胰升糖素样肽－1受体基因多态性与2型糖尿病的相关性的制作方法

专利名称：胰升糖素样肽－1受体基因多态性与2型糖尿病的相关性的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域。更具体地涉及人胰升糖素样肽-1受体基因(glucagon-like peptide 1 receptor，GLP1R)的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其与2型糖尿病的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。
背景技术：
糖尿病是一组以糖代谢异常为特征的由不同病理生理改变组成的综合征，不同患者之间具有较大的异质性，而其主要的两种病理生理改变为胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗。
虽然已开展了一些2型糖尿病相关基因及多态性的研究，但在本发明之前没有证实GLP1R基因多态性与2型糖尿病相关性的报道，更没有与2型糖尿病相关性的报道。
综上所述，鉴于糖尿病严重影响人们身体健康的疾病，为了尽早诊断和治疗2型糖尿病，本领域迫切需要寻找2型糖尿病易感基因，并开发检测2型糖尿病的方法、试剂盒，或相关的治疗药物。

发明内容
本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断)2型糖尿病的方法及检测试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种对个体的2型糖尿病易感性进行诊断的方法，它包括步骤检测该个体的GLP1R基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GLP1R基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患2型糖尿病的可能性高于正常人群。
在另一优选例中，所检测的是GLP1R的基因或转录本，并与正常GLP1R核苷酸序列比较差异。
在另一优选例中，所述的差异是选自下组的单核苷酸多态性4347位G A且该位点的基因型是AA；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在GLP1R基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤(a)用GLP1R基因特异性引物扩增样品的GLP1R基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性4347位G A且该位点的基因型是AA；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤对样品提供者的进行BMI指数分析。
在本发明的第三方面，提供了一种辅助性检测2型糖尿病的试剂盒，它包括特异性扩增GLP1R基因或转录本的引物和说明书。
在另一优选例中，所述的试剂盒它还含有选自下组的试剂(a)与突变部位结合的探针；(b)识别突变位点的限制性内切酶。
在另一优选例中，所述的突变是选自下组的单核苷酸多态性4347位G A；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在另一优选例中，所述的引物包括序列如SEQ ID NO2、3和4所示的引物。
在本发明的第四方面，提供了一种GLP1R基因和蛋白的用途，它们被用于制备辅助性检测2型糖尿病的试剂。


图1显示了GLP1R的rs2268657位点的SNP图像。
具体实施例方式
本发明人经过多年研究，首次发现和证明了GLP1R基因与2型糖尿病密切相关。本发明人对GLP1R基因中多个区域进行了测序和SNP分析，其中关联研究结果显示，在GLP1R第rs2268657位点(对应于SEQ ID NO1中的4347位)的基因型AA在正常人与BMI＜25的正常体重组相比频率有显著差异(OR＝1.939，P＝0.022)，而与BMI＞28的肥胖糖尿病患者组相比无显著差异。这提示，GLP1R基因多态性位点rs2268657与胰岛素分泌不足为主的2型糖尿病相关，可用于辅助检测2型糖尿病。在此基础上完成了本发明。
具体而言，本发明人选取无亲缘关系的2型糖尿病患者360例及正常对照313例，其中糖尿病患者分为肥胖组192人(BMI＞28，且仅用口服降糖药治疗)及正常体重组168人(BMI＜25，且用胰岛素治疗)，采用等位基因特异的实时PCR(allele-specific real-time PCR)，对GLP1R基因位点rs2268657进行基因分型，并通过相关分析研究该位点与2型糖尿病的相关性。
结果表明，GLP1R基因rs2268657位点基因型频率在对照人群中AA、AG、GG分别为27，140，146；在正常体重糖尿病组中AA、AG、GG分别为26，63，79，在肥胖糖尿病组中，AA、AG、GG分别为21，96，75基因型AA在正常人与BMI＜25的正常体重组相比频率有显著差异(OR＝1.939，P＝0.022)，而与BMI＞28的肥胖糖尿病患者组相比无显著差异。该研究结果提示GLP1R基因多态性位点rs2268657与胰岛素分泌不足为主的2型糖尿病有关。
如本文所用，术语“GLP1R”和“胰升糖素样肽-1受体”可互换使用，都指胰升糖素样肽-1受体的蛋白分子或核酸分子。
