用于神经肽受体筛选的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及神经肤生物学和动物生理调控、药物祀标筛选研究技术领域，具体设 及一种用于神经肤受体筛选的方法。
【背景技术】
[0002] 受体相互作用与调控机理的研究开拓了新的思路。神经肤作为神经元间重要的化 学信使，执行神经调质、神经递质和神经激素的作用。神经肤在动物体广泛分布，表明生物 学功能具有多样性和复杂性，主要体现在：1)神经肤数量众多；2)同一神经肤有多种功能， 且对同一祀器官（祀组织或祀细胞）的效应也不相同；3)同一神经肤随动物种属及剂量、 作用部位的不同，功能也不一样；4)同一神经肤对不同效应细胞作用不同，可产生多种效 应。因此，一直W来，神经肤及其受体的研究受到医学家、生理学家及分子药理学家的重视。
[0003] 已发现的神经肤受体中，除屯、房钢尿肤受体本身具有G蛋白介导的功能外，其它 神经肤受体都属于G蛋白偶联的受体，运类受体的特征是受体蛋白的肤链跨膜7次并形成 7个α螺旋区段。
[0004] 基于神经肤及其受体一-G蛋白偶联受体在生理病理过程中的重要生物作用，运 一蛋白家族也是目前最重要的药物作用祀标库。因此，筛选神经肤的受体有助于进一步掲 示人类及动物相关疾病的发生发展过程，对新药物的研制开发和疾病治疗具有重大意义。 阳〇化]目前，神经肤受体的筛选多采用传统的大规模筛选方法，如酵母双杂交、细菌双杂 交、蛋白质忍片和免疫亲和技术，共同缺点就是实验过程繁琐、工作量非常大、费用高，实验 结果中假阳性、假阴性问题突出，干扰因素多，造成后期受体的确定困难巨大。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种用于神经肤受体筛选的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0008] 用于神经肤受体筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0009] S1、明确要研究的神经肤及其分布组织，采集2组不同生理条件下的该组织，分别 分离神经肤作用的祀细胞，进行转录组高通量测序；
[0010] S2、将步骤S1获得的测序数据设定条件抑R校正后的Ρ< 0. 05,选择高差异表达 基因（表达差异倍数根据测序数据设定）；
[0011] S3、将步骤S2获得的差异表达基因应用CEUDV2. 5SubcellularLocalization Prediction数据库进行亚细胞定位：
[0012] S4、取步骤S3获得的膜蛋白的FASTA序列，应用HMMT0PV2.0(Predictionof transmembranehelicesandtopologyofproteinsVersion2. 0)筛选 7 次跨膜口 螺方定 区段蛋白，即为G蛋白偶联受体；
[0013] S5、应用同源建模技术对神经肤和步骤S4中获得的G蛋白偶联受体分别建立蛋白 模型并转化为分子坐标结构：
[0014] S6、根据步骤S5获得的神经肤和各G蛋白偶联受体的PDBQT文件，应用ZDOCK V3. 0. 2分子对接技术对神经肤和各G蛋白偶联受体分别进行模型对接；关键技术在于参数 的设定，包括建立受体、配体结合中屯、网格，设定蛋白分子结合距离<6 A,预测结合部位 1，000,评分函数值由高到低，显示结合构象为前五个预测结果，其它参数软件自动默认；其 中，受体、配体结合中屯、网格的设定关系到结果的准确性，在设定时，通过实验研究和查阅 现有资料，确定受体、配体的结合域氨基酸区段；
[0015] S7、将步骤S6中配体和各受体对接的蛋白复合体模型和评分函数输出，筛选评分 函数值最高的3~5个蛋白复合体，将运3~5个G蛋白偶联受体作为候选受体；
[0016] S8、将步骤S7所得的G蛋白偶联受体分别在293T细胞中过表达，巧光标记该神经 肤，通过配体-受体结合实验最终确定受体。 阳017] 其中，步骤S3的具体步骤为：首先通过NCBI FASTA捜索引擎分别找出每一个Gene symbol的蛋白序列（越完整越好），选择物种；然后将该基因的FASTA序列输入CE化0 V2. 5对话框，并对结果进行统计；
[0018] 其中，步骤S5的具体步骤为，采用综合应用评价体系最为全面的SWISS-M孤化、 Μ孤化L邸和PHYRE2Ξ项同源建模技术，通过评分函数、模型的跨膜折叠数和结合域区域分 布（通过化va软件实现），对Ξ种建模技术获得的每一个蛋白的分子模型进行对比评价，选 择最为可信合理的分子模型并输出PDBQT文件。
[0019] 本具体实施依据统计学原理，要求基因组测序结果抑RO^lseDiscoveryRate， 错误发现率）校正后的P< 0. 05,基因差异表达倍数的选择依据是受体占领学说一一 配体-受体结合产生的效应强度与占领受体的数量成正比，故在不同组织或细胞转录 组中受体与配体表达趋势相同；采用目前应用较为广泛，也是蛋白质Ξ维结构预测最 精确的方法一一蛋白同源建模技术建立蛋白模型；同时，综合应用评价体系最为全面的 SWISS-MODEL版)呢LL邸和PHYRE2Ξ项同源建模技术，避免了单一建模技术造成模型质量 不高的问题；本具体实施在分子对接过程中，各技术参数设定要求明确，对接区域精准，对 接成功后需通过几何匹配和分子动力学方法优化对接，经相互作用预测临界评价和分子力 场评价函数获得对接复合体评分，综合表达量验证、神经肤受体的分子特征及功能分析确 定候选受体。
[0020] 本发明具有W下有益效果：
[0021] (1)使用生物信息学技术对神经肤的受体进行规模筛选，减少了繁琐的实验室工 作，节约了实验费用，避免了假阳性、假阴性结果的出现。
[0022] (2)采用本发明方法得到的候选受体数量可控，筛选过程严格按照配体-受体的 结构识别理论进行，各技术参数设定要求明确，对接区域精准，分辨率高、准确性和重复性 好，为进一步受体-配体结合实验确定受体奠定基础。
【附图说明】
[0023] 图1为1331个高差异表达基因CE化0V2. 5蛋白亚细胞定位获得的188个膜蛋白。
[0024] 图2为188个膜蛋白HMMT0PV2.0跨膜α螺旋区预测获得的38个G蛋白偶联受 体。
[00巧]图中，横坐标为跨膜螺旋区数量，纵坐标为蛋白数量。
[00%] 图3为经评分函数、模型的跨膜折叠数和结合域区域分布选择，利用SWISS-M孤化 建立的CART模型（将PDBQT文件输入化va软件实现）可信合理，左图为立体模型，右图为 分子模型（WCART模型为例，其他38个G蛋白偶联受体模型略）。
[0027] 图4为SWISS-M孤化建立的CART模型的质量评价曲线，横坐标为对应的氨基酸残 基，纵坐标为评分值，要求所构建模型的每一个氨基酸残基的评分最好为正值，否则表明该 氨基酸残基在模型中的空间位置不可信合理。
[0028] 图5为CART与TEDDM1分子对接后形成的蛋白复合体模型。
【具体实施方式】
[0029] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，W下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发 明。 阳〇3〇] 实施例1
[0031] 用本发明的方法筛选牛卵泡可卡因-苯丙胺调节转录肤（Cocaine-and Amphetamine-RegulatedTranscript,CART)的候选受体，义用如下步骤：
[0032]S1、选取8头