉素筛选获得的17个独立愈伤组织来源的转化体克隆，在第一代(TO)中通过改良提篮法测试其深根率。在导入了 Kinandang Patong来源8. 7-kbp片段的株系中，多数株系显示高的深根率，而在对照载体中，深根率与IR64相同(图I和2)。通过组合使用Southern分析和可检出转化载体中潮霉素抗性基因的序列的实时PCR系统确定导入到TO代每个植物内的转化载体的拷贝数。选择携带单拷贝基因的植物，并产生Tl种子。对于四个来自具有单拷贝TO的株系的Tl植物，根据通过实时PCR系统获得的信号强度推断其缺失型(O拷贝)、杂合型(I个拷贝)和纯合型(2个拷贝)，并评估与深根率的关联性。在所有4个株系中，具有零信号强度的植物的深根率与对照载体相同(图3)。同时，具有高强度的株系显示高的深根率。例如，D27-C的两个株系推断为缺失型，因为它们的信号强度为0，并且它们的深根率较低。同时，四个信号强度为大约10-20的株系显示中等的深根率，因此推定是杂合型；所有四个信号强度为40-70的株系显示高的深根率，因此判断是纯合型。如上所述，在具有单拷贝Drol的Tl株系中，发现深根率和被导入Drol基因的基因型分离之间存在正相关。3. 2评估Drol基因过表达植物的深根率推定基因的全长cDNA (AK068870)已经被登记在RAP-DB中。在FOX搜寻系统(全长cDNA过表达基因搜寻系统)上可以获得Tl和T2代Nipponbare的各两个株系。用于FOX株系的全长cDNA序列(SEQ ID NO: 16)与从基因组核苷酸序列确定的cDNA序列(SEQID NO:2)相比，在5’和3’端各有一个Ι-bp添加。而且，该cDNA在自其核苷酸序列5’端起373bp处(自SEQ ID NO: 25'端起372bp)具有一个G代替A的核苷酸取代。该核苷酸取代造成SEQ ID NO:3中37位的赖氨酸被谷氨酸代替的非同义氨基酸取代。通过改良提篮法对来自4个株系中每一个的5株植物进行评估，考察其深根率。结果显示，在FOX株系中，深根率的范围是8. 1-50. 0%，而10个野生型Nipponbare (对照)的比例为12. 2-23. 5%。因此，FOX株系的植物包括深根率显著高于Nipponbare的植物(图4)。结果证明，6. O-kbp候选区域中的预测基因是真实的Drol。同时，互补实验结果提示,Kinandang Patong型Drol是负责深根性的功能形式,而IR64型Drol丧失了功能或者其功能被破坏，导致浅根性。对两个具有多拷贝Drol的株系(Tl)进行评估，考察信号强度与深根率的关系。在D130-C中，发现在信号强度和深根率之间有正相关(图3)。同时，关于D91-e，在4株信号强度与具有单拷贝基因的纯合型相当(10-350)的植物中观察到信号强度与深根率正相关；然而6个具有高信号强度(500-2，000)的株系具有与载体对照相同的浅根。推定多拷贝的Drol的导入会在植物内导致基因沉默。这提示，必须调节Drol基因的表达水平，例如通过在导入时选择具有单拷贝基因的植物。[实施例4]水稻、高粱和玉米中Drol的氨基酸序列同源性使用Drol的氨基酸序列进行查询,在NCBI主页(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)通过blastn搜索与Drol同源的基因。该搜索鉴定了高度同源的基因；1个是高粱基因，另一个是玉米基因。在高粱和玉米中，与Drol具有最高同源性的ORF没有基因名称。因此，本发明人将该高粱和玉米基因分别命名为“SbDrolLl”和“ZmDrolLl”。高粱基因的氨基酸序列在NCBI主页上可以获得。同时，玉米基因的氨基酸序列可以通过基于在NCBI提取的mRNA序列进行搜索从MaizeGDB (http: //www. maizegdb. org/)获得。SbDrolLl CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。另一方面，ZmDrolLl CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示。SbDrolLl和ZmDrolLl对Drol分别显示64%和62%的同源性(图5)。[实施例5]Drol在大田条件下对深根性的影响本发明人评估了 Drol是否在大田条件下负责深根性。通过如下的方法开发用作大田试验实验材料的近等基因系(Drol-NIL)。将IR64/Kinandang Patong F1与IR64回交4次，随后进行自交。从所得的BC4F2株系，选择只就第9染色体上16. 6-19. 5-Mbp区域而言为纯合的植物，并使用这些株系的自交种子作为近等基因系。将IR64、Kinandang Patong和Drol-NIL的种子种在旱田里，并在常用的旱稻施肥管理下生长。植物在雨水灌溉条件下生长105天。