融合构建体及其用来生产Fc受体结合亲和性和效应子功能提高的抗体的用途

融合构建体及其用来生产Fc受体结合亲和性和效应子功能提高的抗体的用途
【专利摘要】本发明涉及蛋白质糖基化工程领域。更特别地，本发明涉及核酸分子，包括融合构建体，其具有催化活性及其在宿主细胞的糖基化工程中的用途以产生带有增强的治疗特性，包括抗体带有增强的Fc受体结合和增强的效应物作用的多肽。
【专利说明】融合构建体及其用来生产Fe受体结合亲和性和效应子功
能提高的抗体的用途
[0001]发明背景
[0002]本发明是申请日为2004年01月22日、申请号为200480007564.2的同名申请的
分案申请。
发明领域
[0003]本发明涉及蛋白质糖基化工程(glycosylation engineering)的领域。更特别地，本发明涉及具有催化活性的核酸分子，包括融合构建体，及其在宿主细胞糖基化工程中的用途，用来产生治疗特性增强的多肽，包括Fe受体结合提高的和效应子功能提高的抗体。
【背景技术】
[0004] 糖蛋白介导人体、其它真核生物和一些原核生物中的许多必要的功能，包括催化、发出信号、细胞-细胞交流以及分子识别和结合。它们构成真核生物中大部分的非胞质蛋白质。(Lis等，Eur.J.Biochem.218:1-27(1993))。已经开发了许多糖蛋白用于治疗目的，在最近二十年中，重组形式的自然生成分泌糖蛋白已经成为生物技术工业中的主要产品。实例包括促红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(治疗性mAb)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、干扰素-β (IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人绒膜促性腺激素(hCG)ο (Cumming 等，Glycobiologyl:115-130 (1991))。
[0005]寡糖成分可以显著影响和治疗性糖蛋白功效相关的特性，包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、和免疫系统的相互作用、药物动力学和特定生物活性。这样的特性不仅取决于寡糖的存在或不存在，还取决于其特定的结构。可以形成寡糖结构和糖蛋白功能之间的一些概述。例如，某些寡糖结构通过和特定碳水化合物结合蛋白的相互作用而介导了糖蛋白从血流中快速清除，而其它的可以通过抗体结合并引发不期望的免疫反应。(Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-81(1996))。
[0006]由于能将蛋白质糖基化成最适于人应用形式的能力，因此哺乳动物细胞是生产治疗性糖蛋白的优选宿主。(Cumming 等,Glycobiologyl: 115-30 (1991) ; Jenkins 等,NatureBiotechnol.14:975-81(1996))。细菌很少糖基化蛋白质，并和其它种类的普通宿主如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞一样，产生了从血流中快速清除，不期望的免疫相互作用，以及在一些特定情况中，降低了生物活性的糖基化模式。在过去二十年，哺乳动物细胞中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是使用最普遍的。除了给予合适的糖基化模式，这些细胞持续产生遗传稳定、高产量的克隆细胞系。在简单生物反应器中使用无血清培养基能将它们培养至高密度，并可以开发安全和可再生的生物方法。其它常用的动物细胞包括幼仓鼠肾脏(BHK)细胞，NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。最近，已经实验了从转基因动物来生产。(Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-81 (1996))。
[0007]所有抗体在重链恒定区保守位置含有糖结构，每个同型具有截然不同的N-连接糖结构排列，其可变地影响蛋白装配、分泌或功能活性。(Wright, A.，和Morrison, S.L.,Trends Biotech.15:26-32 (1997))。连接的N-连接糖结构取决于加工程度相当大地改变并可以包括高甘露糖、多支链以及双触角复合寡糖。(Wright，A.，和Morrison，S.L.,Trends Biotech.15:26-32(1997))。通常，在特定糖基化位点存在连接核心寡糖结构的异种处理使得单克隆抗体以多糖基化形式存在。同样，已经显示抗体糖基化作用的主要差异发生在细胞系之间，甚至观察到所给细胞系在不同培养条件下生长的细微差异。(Lifely, M.R.等，Glycobiology5 (8): 813-22 (1995))。[0008]未缀合单克隆抗体(mAb)可以用作治疗癌症的药物，如通过美国食品和药物管理局批准的以下药品来证明，Rituximab (Rituxan?, IDEC Pharmaceuticals, SanDiego, CA,和 Genentech Inc., San Francisco, CA)，用于治疗 CD20 阳性 B-细胞、低级或囊状非霍金奇淋巴瘤，Trastuzumab (Herceptin?, Genentech Inc,)用于治疗晚期乳癌(GriIlo-Lopez, A.-J.等,Semin.0ncol.26:66-73 (1999) ;Goldenberg, Μ.Μ., Clin.Ther.21:309-18 (1999)), Gemtuzumab (Mylotarg?, Celltech/ffyeth-Ayerst)用于治疗复发的急性骨髓瘤，和 Alemtuzumab (CAMPATH?, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG)用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病。这些产品的成功不仅依赖于它们的效用还依赖于它们突出的安全性特征(Gri I lo-Lopez, A.-J.,等，Semin.0ncol.26:66-73 (1999) ; Goldenberg, Μ.M.,Clin.Ther.21:309-18 (1999))。尽管这些药物的成功，目前对获得比未缀合mAb治疗通常获得的活性更高的特异性抗体存在大的兴趣。
[0009]获得效能极大的提高而维持简单生产方法并潜在避免显著的不理想副作用的一个途径，是通过工程化(engineering)它们的寡糖成分来提高mAb天然的细胞介导的效应子功能(Umana, P.等,Nature Biotechnol.17:176-180 (1999))。IgGl 型抗体，癌症免疫治疗中最常用的抗体，是在每个CH2结构域的Asn297处具有保守N-连接糖基化位点的糖蛋白。连接Asn297的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2结构域之间，形成和多肽主链的充分接触，且它们的存在对抗体介导效应子功能如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是必需的(Lifely, M.R.等,Glycobiology5:813-822 (1995);Jefferis, R.等，Immunol Rev.163: 59-76 (1998) ; Wright, A.和 Morrison, S.L.，TrendsBiotechnol.15:26-32(1997))。
[0010]本
【发明者】之前显示了 β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III(GnTIII)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的超表达，糖基转移酶催化二等分(bisected)寡糖的形成，显著提高了工程化CHO细胞产生的抗成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。(参见，Umana, P.等，Nature Biotechnol.17:176-180 (1999)，国际公开 N0.W099/54342，每个的全部内容在此以其整体引入作为参考)。抗体chCE7属于具有高肿瘤亲和性和特异性的未缀合mAb大类，但是当以缺少GnTIII酶的标准工业细胞系生产时效能太小以致不能临床使用(Umana, P.等，Nature Biotechnol.17:176-180 (1999))。该研究首次显不通过工程化抗体生产细胞来表达GnTIII而获得ADCC活性的极大提高，其还导致恒定区(Fe)相关的二等分寡糖，包括二等分非岩藻糖基化寡糖比例的增加，超过天然生成抗体中发现的水平。
[0011]大多数研究的结果表明Fe-受体-依赖性机理基本上解释了细胞毒性抗体对抗肿瘤的作用并表明了对抗肿瘤的最佳抗体优选和活化Fe受体结合并最小化和抑制性配偶体 Fe Y RIIB 结合。(Clynes, R.A.等，Nature Medicine6 (4): 443-446 (2000) ; Kalergis, A.Μ.，和 Ravetch, J.V.，J.Exp.Med.195 (12): 1653-1659 (2002 年 6 月)。例如，至少一个研究的结果提出特别是Fe Y RIIIa受体和抗体治疗效能强烈相关。(Cartron，G.等，Blood99(3):754-757(2002年 2 月))。该研究显示了 Fe Y RIIIa 纯合患者对 Rituximab比杂合患者具有更好的反应。作者推断较优的反应是由于抗体体内结合Fe Y RIIIa更好，其导致更好的对抗淋巴瘤细胞的ADCC活性。(Cartron，G.等，Blood99(3):754-757(2002年2月))。