GLP1R基因的详细序列可参见登录号为Hs.389103的核苷酸序列(可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，全长是38903bp(SEQ ID NO1)。rs2268657位点对应于SEQ ID NO1中的第4347位。
基于本发明的新发现，GLP1R蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)辅助性检测与GLP1R相关的疾病(如2型糖尿病)，或筛选促进GLP1R蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人GLP1R蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人GLP1R蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人GLP1R DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人GLP1R基因产物或片段。较佳地，指那些能与人GLP1R基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人GLP1R蛋白的分子，也包括那些并不影响人GLP1R蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人GLP1R基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人GLP1R蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人GLP1R蛋白功能的抗体以及不影响人GLP1R蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人GLP1R基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人GLP1R基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人GLP1R蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人GLP1R蛋白。一种优选的抗GLP1R抗体是不识别正常GLP1R但识别突变GLP1R的抗体，或者识别正常GLP1R但不识别突变GLP1R的抗体。利用该抗体对正常和异常GLP1R蛋白的特异性差异，可以方便地进行蛋白质水平的2型糖尿病易感性检测。
利用本发明GLP1R蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与GLP1R蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明GLP1R蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。
在本发明的药物组合物中，含有安全有效量的与GLP1R蛋白有关的活性成分(如GLP1R蛋白或其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的GLP1R蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还涉及定量和定位检测人GLP1R蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。
一种检测样品中是否存在GLP1R蛋白的方法是利用GLP1R蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与GLP1R蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在GLP1R蛋白。
GLP1R蛋白的多聚核苷酸可用于GLP1R蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，GLP1R蛋白的多聚核苷酸可用于检测GLP1R蛋白的表达与否或在疾病状态下GLP1R蛋白的异常表达。如GLP1R DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断GLP1R蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用GLP1R蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GLP1R蛋白的转录产物。
检测GLP1R基因的突变也可用于诊断2型糖尿病。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。GLP1R蛋白突变的形式包括与正常野生型GLP1R DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。一类优选的突变是GLP1R的SNP，尤其是rs2268657位点的SNP。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的主要优点在于首次用实验证实了GLP1R的改变与2型糖尿病的密切相关性，进而提供了辅助性诊断2型糖尿病(或易感性)的方法和试剂盒。本发明可以为临床诊断(尤其是早期诊断)2型糖尿病提供极为有价值的辅助性参考指标，从而有利于实现2型糖尿病的早诊断、早预防、早得益。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1本发明人对小样本范围内，对GLP1R基因中多个区域进行了测序和SNP分析，其中关联研究初步结果显示，在GLP1R第4347位点是一个内含子上的多态性位点，该位点rs2268657与2型糖尿病存在相关性。为了进一步明确该位点是否与中国汉族人2型糖尿病相关，重新随机选择了检测人群，进行相关性研究分析。