用铲车将植物附近的土壤除去大约Im深。然后，通过喷水仔细洗去距离植物5cm左右的暴露表面，以便观察最大根深度。结果显不，IR64, Kinandang Patong和Drol-NIL在土壤中的根深度分别为大约20，80和40cm(图6)。Drol-NIL的根长与IR62相同。但是，Drol-NIL的根生长深度大约是IR64的两倍。因此，由于Drol的效果，根生长角度增加，结果导致Drol-NIL的根延伸更深，直到与IR64的根长相同的深度(大约40cm)。[实施例6]Dro I在用于测试抗旱的试验田中的抗旱效果本发明人测试了由于Drol导致的深根性是否可以提高抗旱性。使用IR64和Drol-NIL作为抗旱性试验的实验材料。在本发明人研究所的塑料温室中设置了与茨城农业中心植物生物技术研究所(Plant Biotechnology Institute, Ibaraki AgriculturalCenter)所用相同的抗旱试验设施(Hirayama and Suga, Nougyo Kenkyu Senta KenkyuShiryo Dai 30 Gou, Ine Ikusyu Manyuaru(Agricultural Research Center ResearchData NO. 30;Rice plant breeding manual) 152-155. 1995)进行抗旱试验。设施包括灌概区域和干旱胁迫区域。在灌溉区域中，在地面土壤上放置了用木框包围的30cm额外的表土。在灌溉区域中，在播种和收获期间对水稻间歇性浇水，以避免干旱胁迫。在栽培期间，通过置于土壤中25cm深处的张力计监视土壤水势，当水势低于大约-O. 015Mpa时便进行灌溉(图7)。一般地，植物在这个水平上不会受到干旱胁迫的影响。同时，在干旱胁迫区域中，在试验田床土(bed soil)上铺设10_mm碌石(5cm厚)，在上面设置25cm额外的表层土，以阻断来自土壤的毛细管水。在这样的安排下，当终止灌溉后额外表层土中的土壤水含量逐渐减少，植物将暴露于干旱胁迫。在干旱胁迫区域中，在播种第2个月后终止灌溉，并且在第一个穗出现之前不给植物浇水。在终止灌溉后的第10天，25cm深度的土壤水势减少到-O. 07Mpa。结果，在干旱胁迫区域实现了干旱胁迫条件(图7)。另一方面，在40cm土壤深度，在整个干旱处理期间，水势稳定在大约-O. 03Mpa左右。因此，在这个深度并没有实现干旱胁迫条件。在干旱胁迫区域，IR64在终止灌溉35天后观察到卷叶，提示干旱胁迫效应。对比地，在具有Kinandang Patong型Drol的IR64(Drol-NIL)中则没有检测到卷叶(图8)。随后，胁迫区域中IR64的卷叶程度增加，在第49天，植物生长显示被严重抑制。同时，在Drol-NIL中，卷叶的程度甚至在第49天仍然较低，与IR64相比，植物生长旺盛。在干旱胁迫区域中终止灌溉35天后，DioI-NIL的平均叶片温度比IR64低O. 7° C(图9)。Drol-NIL的叶片温度在每个测量日均显示比IR64更低。而且，还在第34和41天对IR64和Drol-NIL测量了 2次气孔导度和光合速率。结果显示，Drol-NIL的这两个数值均显著大于IR64(图9)。在干旱胁迫区域出现第一个穗之后，再次给植物浇水以便水稻谷粒成熟。每个植物单独收获，对其草杆长度、穗长度、穗数、穗重、实粒数目和地上部分的干物质重量进行评估。IR64和Drol-NIL之间在茎杆和穗长上没有观察到显著差异。同时，地上部分的干重、穗数、穗重和实粒的数目在IR64和Drol-NIL之间有显著差异(图10)。特别地，Drol-NIL中实粒的数目比IR64高大约3. 8倍。为了确认Drol-NIL的深根性是否是这 一结果的原因，对试验田进行了解剖，以观察根是否穿透了砾石层。结果显示，DioI-NIL的根穿透了砾石层而进入到了更深的土壤层，而IR64的根则不能穿透砾石层(图11)。上述发现证明，水稻通过由Drol赋予的深根性获得了抗旱性，使光合能力和产量增加。同时，用通过检测从对象发射的红外能并将其转变成表观温度从而显示温度分布图像的设备(红外热成像仪)测量叶片温度。具体地，通过在一定距离之外的红外热成像测量水稻在干旱胁迫条件下的叶表面温度。然后，将图像输出到专用软件，以确定图像上植物的平均叶片温度。光合速率的评估是通过将叶片置于通以含恒定浓度二氧化碳的空气的小室中，并测量室内输出空气中二氧化碳的降低。同时，通过测量从含有叶片的小室输出的空气中水蒸汽含量的增加评估气孔导度。具体地，数值的确定如下。将来自干旱胁迫条件下水稻的叶片在光合蒸腾作用测量系统的小室内完全展开夹持一定的时间。将同一展开叶片测量三次，以确定平均值。[实施例7]DroI在严重干旱的旱田中的抗旱效果在实施例6中，Drol被证明可以在测试抗旱性的试验田中导致抗旱性。