[0012]除了 ADCC，成功的抗癌单克隆抗体通常诱导Fe-依赖性的调节靶细胞存活、增殖，或死亡的直接信号机理，通过激活细胞信号级引发或阻断生长因子的通路。(Selenko，N.等，J.Clin.1mmunol.22(3): 124-130 (2002))。例如，用 Rituximab 治疗 CD20.细胞已经显示出诱导补体介导的裂解和Mab诱导的凋亡以及ADCC。(Selenko, N.等，J.Clin.1mmunol.22 (3): 124-130 (2002))。此外，Rituximab诱导淋巴瘤细胞凋亡，不仅杀死细胞而且通过抗原递呈树突细胞(DC)促进淋巴瘤衍生的肽的吸收和交叉递呈，诱导DC成熟，并产生特定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
[0013]发明简述 [0014]认识到Fe受体结合亲和性提高的和效应子功能提高的抗体的巨大治疗潜能，因此本发明
【发明者】开发了生产这样抗体的方法，其包括工程化抗体Fe区的糖基化形式(profile)。
[0015]本发明概括地涉及糖基工程化(glycoengineering)宿主细胞的方法来改变该宿主细胞产生的一种或多种多肽的糖基化形式。本发明的方法可以用于生产在Fe区具有修饰糖基化的治疗抗体，包括减少了岩藻糖基化，其中作为修饰糖基化的结果抗体具有提高的效应子功能和/或提高的Fe受体结合。本发明糖基工程化抗体特别用于患者的肿瘤治疗。一实施方案中，糖基工程化本发明的宿主细胞来表达编码具有GnTIII催化活性或GalT催化活性融合多肽的核酸分子。优选实施方案中，融合构建体和编码具有人ManII催化活性多肽的核酸分子和/或编码具有GnTII催化活性多肽的核酸分子共表达。仍然另一实施方案中，通过糖基工程化而提高表达编码具有ManII催化活性多肽的核酸分子的宿主细胞来生产本发明的糖基工程化多肽。
[0016]因此，本发明一方面涉及含有编码融合多肽序列的分离的核酸，其中所述融合多肽具有 β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶 III ( β (I, 4)-N-acetylglucosaminyltransferase III) ( “GnTIII”)活性并含有高尔基体停留多肽(resident polypeptide)的高尔基体定位结构域(localization domain)。在一实施方案中，融合多肽含有β(1，4)_Ν_乙酰氨基葡糖转移酶III的催化结构域。进一步的实施方案中，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I ( “GnTI”)的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II ( “GnTII”)的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选实施方案中，分离的核酸序列含有图24或图25所示的核苷酸序列。另一优选实施方案中，分离的核酸序列编码具有图24或图25所示氨基酸序列的多肽。仍然另一优选实施方案中，分离的核酸序列编码具有和图24或图25所示氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的多肽。
[0017]另一方面，本发明涉及含有编码融合多肽序列的分离的核酸，其中所述融合多肽具有β (1，4)-半乳糖基转移酶(“GalT”)活性并含有高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域。一实施方案中，融合肽含有β (1，4)_半乳糖基转移酶的催化结构域。另一实施方案中，融合肽含有β (1,4)半乳糖基转移酶的催化结构域。进一步的实施方案中，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I ( “GnTI”)的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II ( “GnTII”)的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域和ct 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0018]另一方面，本发明涉及含有分离的核酸的表达载体，该核酸含有编码融合多肽的序列，其中所述融合多肽具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III活性并含有高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域。一实施方案中，表达载体编码含有β (1，4)-Ν-乙酰氨基葡糖转移酶III催化结构域和高尔基体定位结构域的融合多肽，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0019]另一方面，本发明涉及含有分离的核酸的表达载体，该核酸含有编码融合多肽的序列，其中所述融合多肽具有β (1，4)_半乳糖基转移酶活性并含有高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域。一实施方案中，表达载体编码含有β (1，4)_半乳糖基转移酶催化结构域和高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0020]另一方面，本发明涉及含有上述表达载体的宿主细胞。
[0021]另一方面，本发明涉及宿主细胞，将该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶111( “GnTIII”活性的融合多肽的核酸，表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖,其中所述宿主细胞产生的所述多肽选自整个抗体分子、含有Fe区的抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。一实施方案中，具有GnTIII活性的融合多肽含有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III的催化结构域和异源闻尔基体停留多妝的闻尔基体定位结构域，闻尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0022]另一方面，本发明涉及宿主细胞，将该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有β (1，4)_半乳糖基转移酶(“GalT”)活性的融合多肽的核酸，表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，其中所述宿主细胞产生的所述多肽选自整个抗体分子、含有Fe区的抗体片段、和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。一实施方案中，具有GalT活性的融合多肽含有β (1，4)_半乳糖基转移酶的催化结构域和异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0023]优选，高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I或半乳糖基转移酶。[0024]另一方面，本发明涉及具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III活性并含有异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。一实施方案中，本发明的融合多肽含有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III的催化结构域。另一实施方案中，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。[0025]另一方面，本发明涉及具有β (1，4)_半乳糖基转移酶活性并含有异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合蛋白。一实施方案中，本发明的融合多肽含有β (1，4)_半乳糖基转移酶的催化结构域。另一实施方案中，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0026]优选，高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I( “GnTI”)或半乳糖基转移酶(“GalT”)。
[0027]另一方面，本发明涉及生产具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III活性的融合多肽的方法，包括在允许编码融合多肽的核酸表达的条件下在培养基中培养本发明的宿主细胞并从生成培养物中收集融合多肽。一实施方案中，融合多肽含有β (1,4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III的催化结构域。优选，融合多肽含有异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域和ct 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0028]另一方面，本发明涉及生产具有β (1，4)_半乳糖基转移酶活性的融合蛋白的方法，包括在允许编码融合蛋白的核酸表达的条件下在培养基中培养本发明的宿主细胞并从生成培养物中收集融合多肽。一实施方案中，融合多肽含有β (1，4)-半乳糖基转移酶的催化结构域。优选，融合多妝含有异源闻尔基体停留多妝的闻尔基体定位结构域，闻尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0029]优选，高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I或半乳糖基转移酶(“GalT”)。