一、对象与方法1)研究对象全部研究对象均来自中国地区，彼此间无血缘关系。其中正常人共316人，2型糖尿病患者(符合1999年WHO诊断标准)(Report of a WHO consultation.Definition，diagnosis and classification of diabetes mellitus and itscomplications.GenevaWorld Health Organization，199952.)共366人，2型糖尿病患者又根据体重指数(BMI计算＝体重(Kg)/身高2(M2))分为肥胖组和正常体重组，肥胖组共197人，BMI＞28m2/kg，且仅用口服降糖药治疗，正常体重组共169人，BMI＜25，且用胰岛素治疗，所有入选对象均行75g口服葡萄糖耐量试验(BECKMAN LX20生化仪，葡萄糖氧化电极法)，其中正常人空腹血糖＜6.1mmol/L及餐后血糖＜7.8mmol/L，糖尿病患者空腹血糖＞7.8mmol/L和/或餐后血糖＞11.1mmol/L，并根据个人史和家族史排除1型糖尿病、MODY及母系遗传的糖尿病。
体格测量方法受试者拖鞋、仅穿内衣、测量身高和体重。
身高测量方法——被测者赤足，足跟并拢，足尖分开成60°角，上肢自然下垂，躯干自然挺直，足根、骶骨部及两肩胛间与墙面保持接触，头部摆正，但不必紧靠墙面，两眼平时前方，保持耳屏上缘于眼眶下缘处于同一水平线，测量者站于被测者侧方，量出头顶水平面距地面的高度。
体重测量方法——被测者尽量少着衣轻轻站于秤中央，待示数稳定时读数。

2.基因分型原理本次实验采用等位基因专一PCR与荧光实时PCR相结合进行基因分型，其基本原理为在DNA多态位点的5’上游设计二条引物，使引物的3’端最后一碱基正好处在被检测的多态位置上，其中一条引物的3’碱基与一种等位基因相匹配，而另一条引物则与另一种等位基因匹配。使用3’端特异性识别的DNA聚合酶，该酶能特异地识别引物3’末端的核苷酸，只有当该位置的核苷酸与模板完全匹配，反应才能继续下去，如不匹配，反应效率则大大降低，另外在反应体系中加入Sybergreen荧光染料，该荧光染料可以和双链DNA结合并在激光的激活下发出荧光，其强度和双链DNA的量呈正比，荧光信号在每个循环结束后被检测并记录，整个PCR反应结束后就得到每个样品两种不同引物对的荧光曲线。通过比较不同引物PCR过程中每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所对应的循环域值(Ct)来判断该样品是哪一种基因型。如两种引物的循环域值相差(ΔCt)5以上，则为纯合子，循环域值相差1以下为杂合子，介于1和5之间的样品重复实验至明确分型。
3.方法1)DNA抽提所有对象抽外周静脉血3毫升，并按常规酚/氯仿法抽提基因组DNA。
a.3ml新鲜血液，加0.8ml枸橼酸葡萄糖溶液(ACD)的试管中混匀，及时抽提DNA或-70℃冻存待以后抽提DNA；b.抗凝血3ml移入50ml塑料离心管中(冻存血液于室温水浴中融化后操作)，加入10ml预冷的溶血试剂，充分混匀；c.冰浴10分钟，4℃下5000rpm 10分钟，弃上清，沉淀加入10ml溶血试剂，重复本步骤一次；d.白色沉淀中加入4ml核悬液，轻轻混匀；e.加入100ul 50℃预热的10％SDS，再加入40ul蛋白酶K(20mg/ml)，使终浓度为200ug/ml，于45℃100次/分轻轻振荡过夜，充分消化；f.加4ml TE于上述已消化溶液中，该步骤可根据实际消化情况选择加TE或不加TE；g.再于上述离心管中加入等体积Tris平衡酚(PH8.0)，轻轻混匀成乳白状，4℃下6000-7000rpm离心10分钟，将上清液移入另一清洁50ml离心管；h.重复步骤g；i.向上述上清液中加入等体积新鲜配制的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合液，轻轻混匀，离心同上。将上清液移入另一清洁50ml离心管；j.向该上清液中加入1/10体积的醋酸钠溶液(3mol/L)及2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒至絮状沉淀析出；k.絮状沉淀析出30-60分钟后，用无菌Tip(高压过)挑出沉淀，放入事先加有无水乙醇的1.5ml Eppendorf管中，13000rpm离心20分钟，弃乙醇，DNA置于敞开的管内自然干燥，直至可见的痕量乙醇挥发殆尽。加入600ulTE将DNA溶解；
l.测定DNA样品在260nm和280nm处的吸光度，A260/A280比值在1.8左右说明抽提质量较好，将测定好的DNA编号、分装、-20℃冻存待用。