接下来，本发明人评估Drol是否能够在自然环境的农田中在更严重的干旱胁迫下导致抗旱性。使用IR64和Drol-NIL在施肥(N:P:K=12:12:9kg/10a)和不施肥的三块重复旱田区域内进行实验。在每个区域(3m X 3m)中，种植200株植物，行距30cm，株距15cm。200株植物由100株IR64和100株Drol-NIL组成。植物在培养期间不浇水。这样，因为在播种后I个月_90天没有降雨，干旱胁迫条件较为严重，并且在40cm土壤深度处平均土壤水势为-O. OSMpa以下(图12)。在这种干旱胁迫条件下，Drol-NIL几乎检测不到卷叶，而IR64在两个区域中均观察到严重的卷叶(图13)。特别地，在没有施肥的区域中，DioI-NIL中几乎检测不到卷叶，而IR64显示出卷叶，并且与Drol-NIL相比，抽穗日期显著延迟。在收获季节通过四分区法对产量进行估计。在所研究的5个参数中，Drol-NIL在4个参数上显著大于IR64，即穗数、地上部分干重、总粒重量和实粒重量(表I)。94.
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1_I I_I I_I而在施肥的区域中增加到7. 8倍。这个发现证明，Drol在农田的自然栽培环境中，即使在干旱条件下也会导致抗旱。[实施例8]用于检查Drol基因中单核苷酸缺失的存在的标记因为IR64的Drol基因序列在其外显子4中具有一个碱基的缺失，所以设计了 PCR标记用于检测该缺失的存在。设计了两种类型的标记SNP02-KP(引物5’-GTCTAGATCACGCAGTGAAT-3’ (SEQ ID NO:8)和 5’-TCGCATGATGATGACCAAGT-3’ (SEQ ID NO:9)),其只有在Kinandang Patong 型 DNA 存在下才被扩增，和 SNP02-IR64 (引物5’ -ATCGTCTAGATCACGCAGTGAAC-3’ (SEQ ID NO: 10)和 5’-AGGGTGGCTTTACCTCCGTA-3’ (SEQ ID NO: 11))，其只有在IR64型DNA存在下才被扩增。PCR 混合物每个反应(15yL)中含有 0·2μΜ 引物，0.6U Tag, O. 2mMdNTPs, 2mMMgCl2,和 20ng DNA。PCR 反应条件如下(1)95。C 2 分钟;(2)94° C 30 秒;(3)退火 30 秒，退火温度范围是51. 8-62. 2° C 30秒；(4)72° C I分钟；和(5)72° C 7分钟；对于SNP02-KP,反应(2)-(4)共25个循环；对于SNP02-IR64，反应(2)-(4)共30个循环。对PCR产物进行电泳。结果显示，SNP02-KP只有当使用Kinandang Patong DNA时才能被扩增，而SNP02-IR64只有在使用IR64DNA时才能被扩增(图9)。工业实用件本发明提供了 Drol基因，其控制植物如水稻的深根，以及用该基因转化的植物。通过操纵Drol基因将浅根性植物变成深根性植物预期可以产生具有更高避旱能力的植物。作为另一选择，通过操纵Drol基因使得深根植物变成浅根植物可以赋予植物耐湿性。干旱导致世界粮食产量严重减少。同时，在日本，因为稻田的排水效力较差，湿损害对于没有耐湿性的大豆和玉米也是问题。本发明可用于解决这些国内和国际问题。
权利要求
1.下面(a)-(e)中任一项的DNA: (a)包含SEQID NO: I的核苷酸序列的DNA ； (b)包含SEQID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的编码区的DNA ； (c)编码包含SEQID NO:3，13和15中的任一氨基酸序列的蛋白质的DNA ； (d)在严格条件下与包含SEQID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA杂交，并且具有赋予植物深根性表型的活性的DNA ;或者 (e)编码包含与SEQID NO:3, 13和15中的任一氨基酸序列相比有一个或多个氨基酸替换、删除、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，并且具有赋予植物深根性表型的活性的 DNA。
2.权利要求I的DNA，其中所述植物是单子叶植物。
3.权利要求2的DNA，其中所述单子叶植物是禾本科植物。
4.权利要求3的DNA，其中所述禾本科植物选自下组稻、麦类(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龙山稷、珍珠粟、埃塞俄比亚画眉草、甘蔗、猫尾草、草地早熟禾、鸭茅、意大利黑麦草、多年生黑麦草、苇状羊茅和百喜草。
5.权利要求3的DNA，其中所述禾本科植物选自下组水稻、高粱和玉米。
6.—种载体,包含权利要求1-5中任一项的DNA。