[0030]再一方面，本发明涉及改变宿主细胞产生的多肽的糖基化形式(profile)的方法，包括将至少一种本发明的核酸或表达载体引入宿主细胞中。优选，多肽是IgG或其含有多肽Fe区的片段。特别优选的实施方案中，多肽是IgGl或其含有多肽Fe区的片段。或者，多肽是融合蛋白，融合蛋白包括等价于人IgG Fe区的区域。
[0031]另一方面，本发明涉及在宿主细胞中生产多肽的方法，包括:(a)在允许产生多肽的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III活性或β (1，4)_半乳糖基转移酶(“GalT”)活性的融合多肽的核酸，产生的多肽选自整个抗体分子、含有Fe区的抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中所述融合蛋白的表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe区中的寡糖；和(b)分离所述多肽。优选，融合多肽含有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III的或β (1，4)-半乳糖基转移酶(“GalT”)的催化结构域和进一步包括异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选实施方案中，作为修饰的结果宿主细胞产生的多肽具有提高的效应子功能和/或提高的Fe受体结合。特别优选的实施方案中，提高的效应子功能是Fe介导的细胞毒性的提高、和NK细胞结合的提高、和巨噬细胞结合的提高、和单核细胞结合的提高、和多形核细胞结合的提高、直接信号诱导的凋亡的提高、树突细胞成熟的提高、和/或T细胞致敏(priming)的提高，提高的Fe受体结合是和Fe激活受体如Fe Y RIIIA结合的提高。优选，呈现效应子功能提高和/或Fe受体结合提高的多肽是抗体、抗体片段或融合蛋白并具有提高比例的Fe区非岩藻糖基化寡糖，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0032] 另一方面，本发明涉及药物组合物，含有本发明的抗体、含有Fe区的抗体片段或融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，和涉及该药物组合物在治疗肿瘤如癌症或其它疾病中的用途。一实施方案中，治疗是B细胞耗尽(B cell depletion)，通过将治疗有效量的该药物组合物给药于需要的患者如人。
[0033]仍然再一方面，本发明提供了宿主细胞，包括含有编码融合多肽核酸分子的表达载体，其中所述融合多肽具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有闻尔基体停留多妝的闻尔基体定位结构域；和含有编码多妝的核酸分子的表达载体，其中所述多肽具有甘露糖苷酶II (ManII)活性。优选实施方案中，融合多肽含有GnTIII的催化结构域和高尔基体定位结构域，高尔基体定位结构域选自ManII的定位结构域、GnTI的定位结构域、GnTII的定位结构域、ManI的定位结构域和α 1_6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。一实施方案中，宿主细胞进一步包括编码具有GnTII活性的多肽的表达载体。编码融合多肽、具有ManII活性的多肽、具有GnTII活性的多肽的核酸分子，可以每个在分开的表达载体中或在同一表达载体中。
[0034]另外一方面，本发明涉及宿主细胞，包括含有编码融合多肽核酸分子的表达载体，其中所述融合多肽具有β (1，4)-半乳糖转移酶活性(GalT)并含有高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域；和含有编码多肽的核酸分子的表达载体，其中所述多肽具有甘露糖苷酶II (ManII)活性。优选实施方案中，融合多肽包括GnTIII的催化结构域和高尔基体定位结构域，高尔基体定位结构域选自ManII的定位结构域、GnTI的定位结构域、GnTII的定位结构域、ManI的定位结构域和α 1，6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。一实施方案中，宿主细胞进一步包括编码具有GnTII活性的多肽的表达载体。编码融合多肽、具有ManII活性的多肽，具有GnTII活性的多肽的核酸分子，可以每个在分开的表达载体中或在同一表达载体中。
[0035]再一方面中，本发明涉及涉及宿主细胞，该宿主细胞工程来表达至少一种编码具有GnTIII活性的融合多肽的核酸和至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe区中的寡糖，其中所述宿主细胞产生的所述多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0036]另外的实施方案中，本发明提供了宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GnTIII活性的融合多肽的核酸、至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，和至少一种编码具有GnTII活性的多肽的核酸，表达量足以修饰所述宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，其中所述宿主细胞产生的所述多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0037]再一方面，本发明提供了宿主细胞，该宿主细胞工程来表达至少一种编码具有GalT活性的融合多肽的核酸和至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe区中的寡糖，其中所述宿主细胞产生的所述多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0038]另外一方面，本发明提供了宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GalT活性的融合多肽的核酸、至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，和至少一种编码具有GnTII活性的多肽的核酸，表达量足以修饰所述宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，其中所述宿主细胞产生的所述多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0039]再一方面，本发明涉及在宿主细胞中生产多肽的方法，包括在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GnTIII活性的融合多肽的核酸和至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中所述融合多肽的表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe 区中的寡糖；和分离所述多肽。
[0040]另一方面，本发明涉及在宿主细胞中生产多肽的方法，包括在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GalT活性的融合多肽的核酸和至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中所述融合多肽的表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe区中的寡糖；和分离所述多肽。
[0041]另外一方面，在宿主细胞中生产Fe介导的细胞毒性提高的多肽的生产方法，包括在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码GalT的核酸和至少一种编码ManII的核酸，产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段，抗体片段包括免疫球蛋白Fe区，其中GalT或ManII中的一个或两个的表达水平足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe区中的寡糖和其中作为所述修饰的结果所述多肽具有提高的Fe介导的细胞毒性；和分离所述Fe介导的细胞毒性提高的多肽。
[0042]另一方面，本发明涉及在宿主细胞中生产多肽的方法，包括:(a)在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有α -甘露糖苷酶II活性的多肽的核酸，产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中所述具有α -甘露糖苷酶II活性的多肽的表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe区中的寡糖；和(b)分离通过所述宿主细胞产生的所述多肽。
[0043]另一方面，本发明涉及宿主细胞，该宿主细胞工程化在允许多肽产生的条件下来表达至少一种编码具有α-甘露糖苷酶II活性的多肽的核酸，产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中所述具有α -甘露糖苷酶II活性的多肽的表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe区中的寡糖。