2)PCR反应利用罗氏公司的专用软件SNP PRIMER DESIGN来设计，设计原则是以突变位点作为上游引物的3’端，设计两条特异引物，下游设计一条公共引物，片断长度35-60bp之间，引物长度15-23bp。设计和合成如下引物上游引物1CTTGTTGGATCTGTGCAGTT；(SEQ ID NO2)上游引物2TTGTTGGATCTGTGCAGTC；(SEQ ID NO3)下游公共引物CCAGTTCTGCCGTCCATAAAATG；(SEQ ID NO4)产物序列CTTGTTGGATCTGTGCAGT[T/C]TGAGAAGAATGATATGCCCATTTTATGGACGGCAGAACTGG。使用荧光实时定量PCR仪进行PCR反应，反应程序如下95℃ 10分钟，预热，95℃30秒，58℃30秒，共45个循环，每个循环结束时，自动检测荧光信号。
3)反应体系以每孔50ul反应体系计算，96孔板可作44个病人样本，在每孔中分别加入下列混合物

再在两个管中分别加入特异引物1和引物2，1ul(浓度为20ng/ml)，振荡混匀，取专用于荧光PCR的96孔板(AXYGEN)，每孔加入DNA模板1ul(浓度20ng/ul)，相邻的上下两排所加样本一样，将所加的混合体系加入板中每孔加49ul，隔行加入含引物1和引物2的混合体系。使用荧光PCR仪ABIPRISM 7000(ABIBiosystem)。
4)实时PCR结果判断不同的等位基因扩增的情况不同，通过比较两条Ct曲线与所设定的阈值的交点的Ct值(Ct1，Ct2)的差值ΔCt来判断基因型。ΔCt＝Ct1-Ct2，如果ΔCt＞5，则为A等位基因的为纯合子；ΔCt＜-5则为B等位基因的纯合子；|ΔCt|＜1，则为杂合子(图1)。
5)试剂及仪器DNA抽提试剂蛋白酶K(Merk公司)ACD抗凝剂柠檬酸0.48克+柠檬酸钠1.32克，加双蒸水至94毫升，高压灭菌后，加6毫升25％葡萄糖针剂；溶血试剂蔗糖109.54克+1M Tris-HCl 1毫升+1M MgCl25毫升+TritonX-100 10毫升，加双蒸水至1000毫升，混匀；核悬液5M NaCl 7.5毫升+0.5M EDTA 24毫升，加双蒸水至500毫升；10％SDSSDS10克+双蒸水80毫升，用1M的HCl调PH至7.2，定容至100毫升；TE缓冲液1M Tris-HCl 2.5毫升+0.5M EDTA 0.5毫升，加双蒸水至250毫升；10000×荧光染料SyberGreen购自基因公司；5×荧光PCR缓冲液Tricine8.96克+乙酸钾4.907克+乙酸镁0.6434克，加双蒸水至1000毫升，用1M的NaOH调PH至7.4-7.6(AMRESCO公司)；DMSO(SIGMA)；等位基因特异的DNA聚合酶Delta Z05 Gold DNA Polymerase(ROCHE)；实时定量PCR采用ABIPRISM 7000(ABI Biosystem)；BioPhotometer分光光度仪(Eppendorf)；Cyberscan2500 PH计(EUTECH)；5818 R低温离心机(Eppendorf)。
6)统计学分析采用SPSS分析软件(SPSS Inc)进行统计分析，等位基因频率组间差异显著性检验采用Pearson X2检验，基因型与疾病相关性分析采用Logistic回归分析，并以比数比(OR)表示。Hardy-Weinberg平衡分析使用X2检验，并用FINETTI程序(http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwal.pl)进行统计分析。
二.结果GLP1R基因多态性位点rs2268657等位基因及基因型频率分布见表2，经检验基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡。等位基因频率分布(A/G)在各组中无显著差异，但基因型AA/AG+AA的频率分布有差异。
AA基因型在正常体重糖尿病组中明显高于正常对照组(X2＝5.23，P＝0.022，OR＝1.939)(见表3)，而与肥胖型糖尿病组相比无显著差异。表明等位基因A在隐性遗传模式下与体重正常的2型糖尿病发病相关，与肥胖的2型糖尿病发病无关。
表2.对照组及糖尿病不同亚组间等位基因及基因型频率分布

表3.不同遗传模式下等位基因A与糖尿病相关性分析

结果提示，GLP1R基因rs2268657位点的SNP与2型糖尿病存在相关性。等位基因A在隐性遗传模式下与体重正常的2型糖尿病发病相关，与肥胖的2型糖尿病发病无关。
三.讨论早在1986年Holst等就发现胰升糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1GLP1)具有刺激葡萄糖诱导的胰岛素分泌作用，其后又发现GLP1能显著提高胰岛B细胞对葡萄糖的敏感性，改善NOD小鼠的B细胞反应性。研究表明GLP1的作用是通过胰岛B细胞膜上的特异受体胰升糖素样肽-1(GLP1R)介导的，与胰岛素分泌有着重要的关系(陈月，陈家伦.胰升糖素样肽-1及其对血糖水平的调控.Chinese Journal of Diabetes，October 1999，Vol 7，No5290-291)。