7.一种转化细胞，其以可表达的方式包含权利要求1-5中任一项的DNA。
8.一种用权利要求1-5中任一项的DNA转化的植物，其具有深根性表型。
9.一种通过将权利要求1-5中任一项的DNA或权利要求6的载体导入植物细胞内而产生的转化植物，其具有深根性表型。
10.一种转化植物，其是通过如下的步骤(a)-(d)获得的 (a)将权利要求1-5中任一项的DNA或权利要求6的载体导入植物细胞中； (b)确定步骤(a)中的植物细胞内的权利要求1-5中任一项的DNA的拷贝数； (c)选择含有单拷贝的被导入的DNA或载体的转化植物细胞；和 (d)从步骤(c)中选择的转化植物细胞再生植物， 并且其具有深根性表型。
11.权利要求8-10中任一项的植物，其中所述植物是单子叶植物。
12.权利要求11的植物，其中所述单子叶植物是禾本科植物。
13.权利要求12的植物，其中所述禾本科植物选自下组水稻、麦类(小麦、大麦、黑麦、燕麦和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龙山稷、珍珠粟、埃塞俄比亚画眉草、甘蔗、猫尾草、草地早熟禾、鸭茅、意大利黑麦草、多年生黑麦草、苇状羊茅和百喜草。
14.权利要求12的植物，其中所述禾本科植物选自下组水稻、高粱和玉米。
15.一种转化植物，其是权利要求8-14中任一项的转化植物的后代或克隆。
16.从权利要求8-15中任一项的转化植物分离的细胞。
17.权利要求8-15中任一项的转化植物的繁殖材料。
18.从权利要求8-15中任一项的转化植物分离的器官。
19.从权利要求16的细胞、权利要求17的繁殖材料和权利要求18的器官中的至少一个制备的加工食品。
20.一种用于产生权利要求8和11-13中任一项的转化植物的方法，其包括下述步骤将权利要求1-5中任一项的DNA或权利要求6的载体导入植物细胞，以及从该植物细胞再生植物。
21.权利要求20的方法，其进一步包括选择具有单拷贝的权利要求1-5中任一项的DNA的转化植物细胞或转化植物的步骤。
22.一种用于评估植物是否具有深根性表型的方法，其中当分子量或核苷酸序列相同时则判定测试植物具有深根性表型，该方法包括下面的步骤(a)-(c) (a)从测试植物制备DNA样品； (b)从该DNA样品扩增包含权利要求1-5中任一项的DNA的区域；和 (c)将扩增的DNA片段的分子量或核苷酸序列与权利要求1-5中任一项的DNA进行比较。
23.一种用于评估植物是否具有深根性表型的方法，其中当获得了扩增产物时则判定测试植物具有深根性表型，该方法包括使用包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的引物并使用从该测试植物制备的基因组DNA作为模板进行PCR的步骤。
24.一种用于评估植物是否具有深根性表型的方法，其中当获得了扩增产物时则判断测试植物不具有深根性表型，该方法包括使用包含SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的引物并使用从该测试植物制备的基因组DNA作为模板进行PCR的步骤。
25.一种用于选择具有深根性表型的植物的方法，其包括如下的步骤(a)和(b) (a)通过将任意植物与具有深根性表型的植物进行杂交产生栽培种；和 (b)通过权利要求22-24中任一项的方法评估步骤(a)中获得的植物是否具有深根性表型。
26.一种蛋白质，其由权利要求1-5中任一项的DNA编码。
27.一种抗体，其结合权利要求26的蛋白质。
28.—种DNA，其包含至少15个与权利要求1-5中任一项的DNA或其互补序列互补的连续核苷酸。
29.—种DNA，其包含SEQ ID NO:4-11中任一项的核苷酸序列。
全文摘要
为了提供可控制植物深根性的基因、导入了该基因的转基因植物和使用该基因用于控制植物深根性的方法等，对能够控制植物深根性的遗传座位(Dro1座位)尝试了高分辨率连锁分析，该座位是在大规模分离群体中在浅根稻栽培种IR64和深根稻栽培种Kinandang Patong之间发现的。结果显示，Dro1的基因区域位于夹在InDel标记Dro1-INDEL09和CAPS标记Dro1-CAPS05之间的6.0kbp的区域内。而且已经证实，用Kinandang Patong型Dro1基因转化的转基因植物具有显著升高的深根率。还证实，具有Kinandang Patong型Dro1基因的植物具有抗旱性。
文档编号C12Q1/68GK102918154SQ201080064708
公开日2013年2月6日 申请日期2010年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者宇贺优作 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所