[0044]仍然另一方面，本发明涉及通过这样的宿主细胞产生的多肽，尤其是作为所述修饰募糖的结果具有提闻的效应子功能和/或提闻的Fe受:体结合的抗体。
[0045]附图简述
[0046]图1.来自BHK中产生的重组的未修饰(非糖基工程化的)抗-⑶20IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。用抗体表达载体pETR1502转染细胞。如实施例1的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。
[0047]图2.来自用编码野生型(“wt”)GnTIII的核酸工程化的BHK中产生的重组的糖基工程化抗_CD20IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。用抗体表达载体pETR1502和GnTIII表达载体pETR1166共转染细胞。如实施例1的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。
[0048]图3.来自用编码具有GnTIII活性并通过GnT1-高尔基体定位结构域定位的融合多肽(“Gl-GnTIII”)的核酸工程化的BHK中产生的重组的糖基工程化抗-⑶20IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。用抗体表达载体pETR1502和GnTIII表达载体PETR1425共转染细胞。如实施例1的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。 [0049]图4.来自用编码具有GnTII I活性并通过高尔基体α-甘露糖苷酶II (ManII)-高尔基体定位结构域定位的融合多肽(“M2-GnTIII”)的核酸工程化的BHK中产生的重组的糖基工程化抗-⑶20IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。用抗体表达载体PETR1502和GnTIII表达载体pETR1506共转染细胞。如实施例1材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。
[0050]图5.来自HEK293-EBNA细胞中产生的重组的未修饰(非糖基工程化的)抗-CD20IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。用抗体表达载体pETR1520转染细胞。如实施例1的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。
[0051]图6.来自用编码具有GnTII I活性并通过高尔基体α-甘露糖苷酶II (ManII)-高尔基体定位结构域定位的融合多肽(“M2-GnTIII”)的核酸工程化的HEK293-EBNA中产生的重组的糖基工程化抗-⑶20 IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。用抗体表达载体pETR1520和用GnTIII表达载体pETR1519共转染细胞。如实施例1的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。
[0052]图7.来自用编码具有GnTII I活性并通过高尔基体α-甘露糖苷酶II (ManII)-高尔基体定位结构域定位的融合多肽(“M2-GnTIII”)的核酸工程化的HEK293-EBNA中产生的重组的糖基工程化抗-⑶20IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。用抗体表达载体pETR1520和用GnTIII表达载体pETR1519共转染细胞。如实施例1的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。(a)没有另外酶处理的PNGaseF-释放寡糖的寡糖特征图。(b)进一步用EndoH消化的PNGaseF-释放寡糖的寡糖特征图。
[0053]图8.(a)EndoH催化的消化寡糖的示意图。EndoH可以消化杂合(hybrid)(和杂合二等分)寡糖，但不消化复合(complex)或复合二等分寡糖。(b)通过分辩复合型和杂合型寡糖，Endo-H处理将结构分配给最初来自PNGAseF处理的MALDI/T0F-MS质谱中具有相同m/z比例的寡糖峰值。[0054]图9.“Gl-GnTIII” -糖基工程化的对未修饰的重组的，抗⑶20嵌合IgGl抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。两个抗体都在BHK细胞中产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图3中和未修饰抗体的那些在图1中。靶细胞(T)是SKW6.4人的类淋巴母细胞。效应细胞(E)是新鲜分离的人PBMC。比例为25:1的E:T用于4小时孵育ADCC试验中，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放来测量细胞毒性，相对于最大释放(使用去污剂替代抗体)和自发释放(培养基替代抗体)对照。实施例1的材料和方法部分中详细描述了试验。
[0055]图10.“M2-GnTIII”_糖基工程化的对未修饰的重组的，抗⑶20嵌合IgGl抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。两个抗体都在HEK293-EBNA细胞中产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图6中和未修饰抗体的那些在图5中。靶细胞(T)是SKW6.4人的类淋巴母细胞。效应细胞(E)是新鲜分离的人PBMC。比例为25:1的E:T用于4小时培养ADCC试验中，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放来测量细胞毒性，相对于最大释放(使用去污剂替代抗体)和自发释放(培养基替代抗体)对照。实施例1的材料和方法部分中详细描述了试验。
[0056]图11.“M2-GnTIII”糖基工程化的对“wt-GnTIII”糖基工程化的重组的，抗⑶20嵌合IgGl抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。两个抗体都在BHK细胞中产生。M2_GnTIII糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图4中和Wt-GnTIII糖基工程化抗体的那些在图2中。靶细胞⑴是SKW6.4人的类淋巴母细胞。效应细胞(E)是新鲜分离的人PBMC。比例为25:1的E:T用于4小时培养ADCC试验中，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放来测量细胞毒性，相对于最大释放(使用去污剂替代抗体)和自发释放(培养基替代抗体)对照。实施例1的材料和方法部分中详细描述了试验。
[0057]图12.“M2-GnTIII”_糖基工程化的对未修饰的重组的，抗⑶20嵌合IgGl抗体和NK细胞上的Fe Y RIIIa受体的 结合。两个抗体都在HEK293-EBNA细胞中产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图6中和未修饰抗体的那些在图5中。如实施例1的材料和方法部分中所述的进行结合试验。在其表面表达Fe YRIIIa受体的人NK细胞从已知不产生Fe Y RIIc受体(B卩，Fe Y RIIc编码序列中含有框内终止密码子的纯合基因变体)的基因型供体分离。通过FACS使用FITC标记的抗人IgG抗体片段来测量的几何平均荧光强度随着重组抗体和NK细胞结合的量而增加。该试验中检测的结合是Fe Y RIII a特异性的，如通过使用竞争Fe YRIIIa特异性抗体片段来证明(参见图13)。
[0058]图13.在增加浓度的竞争抗Fe Y RIII抗体片段存在下，“M2-GnTIII”_糖基工程化的对未修饰的重组的，抗⑶20嵌合IgGl抗体和NK细胞上的Fe Y RIIIa受体的结合。两个重组抗体都在HEK293-EBNA细胞中产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图6中和未修饰抗体的那些在图5中。如实施例1的材料和方法部分中所述的进行结合试验，但是用重组抗体(通常终浓度为3 μ g/ml)和增加并改变浓度(参见图表)的竞争3G8-Fab2抗Fe Y RIII抗体片段共孵育纯化的NK细胞。在其表面表达Fe Y RIIIa受体的人NK细胞从已知不产生Fe Y RIIc受体(B卩，Fe Y RIIc编码序列中含有框内终止密码子的纯合基因变体)的基因型供体分离。通过FACS使用FITC标记的抗人IgG抗体片段来测量的几何平均荧光强度随着重组抗体和NK细胞结合的量而增加。
[0059]图14.识别纤连蛋白的ED-B +同工型并在HEK293-EBNA细胞中产生的重组IgGl “L19”抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。(a)在用抗体表达载体pETR1546转染的HEK293-EBNA细胞中产生的未修饰抗体。(b)在用抗体表达载体pETR1546和GnTIII表达载体PETR1519共转染的HEK293-EBNA细胞中产生的M2_GnTIII糖基工程化抗体。通过蛋白质A亲和性色谱随后大小排阻色谱步骤从培养基中纯化两种抗体,在Superdex200基质(Amersham)上将缓冲液调换至磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。如实施例1的材料和方法中所述的制备和分析寡糖。[0060]图15.“M2-GnTIII”-糖基工程化的对未修饰的重组的，抗ED-B+纤连蛋白IgGl抗体和Raji人淋巴瘤细胞上的Fe Y RIIb受体的结合。两个抗体都在HEK293-EBNA细胞中产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图14b中和未修饰抗体的那些在图14a中。如实施例1的材料和方法部分中所述的进行结合试验。通过FACS使用FITC标记的抗人IgG抗体片段来测量的几何平均荧光强度随着重组抗体和Raji B细胞淋巴瘤细胞结合的量而增加。