口服葡萄糖较同等剂量的葡萄糖静脉注射可引起血浆胰岛素水平更大幅度的提高，这种糖肠促胰岛素作用是由于某些胃肠激素被释放入血，作用于胰岛B细胞，强化葡萄糖诱导的胰岛素分泌过程所致。这些激素被统称为肠促胰岛素(incretin)，其中抑胃肽(GIP)及胰升糖素样肽-1(GLP-1)被认为是最重要的两种与糖调节有关的肠促胰岛素。研究表明GIP及GLP-1共同作用才能得到全部肠促胰岛素效应，其中GIP的作用占30％，而GLP-1占70％。因此，GLP-1是肠-胰岛轴中重要的激素介质[Fehmann HC，Goke R，and Goke B.At the cuttingedgeGlucagon-like peptide-1(7-37)/(7-36)amide is a new incretin.Mol Cell Endocrinol，1992，8539；Goke R，Fehmann HC，Linn T，etal.Exendin-4 is a high potency agonist and truncated exendin-(9-39)-amide and antagonist at the glucagon-like peptide 1-(7-36)-amidereceptor of insulin- secreting beta-cells.J Biol Chem，1993，26819650.]。而GLP-1的作用是通过胰岛B细胞膜上的特异受体GLP1R介导的。人GLP1R基因位于第6号染色体短臂上，编码一个463个氨基酸的蛋白质，含有七个为跨膜片断，属于异三聚体G2蛋白偶联受体超家族(HeterotrimericG-protein coupled receptor superfamily)，该受体在胰岛、肺、下丘脑及胃中有高水平mRNA表达，GLP-1与胰岛B细胞表面GLP1R结合，可以调控细胞内cAMP及钙离子水平，最终起到了强化葡萄糖诱导的胰岛素分泌作用[Leech CA，Holz GG，Habener JF.Signal transduction of PACAP and GLP-1 in pancreatic betacells.Ann N Y Acad Sci，1996，Dec 26；80581-92；discussion 92-3；HolzGG，Leech CA，Habener JF.Activation of a cAMP-regulation Ca2+ -signaling pathway in pancreatic beta-cell by the insulinotropic hormoneglucagons-like pep tide-1.J Biol Chem，1995，27017749；Perfetti R，Merkel P，Glucagon-like peptide-1a major regulator of pancreatic βcell function，Eur J Endocrinol，2000，143717-25]，GLP1R基因剔除小鼠会出现糖耐量异常及血胰岛素水平降低，特别是葡萄糖刺激后的胰岛素释放减少(Scrocchi L，Brown T，Maclusky N，et al.，Glucose intolerance butnormalsatiety in mice with a null mutation in the glucagon-like peptide1 receptor gene.Nat Med，1996，21254-8)。
上述研究表明，GLP1R与胰岛B细胞胰岛素分泌功能有着密切的联系。本发明研究了GLP1R内含子中的一个多态性位点rs2268657与与中国汉族人2型糖尿病之间的相关性。由于糖尿病是一组以糖代谢异常为特征的由不同病理生理改变组成的综合征，不同患者之间具有较大的异质性，而其主要的两种病理生理改变为胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗，因此如果能对这些不同病理改变组成的糖尿病人群进行分层，使其成为病因相对单一的疾病人群，则将有助于易感基因的检出效率。通常胰岛素分泌和胰岛素敏感性可通过钳夹试验或HOMA指数加以评估，但钳夹试验由于其操作复杂、代价昂贵，无法用于大规模的临床试验，而HOMA指数虽然可粗略评估个体的胰岛素分泌情况和胰岛素敏感性，但该指标会受到病程、药物治疗及检测方法的灵敏度及稳定性等因素的影响。
本研究尝试使用更加简单，同时相对稳定的指标对糖尿病人群进行分析，按体重指数分成正常体重组(BMI＜25)和肥胖组(BMI＞28)，其中正常体重组均为用胰岛素治疗的患者，而肥胖组则仅用口服降糖药治疗。现有的资料表明，前者的病理改变多以胰岛素分泌不足为主，而后者的病理改变多以胰岛素抵抗为特征，虽然两种病理改变可同时存在。本发明研究证明了GLP1R的多态性位点rs2268657与正常体重且用胰岛素治疗的糖尿病人群相关，而与肥胖且仅用口服降糖药治疗的糖尿病人群无显著的相关关系。从目前的研究来看，GLP1R的作用主要与胰岛素分泌有关，因此本发明提示rs2268657位点可能与以胰岛素分泌不足为特征的2型糖尿病有关。
当然，由于该多态性位点位于基因的内含子，因此这一多态性是否会直接引起基因的功能或表达改变，或者仅仅是与真正的致病性多态性位点呈连锁不平衡的一个多态性标志，还有待于进一步的研究证实。本发明同时也表明，通过一些简单的临床指标，如BMI、药物治疗情况等将病人进行初步的分层，有助于降低病人的异质性，并提高相关分析的检出效率。
实施例22型糖尿病易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有

抽取待检测90名随机对象(BMI＜25)的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。按实施例1相同的方法，将2型糖尿病检测试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/μl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应，并进行荧光实时PCR检测，从而判断GLP1R基因多态性位点rs2268657处的基因型。