[0061]图16.“M2-GnTIII”-糖基工程化的对未修饰的重组的，抗⑶20嵌合IgGl抗体和不同供体NK细胞上的Fe YRIIIa受体的结合。两个抗体都在HEK293-EBNA细胞中产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图6中和未修饰抗体的那些在图5中。如实施例I的材料和方法部分中所述的进行结合试验。在其表面表达Fe Y RIIIa受体的人NK细胞从已知不产生Fe Y RIIc受体(B卩，Fe Y RIIc编码序列中含有框内终止密码子的纯合基因变体)的基因型供体分离。两个供体的基因型为Fe Y RIIIa受体158V- “高亲和性”变体的纯合。另外两个供体的基因型为Fe Y RIIIa受体158V- “高亲和性”变体和158F- “低亲和性”变体的158V/F杂合。通过FACS使用FITC标记的抗人IgG抗体片段来测量的几何平均荧光强度随着重组抗体和NK细胞结合的量而增加。该试验中检测的结合是Fe YRIIIa特异性的，如通过使用竞争Fe YRIIIa特异性抗体片段来证明(参见图13)。
[0062]图17.截短的CD4 (tCD4)表达的FACS分析，(a) BHK-1502-28 (野生型)和(b)克隆BHK-1502-28-ll(M2-GnTIII糖基工程化的)稳定的嵌合抗-⑶20IgGl抗体产生细胞系。通过pETR1537GnTIII表达载体中的IRES序列将t⑶4的表达可操作地和M2_GnTIII表达连接并因此用作GnTIII表达的间接标记。各自的平均和几何平均荧光强度为，糖基工程化细胞系27.6和19.9，野生型细胞系4.7和4.1。
[0063]图18.来自BHK-1502-28-11细胞系产生的M2_GnTII1-糖基工程化的重组抗⑶20嵌合IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。细胞系、抗体纯化以及寡糖制备和分析描述于实施例1的材料和方法部分中。
[0064]图19.来自BHK-1502-28-11细胞系产生的M2_GnTII1-糖基工程化的重组抗⑶20嵌合IgGl抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱，通过PNGaseF释放寡糖并进一步用EndoH消化。细胞系、抗体纯化以及寡糖制备和分析描述于实施例1的材料和方法部分中。
[0065]图20.M2-GnTIII”糖基工程化的对未修饰的重组的，抗⑶20嵌合IgGl抗体和NK细胞上的Fe Y RIIIa受体的结合，抗体由稳定细胞系产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图18和19中。如实施例1的材料和方法部分中所述的进行结合试验。在其表面表达Fe YRIIIa受体的人NK细胞从已知不产生Fe y RIIc受体(B卩，Fe y RIIc编码序列中含有框内终止密码子的纯合基因变体)的基因型供体分离。通过FACS使用FITC标记的抗人IgG抗体片段来测量的几何平均荧光强度随着重组抗体和NK细胞结合的量而增加。该试验中检测的结合是Fe YRIIIa特异性的，如通过使用竞争Fe Y RIIIa特异性抗体片段来证明(参见图13) 。
[0066]图21.“M2_GnTIII”糖基工程化的对未修饰的重组的，抗⑶20嵌合IgGl抗体的补体介导裂解(CML)。两个抗体都在HEK293-EBNA细胞中产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征描述于图6中和未修饰抗体的那些在图5中。靶细胞(T)是SKW6.4人的类淋巴母细胞。人补体用于试验。通过LDH释放来测量裂解。试验详细描述于实施例1的材料和方法部分中。
[0067]图22.来自识别人表皮细胞生长因子(EGFR)并在HEK293-EBNA细胞中产生的重组嵌合IgGl“C225”抗体的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。(a)用抗体表达载体pURSI28转染的HEK293-EBNA细胞中产生的未修饰抗体。(b)用抗体表达载体pETRURSI28和GnTIII表达载体PETR1519共转染的HEK293-EBNA细胞中产生的M2_GnTIII糖基工程化抗体。通过蛋白质A亲和性色谱随后大小排阻色谱步骤从培养基中纯化两个抗体,在Superdex200基质(Amersham)上将缓冲液调换至磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。如实施例1的材料和方法中所述的制备和分析寡糖。
[0068]图23.“M2-GnTIII”_糖基工程化的对未修饰的重组的，抗EGFR嵌合IgGl “C225”抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。两个抗体都在HEK293-EBNA细胞中产生。糖基工程化抗体的产生和糖基化特征图描述于图22b中和未修饰抗体的那些在图22a中。靶细胞(T)是A431人鳞状癌细胞(ECACC N0.85090402)。效应细胞(E)是新鲜分离的人PBMC。比例为25:1的E:T用于4小时培养ADCC试验中，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测量细胞毒性，相对于最大释放(使用去污剂替代抗体)和自发释放(培养基替代抗体)对照。实施例1的材料和方法部分中详细描述了试验。
[0069]图24.分别为本发明甘露糖苷酶I1-GnTIII融合多肽的核酸序列和氨基酸序列。
[0070]图25.分别为本发明GnT-1 — GnT-1II融合多肽的核酸序列和氨基酸序列。
[0071]图26.来自用抗体表达载体pETR1520转染的HEK293-EBNA细胞中产生的未修饰重组C2B8抗CD20嵌合IgGl抗体(“Cwt”)的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。如实施例5的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。
[0072]图27.来自用抗体表达载体PETR1520和融合GnTIII多肽表达载体(pETR1519)共转染的HEK293-EBNA细胞中产生的重组糖基工程化C2B8抗CD20嵌合IgGl抗体(“Cbrt”)的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。如实施例5的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。(A)没有另外酶处理的PNGaseF-释放寡糖的寡糖特征图。(B)进一步用EndoH消化的PNGaseF-释放寡糖的寡糖特征图。
[0073]图28.来自用抗体表达载体PETR1520、融合GnTIII多肽表达载体(pETR1519)和甘露糖苷酶II多肽表达载体(PCLF9)共转染的HEK293-EBNA细胞中产生的重组糖基工程化C2B8抗CD20嵌合IgGl抗体(“Cm”)的中性寡糖混合物的MALDI/T0F-MS谱。如实施例5的材料和方法部分中所述的从培养基中纯化抗体并制备和分析寡糖。(A)没有另外酶处理的PNGaseF-释放寡糖的寡糖特征图。(B)进一步用EndoH消化的PNGaseF-释放寡糖的寡糖特征图。
[0074]图29.通过在HEK293-EBNA细胞中表达编码ManI1-GnTIII融合多肽的核酸来糖基工程化的嵌合抗CD20抗体介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其中GnTIII催化结构域通过ManII高尔基体定位结构域定位，其中编码ManI1-GnTIII的核酸在其自身(抗体Cbrt)上表达或和编码ManII的核酸(Cm)在抗体产生细胞中一起共表达。Cwt是用抗体表达载体pETR1520转染的HEK293-EBNA细胞中产生的未修饰的重组C2B8抗CD20嵌合IgGl抗体(“Cwt”)。试验详细描述于实施例1的材料和方法部分中。
[0075]图30.通过在HEK293-EBNA细胞中表达编码ManI1-GnTIII融合多肽的核酸来糖基工程化的嵌合抗⑶20抗体的Fe Y RIIIa受体结合，其中GnTIII催化结构域是通过ManII高尔基体定位结构域定位的，其中ManI1-GnTIII编码核酸是在其自身(抗体Cbrt)上表达或和编码ManII的核酸(Cm)在抗体产生细胞中一起共表达。Cwt是用抗体表达载体pETR1520转染的HEK293-EBNA细胞中产生的未修饰的重组C2B8抗CD20嵌合IgGl抗体(“Cwt”)。试验详细描述于实施例1的材料和方法部分中。在其表面表达Fe Y RIIIa受体的人NK细胞从已知不产生Fe Y RIIc受体(B卩，Fe y RIIc编码序列中含有框内终止密码子的纯合基因变体)的基因型供体分离。通过FACS使用FITC标记的抗人IgG抗体片段来测量的几何平均荧光强度随着重组抗体和NK细胞结合的量而增加。该试验中检测的结合是Fe YRIIIa特异性的，如通过使用竞争Fe Y RIIIa特异性抗体片段来证明(参见图13)。[0076]图31.通过在HEK293-EBNA细胞中表达编码ManI1-GnTIII融合多肽的核酸来糖基工程化的嵌合抗CD20抗体的补体介导细胞毒性，其中GnTIII催化结构域是通过ManII高尔基体定位结构域定位的，其中ManI1-GnTIII编码核酸是在其自身(抗体Cbrt)上表达或和编码ManII的核酸(Cm)在抗体产生细胞中一起共表达。Cwt是用抗体表达载体PETR1520转染的HEK293-EBNA细胞中产生的未修饰的重组C2B8抗CD20嵌合IgGl抗体(“Cwt”)。