检测结果如图1所示。其中，对基因型AA的检测对象再进行常规的空腹血糖及糖耐量检测法检测是否患有糖尿病。结果表明，基因型为AA的18名检测对象中有12位患2型糖尿病。这项检测可以在常规方法未能检测出糖尿病的之时，反映受测者罹患糖尿病的可能性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市内分泌代谢病研究所<120>胰升糖素样肽-1受体基因多态性与2型糖尿病的相关性<130>050054<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>38903<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<400>1atggccggcg cccccggccc gctgcgcctt gcgctgctgc tgctcgggat ggtgggcagg 60gccggccccc gcccccaggt gagatccagg gaccccgacg acaccggggg aggcgggtgg120ctctgcgggc tgcaggcgca gtgtcctggt ggagggcccc gggacttgaa cgaaactccg180agaccgctgg cgggggcatc cgaaagcctc ggggggagta gggactggag acttggtgcc240cctgggctgg aaggcccagg tgagggcttg gactacagag gattcccccc aaccccagcg300aggcgccctc ttcctcgcca cccgggtccc tctgcccggg cacccgctgc cccgcggccg360ccctgcgctg acttctgctc cgcttctcct ttgtccccag cactttccca actccttcta420aaccgtgtca gcggccctgg cacagcccgg catcctcccg gactccctct gccccacagt480ctgacccaga cccctctccc gcagtgcctc cccagacaat ccacctgctc aaagaccctg540agaagaccct gggaggagct gagagggcca gggtgcggag acccggctcc tctccctttc600tcatcagccc ccagcacagc ctttgattca tggctcctgg ggccctgcgg tggcagcttg660tccttcccag tgacctccca gatggaacct accccccgtc ccctaccagc ctctgtagca720aacaggcaga aggctcagtg cccccctgga agcagccagg cgcccccact cacccactct780gctgacctcc cattctcatc ctgcactgac agcaggcccc aagagaaggc atactgggac840acgcaagaac acctgggctc cttggtgcca ccagagagca ggccacaggt ggaccaccgc900agcccctctc tcttgccctt gttgcttttc ctgccctggg atcctgggct agggacagtg960gtcagctgct tttgaagagg ggagctgtcc aaagatgctg ggacttgctt gagcagagag 1020gagacataga cttgggtggc ctgtcctggg tcaggaaaca ggttcttcct atcacctccc 1080actgctaccc ccagacctaa agaactgaga tctgtgggga gtggacctga acgaaccttg 1140aagtttgtcc cagaaccatt gccttggtga gggcagactc cacctcggcg gaaaccccag 1200atgtggacag acatacctct cagctaagat gccagcacat ttttcagccc ccagattatt 1260ttccagacgc atcctctccc tgcccctgtt ccccagccca gctgctgtcc tgagccccag 1320gagacaacct cccccttcca agacaccttc ctcacagcgc ccccagccag gccttggttt 1380tcctggtgcg gctgggatct ttcaggggcc agggctgcag acccaagatg tggttcttgc 1440ccatcgttcc ctcctcttac ggactgggtt gggatagggg tggaggctct gcttcctggt 1500tccatcctcc tccaggccag gtttacaggt ctggtttgaa tgaagggaag aaagcaaagg 1560gaagaggaaa gtttctgtga gctgtcttcc cagaggcctt attcccagaa gtgtcaggct 1620cctgaaccca cactttcctc tgatccgatt