[0077]图32 (A-C).表达载体 pCLF9 ⑷、pETR1842 ⑶和 pETR1843 (C)。
[0078]图33(A和B).用于融合蛋白ManI1-GalT(A)和GalT⑶的表达载体。
[0079]图34.在α -甘露糖苷酶II存在下产生的抗CD20单克隆抗体的寡糖特征图和所发现的与抗体Fe部分相关结构的相对百分比。
[0080]图35 (Α和B).在融合蛋白ManI1-GalT存在下产生的抗⑶20单克隆抗体的寡糖特征图和所发现的与抗体Fe部分相关结构的相对百分比。PNGaseF(A)和EndoH(B)消化后的寡糖特征图。
[0081]图36.在α -甘露糖苷酶II (ManII)存在下产生的抗体和Fe Y RIIIA受体结合，具有比野生型抗体高的亲和性。
[0082]图37.糖基工程化嵌合抗⑶-20介导的抗体依赖性细胞毒性。
[0083]发明详述
[0084]在此使用的术语和本领域通常所用的一样，除非另外如下定义。
[0085]如在此所用的，术语抗体定义为包括整个抗体分子，包括单克隆、多克隆和多特异性(例如，双特异性)抗体，以及具有Fe区的抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。还包括人源化和嵌合抗体。
[0086]如在此所用的，术语Fe区定义为IgG重链的C末端区域。尽管IgG重链Fe区的界限可以略微改变，人IgG重链Fe区通常定义为从位置Cys226氨基酸残基开始至羧基末端的一段。
[0087]如在此所用的，术语等价于免疫球蛋白Fe区的区域定义为包括免疫球蛋白Fe区的天然生成等位基因变体以及具有改变的变体，改变产生了替代、添加或缺失但基本上没有降低免疫球蛋白介导效应子功能(如抗体依赖性细胞毒性)的能力。例如，可以从免疫球蛋白Fe区的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸而基本上没有失去生物功能。
[0088]可以根据本领域已知的一般规则选择这样的变体使得对活性的影响最小。(参见，例如，Bowie, J.U.等，Science247:1306-10 (1990)。
[0089]如在此所用的，“具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III活性”的融合多肽指的是能够催化将β -1-4键中的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基添加至N-连接寡糖的三甘露糖基核心的β连接的甘露糖苷上的融合多肽。这包括呈现和β (1，4)-Ν-乙酰氨基葡糖转移酶III酶活性相似但不必需相同的融合多肽，该酶也称为β -1-4甘露糖基-糖蛋白4-β-Ν-乙酰氨基葡糖转移酶(EC2.4.1.144)，根据生化和分子生物国际命名委员会(NC-1UBMB)，如特定生物试验中测定的，有和没有剂量依赖性。在剂量依赖性存在的情况中，不需要等同于β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III，但和β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III相比较基本上和所给活性剂量依赖性相似(即，相对于β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III，候选多肽将呈现更高的活性或不比其活性低25倍以上，优选不比其活性低10倍以上，最优选不比其活性低3倍以上的活性)。
[0090]如在此所用的，“具有β (1，4)_半乳糖基转移酶活性”和“具有GalT活性”的融合多肽指的是能够催化将UDP半乳糖的半乳糖残基添加至N连接寡糖中发现的非还原性末端GlcNAc的融合多肽。这包括呈现酶活性和β (1，4)-半乳糖基转移酶相似但不必需相同的融合多肽，该酶也称为UDP-Gal = GlcNAc β -1, 4-半乳糖基转移酶(E.C.2.4.1.38)，根据生化和分子生物国际命名委员会(NC-1UBMB)，如特定生物试验中测定的，有和没有剂量依赖性。在剂量依赖性存在的情况中，不需要等同于β (1，4)_半乳糖基转移酶，但和β (1，4)_半乳糖基转移酶相比较基本上和所给活性剂量依赖性相似(B卩，相对于β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III，候选多肽将呈现更高的活性或不比其活性低25倍以上，优选不比其活性低10倍以上，最优选不比其活性低3倍以上的活性)。
[0091]具有和本发明参照核苷酸序列至少例如95% “相同”的核苷酸序列的核酸或多肽，定义为多核苷酸的核苷酸序列等同于参照序列，除了多核苷酸序列可以包括参照核苷酸序列每100个核苷酸高达五个点突变。换句话说，为了获得具有和参照核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中高达5%的核苷酸可以删除由另一核苷酸替代，或高达参照序列中总核苷酸5%的多个核苷酸可以插入参照序列中。查询序列可以显示于图24或图25中的整个序列。
[0092]作为实际情况，可以使用已知计算机程序常规测定是否任何特定的核酸分子或多肽和本发明的核苷酸序列或多肽序列是至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的。测定查询序列(本发明的序列)和对象序列之间的最佳整体匹配的优选方法，也称为全局序列比对，可以使用基于Brutlag等的算法的FASTDB计算机程序来测定，Brutlag等，Comp.App.Biosc1.6:237-245 (1990)。序列比对中，查询序列和对象序列都是DNA序列。通过将U转换成T可以比较RNA序列。所述全局序列比对的结果是％相同性。来计算％相同性的DNA测序的FASTDB比对中所用的优选参数是:矩阵=单式的，k_元组=4,错配惩罚=I，连接惩罚=30,随机化组长度=O,关闭值=I,缺口惩罚=5,缺口大小惩罚0.05,窗口大小=500或对象核苷酸序列的长度，以较短者为准。
[0093]如果由于5’或3’缺失，而不是由于内部缺失，对象序列比查询序列短，必须对该结果进行人工校正。这是因为当计算％相同性时FASTDB程序没有计算对象序列的5’和3’截短。对于5’或3’端截短的对象序列，相对于查询序列，通过计算对象序列5’和3’没有配对/比对的查询序列的碱基数量，作为查询序列总碱基的百分比，来校正％相同性。通过FASTDB序列比对的结果来测定核苷酸是否匹配/比对。然后从通过上述使用特定参数的FASTDB程序计算的％相同性中减去该百分比，来获得最终的％相同性值。该校正的值是用于本发明目的的值。只计算如通过FASTDB比对展示的、没有和查询序列匹配/比对的对象序列5’和3’碱基外的碱基是为了人工调整％相同性值的目的。
[0094]例如，将90个碱基的对象序列和100个碱基的查询序列进行比对来测定％相同性。在对象序列的5’端发生了缺失，因此，FASTDB比对没有显示5’末端头10个碱基的匹配/比对。10个未配对的碱基表示序列的10% (5’和3’端未匹配碱基数量/查询序列中碱基总数)，因此从FASTDB程序计算的％相同性值中减去10%。如果剩余的90个碱基完全匹配，最终％相同性为90%。另一实施例中，90个碱基的对象序列和100个碱基的查询序列相比较。这次缺失是内部缺失，使得对象序列在5’和3’没有和查询序列不匹配/比对的碱基。在这种情况下，通过FASTDB计算的％相同性没有人工校正。再次，只人工校正了对象序列的5’或3’没有和查询序列匹配/比对的碱基。没有进行为了本发明目的的其他人工校正。 [0095]具有和本发明查询氨基酸序列至少例如95% “相同”的氨基酸序列的多肽，定义为对象多肽的氨基酸序列等同于查询序列，除了对象多肽序列可能包括查询氨基酸序列中每100个氨基酸高达五个氨基酸的改变。换句话说，为了获得具有和查询氨基酸序列至少95%相同的氣基酸序列的多妝，对象序列中闻达5%的氣基酸残基可以插入、删除，或用另一氣基酸替代。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基端或羧基端或那些末端位置之间的任何地方，单个散布在参照序列的残基中或在参照序列内的一个或多个邻接基团中。
[0096]作为实际情况，可以使用已知计算机程序来常规测定是否任何特定多肽和参照多肽是至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。测定查询序列(本发明的序列)和对象序列之间的最佳整体匹配的优选方法，也称为全局序列比对，可以使用基于Brutlag等的算法的 FASTDB 计算机程序来测定,Brutlag 等,Comp.App.Biosc1.6:237-245(1990)。序列比对中，查询序列和对象序列都是核苷酸序列和都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果是％相同性。FASTDB氨基酸比对中所用的优选参数是:矩阵=PAM0,k-元组=2,错配惩罚=1，连接惩罚=20,随机化组长度=O,关闭值=I,窗口大小=序列长度,缺口惩罚=5，缺口大小惩罚=0.05，窗口大小=500或对象核苷酸序列的长度，以较短者为准。
[0097]如果由于N-或C-末端删除，而不是由于内部删除，对象序列比查询序列短，必须对该结果进行人工校正。这是因为当计算全局％相同性时FASTDB程序没有计算对象序列的N-和C-端截短。对于N-和C-端截短的对象序列，相对于查询序列,通过计算对象序列N-和C-端的查询序列没有和相应对象序列匹配/比对的残基数量，作为查询序列总碱基的百分比，来校正％相同性。通过FASTDB序列比对的结果来测定残基是否匹配/比对。然后从通过上述使用特定参数的FASTDB程序计算的％相同性中减去该百分比，来获得最终的％相同性值。该最终百分相同性是用于本发明目的的相同性。只考虑没有和查询序列相配/比对的对象序列N-和C-端的残基是为了人工调整％相同性值的目的。即，只是对象序列的最远N-和C-端外的查询残基位置。
[0098]例如，将90个氨基酸残基的对象序列和100个残基的查询序列进行比对来测定％相同性。在对象序列的N-端发生了删除，因此，FASTDB比对没有显示N-端头10个碱基的配对/比对。10个未配对的碱基表示序列的10% (N-和C-端未配对碱基数量/查询序列中碱基总数)，因此从FASTDB程序计算的％相同性值中减去10%。如果剩余的90个残基完全配对，最终％相同性为90%。另一实施例中，90个残基的对象序列和100个残基的查询序列相比较。这次删除是内部删除，使得对象序列在N-或C-端没有和查询序列不配对/比对的碱基。在这种情况下，通过FASTDB计算的％相同性没有人工校正。再次，只人工校正了对象序列的N-和C-端外的残基位置，如FASTDB比对中展示的，其没有和查询序列配对/比对。没有进行为了本发明目的的其他人工校正。
[0099]如在此所用的，和本发明核酸序列“在严格条件下杂交”的核酸，指的是在含有50%甲酰胺、5XSSC(750mM NaCl, 75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5 XDenhardt 溶液、10%葡聚糖硫酸酯和20μ g/ml变性的剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中42°C温育过夜，接着用约65°C的0.1XSSC洗涤滤膜而杂交的多核苷酸。
[0100]如在此所用的，术语高尔基体定位结构域指的是高尔基体停留多肽的氨基酸序列，其负 责将其固定于高尔基复合体内位置。通常，定位结构域包括酶氨基端的“尾巴”。
[0101]如在此所用的，术语效应子功能(effector function)指的是可导致抗体Fe区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括，但不限制于，Fe受体结合亲和性、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、通过抗原递呈细胞的免疫复合体介导的抗原吸收、细胞表面受体的下调等。
[0102]如在此所用的，术语工程、工程化的、工程化和糖基化工程认为包括天然生成多肽或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化方法的代谢工程，包括寡糖合成途径的基因操作来获得细胞中表达糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。
[0103]如在此所用的，术语宿主细胞涵盖任何种类的细胞系统，其可以工程化来产生修饰糖化形式的目的蛋白质、蛋白质片段或肽，包括抗体、抗体片段和融合蛋白。通常，已经对宿主细胞进行了操作来表达最佳水平的GnTIII。宿主细胞包括培养的细胞，例如，哺乳动物培养的细胞如CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，仅仅列举了少数的，而且还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
[0104]如在此所用的，术语Fe介导的细胞毒性包括抗体依赖性细胞毒性和通过含有人Fe区的可溶性Fe-融合蛋白介导的细胞毒性。这是通过“人免疫效应细胞”导致“抗体靶向细胞”裂解的免疫机理，其中:
[0105]“人免疫效应细胞”是白细胞群体，其表面展示Fe受体其通过这些受体和抗体或Fe融合蛋白的Fe区结合并实现效应子功能。这样的群体包括，但不限制于外周血单核细胞(PBMC)和/或自然杀伤(NK)细胞。
[0106]“抗体靶向细胞“是通过抗体或Fe融合蛋白结合的细胞。抗体或Fe融合蛋白通过蛋白Fe区部分的N-端和靶细胞结合。[0107]如在此所用的，术语提高的Fe介导的细胞毒性定义为在靶细胞周围培养基中给定的抗体或Fe融合蛋白浓度下，在给定时间内通过以上定义的Fe介导的细胞毒性机理裂解的“抗体靶向细胞”数量的增加，和/或在给定时间内通过Fe介导的细胞毒性机理获得裂解给定数量“抗体靶向细胞”需要的靶细胞周围培养基中抗体或Fe融合蛋白浓度的降低。Fe介导的细胞毒性的提高是相对于通过相同抗体或Fe融合蛋白介导的细胞毒性，这些抗体或Fe融合蛋白由相同类型的宿主细胞产生，使用本领域技术人员已知的相同的标准生产、纯化、配制和保存方法，但不是通过在此所述方法工程化来表达糖基转移酶GnTIII的宿主细胞产生的。 [0108]具有提高的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的抗体意思是如通过本领域普通技术人员已知的任何合适方法测得的具有提高的ADCC的抗体。一种公认的体外ADCC试验如下:
[0109]I)试验使用靶细胞，已知该靶细胞表达通过抗体的抗原结合区识别的靶抗原；
[0110]2)试验使用从随机选择的健康供体血液中分离的人外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞，;
[0111]3)根据以下方案进行试验:
[0112]i)使用标准密度离心方法分离PBMC并以5X IO6个细胞/ml悬浮于RPMI细胞培
养基中；
[0113]ii)通过标准组织培养方法培养靶细胞，从指数生长期收集存活力高于90%的细胞，用RPMI细胞培养基洗涤，用100微居的51Cr标记，用细胞培养基洗涤两次，并以IO5个细胞/ml的密度重悬于细胞培养基中；
[0114]iii)将100微升上述最终的靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每个孔中；
[0115]iv)在培养基中将抗体从4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml,并将50微升所得到的抗体溶液加入96孔微量滴定板中的靶细胞中，将涵盖上述全部浓度范围的各种抗体浓度一式三份进行测试；
[0116]V)对于最大释放(MR)对照，平板上含有标记靶细胞的另外3个孔，接受50微升2%(V/V)非离子去污剂(Nonidet, Sigma, St.Louis)水溶液,替代抗体溶液(上述第iv点)；
[0117]vi)对于自发释放(SR)对照，平板上含有标记靶细胞的另外3个孔，接受50微升RPMI细胞培养基替代抗体溶液(上述第iv点)
[0118]vii)然后将96孔微量滴定板在50Xg离心I分钟，并在4°C温育I小时；
[0119]viii)将50微升PBMC悬浮液(上述第i点)加入每个孔中来产生效应子:靶细胞的25:1的比例，并将平板放置于5%C02气氛的培养箱中于37°C 4小时；
[0120]ix)收集每个孔中的无细胞上清液并使用Y计数器定量实验释放的放射性(ER);
[0121]x)根据公式(ER-MR)/(MR-SR) X 100计算每个抗体浓度的特定裂解百分数，其中ER是对于那个抗体浓度的定量的平均放射性(参见上述第ix点)，MR是对于MR对照的定量的平均放射性(参见上述第V点)，和SR是对于SR对照(参见上述第vi点)的定量的平均放射性(参见上述第ix点)；
[0122]4) “提高的ADCC”定义为上述测试的抗体浓度范围内观察到的特定裂解的最大百分比的提高，和/或获得上述测试的抗体浓度范围内观察到的特定裂解最大百分比一半所需的抗体浓度的减少。ADCC的提高是相对于用上述试验测定的、通过相同抗体介导的、通过相同类型宿主细胞产生的、使用本领域技术人员已知的相同标准的生产、纯化、配制和储存方法，但没有通过工程化来超表达糖基转移酶GnTIII的宿主细胞产生的ADCC。
[0123]如在此所用的，术语抗-⑶20抗体定义为特异性识别细胞表面35，000道尔顿的非糖基化磷蛋白的抗体，该磷蛋白通常命名为人B淋巴细胞限制性分化抗原Bp35，一般称为CD20。
[0124]本发明基于以下发现:工程化抗体产生细胞来表达新的融合多肽来形成Fe受体结合亲和性提高和效应子功能提高的抗体，该新的多肽具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)或β (1，4)-半乳糖基转移酶(“GalT”)活性，并包括高尔基体停留多肽的闻尔基体定位结构域。或者，效应子功能提闻的和/或Fe受:体结合提闻的抗体可以通过工程化抗体产生细胞来获得，该抗体产生细胞具有编码具有α -甘露糖苷酶II催化活性的多肽的核酸分子增加的表达。优选实施方案中，具有GnTIII或GalT活性的融合构建体和编码ManII或GnTII的核酸分子共表达。
[0125]因此，一实施方案中，本发明涉及包括编码融合多肽序列的分离核酸，其中融合多肽具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性和包括高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域。优选实施方案中，融合多肽包括β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III的催化结构域，且高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II的定位结构域。进一步的实施方案中，高尔基体定位结构域是GalT的定位结构域。