ttactcctta gccccaggcc taaggcaaaa 1680gctgggcatc ctgggggcat aacaggattg gggtggtaga gaaggatagg aggggacagg 1740tcctagcagg gaggggagct ttgagggggt gctcttgtca tgggaaactg agctgccaca 1800gagatctgag tcacaggagg tgttaaggat agattgcaac aattatgaca caacatcatg 1860cgtgcttata agactaaaaa atagtgtatt ttgcattttg ttttctgtct atgaagtcaa 1920aagggttaga gttactcccc tcatgttgct gatgggggaa tgaaagctca gaaaaagagg 1980gtcccctgta taaagtagcc cagcagttca ggagcaggga agagaaaggg gtgaagggct 2040gggctcttga cctaacacct cctactcaga cgggactgaa gggagacctc tgagagtgag 2100ctgctcactg tcaggtctcg tgaggctgga aacagcatcc ctgcaggtag ggggatggct 2160gagttgactt ctgaagaagg tgccctaggc tactctttca ttgctgctgg gaaggctcat 2220tcccctaccc tggtccttac ctctccaata ccctggtgag ggagcgggcc tactgaggag 2280acaggcaagc ctttgacact caaagttaaa atcagacaca actggattca aatatagggt 2340ctgctattag ctggtgatct ggagttggac acttggttat ccccaataca tgtccttatc 2400tgtaaataag gatcataagc tctatcacat agggttatgg aggggattga gacactggcc 2460
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1.一种对个体的2型糖尿病易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤检测该个体的GLP1R基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GLP1R基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患2型糖尿病的可能性高于正常人群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的是GLP1R的基因或转录本，并与正常GLP1R核苷酸序列比较差异。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差异是选自下组的单核苷酸多态性4347位GA且该位点的基因型是AA；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
4.一种检测样品是否存在GLP1R基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤(a)用GLP1R基因特异性引物扩增样品的GLP1R基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性4347位G A且该位点的基因型是AA；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤对样品提供者的进行BMI指数分析。
6.一种辅助性检测2型糖尿病的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增GLP1R基因或转录本的引物和说明书。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂(a)与突变部位结合的探针；(b)识别突变位点的限制性内切酶。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是选自下组的单核苷酸多态性4347位G A；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物是序列如SEQ IDNO2、3和4所示的引物。
10.一种GLP1R基因和蛋白的用途，其特征在于，用于制备辅助性检测2型糖尿病的试剂。
全文摘要
本发明公开了一种检测2型糖尿病易感性的方法，它包括检测个体的胰升糖素样肽－1受体基因(glucagon－like peptide 1 receptor，GLP1R)、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患2型糖尿病的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。
文档编号G01N33/68GK1936017SQ200510029939
公开日2007年3月28日 申请日期2005年9月23日 优先权日2005年9月23日
发明者罗敏 申请人:上海市内分泌代谢病研究所