[0126]优选，分离的核酸具有图24和SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。另一优选实施方案中，融合多肽包括β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III的催化结构域，且高尔基体定位结构域是β (1，2)-Ν-乙酰氨基葡糖转移酶I (GnTI)的催化结构域。优选，核酸具有图25和SEQ ID NO: 12所 不的核昔酸序列。或者,可以使用另一闻尔基体停留多妝的闻尔基体定位结构域。另一优选实施方案中，高尔基体定位结构域选自β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域，和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0127]另一优选实施方案中，本发明涉及分离的核酸，含有编码具有图24和SEQ IDΝ0:15或图25和SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的多肽的序列。本发明还包括分离的核酸，含有在严格条件下和杂交探针杂交的序列，其核苷酸序列由图24和SEQ ID NO: 14或图25和SEQ IDN0:12所示的核苷酸序列组成。本发明进一步涉及分离的核酸，包括和图24和SEQ ID NO: 14 或图 25 和 SEQ ID NO: 12 所示核苷酸序列至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。另一实施方案中，本发明涉及分离的核酸，包括编码具有和图24和SEQ ID NO: 15 或图 25 和 SEQ ID NO: 13 所示氨基酸序列至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽的序列。本发明还包括分离的核酸，包括编码具有保守氨基酸替代的图24和SEQ ID NO: 15或图25和SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的多肽的序列。
[0128]另一实施方案中，本发明涉及表达载体，包括本发明分离的核酸，如上述的那些。
[0129]进一步的实施方案中，本发明涉及具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III活性或β (1，4)-半乳糖基转移酶(“GalT”)活性并含有异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。优选实施方案中，本发明的融合多肽包括β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III的催化结构域。特别优选的实施方案中，融合多肽进一步包括甘露糖苷酶II或β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I (GnTI)的高尔基体定位结构域。可替换的实施方案中，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域，和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。可以在允许编码所述融合多肽的核酸表达的条件下在培养基中培养本发明的宿主细胞并从生成的培养物中收集所述融合多肽来制得本发明的融合多肽。
[0130]本发明进一步涉及修饰宿主细胞产生的多肽的糖基化形式(profile)的方法,包括将本发明的核酸或载体引入所述宿主细胞中。优选，修饰的多肽是IgG或其含有Fe区的片段。更优选，多肽是IgGl，或其含有Fe区的片段。另一优选实施方案中，修饰的多肽是融合蛋白，该融合蛋白包括等价于人IgG Fe区的区域。
[0131]本发明进一步涉及含有本发明的核酸和表达载体的宿主细胞。一实施方案中,本发明涉及宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III活性或β (1，4)_半乳糖基转移酶(“GalT”)活性的融合多肽的核酸，表达量足以修饰所述宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，其中所述多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。优选实施方案中，所述宿主细胞产生的多肽是IgG或其片段。更优选，所述宿主细胞产生的多肽是IgGl或其片段。或者，所述宿主细胞产生的多肽是融合蛋白，该融合蛋白包括等价于人IgG例如IgGl的Fe区的区域。
[0132]作为修饰的结果本发明宿主细胞所产生的修饰多肽呈现提高的Fe受体结合亲和性和/或提高的效应子功能。优选，提高的Fe受体结合亲和性是和Fe Y激活受体如Fe Y RIIIa受体结合的提高。提高的效应 子功能优选是以下一个或多个的提高:抗体依赖性细胞毒性的提高、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的提高、细胞因子分泌的提高、通过抗原递呈细胞的免疫复合体介导的抗原摄取的提高、Fe介导的细胞毒性的提高、和NK细胞结合的提高、和巨噬细胞结合的提高、和多形核细胞(PMN)结合的提高、和单核细胞结合的提高、靶结合抗体交联的提高、诱导凋亡直接信号的增强、树突细胞成熟的提高和T细胞致敏的提闻。
[0133]特别优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞，和所述宿主细胞产生的多肽是抗⑶20抗体如IDEC-C2B8。另一优选实施方案中，宿主细胞是嵌合抗人EGFR单克隆抗体C225。
[0134]除了含有本发明的编码融合多肽的核酸，本发明的宿主细胞进一步含有至少一种截短的(transected)核酸,该核酸编码抗体分子、保留功能性Fe区的抗体片段或融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。优选实施方案中，至少一种截短的核酸编码抗CD20抗体，嵌合抗人成神经细胞瘤单克隆抗体chCE7，嵌合抗人肾脏细胞癌单克隆抗体chG250，嵌合抗人结肠、肺和乳癌单克隆抗体ING-1，人源化抗人17-1A抗原单克隆抗体3622W94，人源化抗人结肠直肠肿瘤抗体A33，直接对抗⑶3神经节苷脂R24的抗人黑素瘤抗体，嵌合抗人鳞状细胞癌单克隆抗体SF-25，抗人EGFR抗体，抗人EGFRvIII抗体，抗人PSMA抗体，抗人PSCA抗体，抗人CD22抗体，抗人CD30抗体，抗TAG72抗体，抗高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)的抗体，抗⑶3神经节苷脂抗体，抗⑶2神经节苷脂抗体，抗GM2神经节苷脂抗体，抗人神经节苷脂抗体，抗EGFRvIII抗体，抗整联蛋白抗体，抗CD80抗体，抗LeY抗体，抗粘蛋白抗体，抗MUC18抗体，抗人⑶33抗体，抗人⑶38抗体，抗人⑶40抗体，抗人⑶45抗体，抗人⑶52抗体，抗人⑶138抗体，抗人HLA-DR变体抗体，抗人EpCAM抗体，抗人CEA抗体，抗人MUCl抗体，抗人MUCl核蛋白抗体，抗人异常糖基化的MUCl抗体，对抗含有ED-B结构域的人纤连蛋白变体的抗体或抗人HER2/neu抗体。[0135]本发明还涉及在宿主细胞中生产多肽的方法，包括(a)在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III活性或β (1，4)_半乳糖基转移酶(“GalT”)活性的融合多肽的核酸，产生的多肽选自整个抗体分子、含有Fe区的抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中所述具有GnTIII活性或GalT活性的融合多肽的表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽Fe区中的寡糖；和(b)分离所述多肽。优选实施方案中，融合多肽包括β (1，4)-Ν-乙酰氨基葡糖转移酶III的催化结构域。特别优选的实施方案中，融合多肽进一步包括高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域。优选，高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II或β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I (GnTI)的高尔基体定位结构域。或者，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶I的定位结构域、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II的定位结构域和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。本发明方法产生的多肽具有提高的Fe受体结合亲和性和/或提高的效应子功能。优选，提高的效应子功能是以下一个或多个=Fc介导的细胞毒性的提高(包括抗体依赖性细胞毒性的提高)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的提高、细胞因子分泌的提高、通过抗原递呈细胞的免疫复合体介导的抗原摄取的提高、和NK细胞结合的提高、和巨噬细胞结合的提高、和单核细胞结合的提高、和多形核细胞结合的提高、靶结合抗体交联的提高、诱导凋亡的直接信号的增强、树突细胞成熟的提高和T细胞致敏的提高。提高的Fe受体结合亲和性优选是和Fe活化受体如Fe Y RIIIa受体结合的提闻。
[0136]另一实施方案中，本发明涉及通过本发明方法生产的多肽，其在所述多肽的Fe区中具有增加比例的二等分(bisected)寡糖。仍然另一实施方案中，作为所述修饰的结果通过本发明方法生产的多肽具有增加比例的Fe区中非岩藻糖基化的寡糖。非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合型或复合型。特别优选的实施方案中，通过本发明的宿主细胞和方法生产的多肽具有增加比例的Fe区中二等分、非岩藻糖基化的寡糖。二等分、非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合的或复合的。特别地，本发明方法可以用于生产多肽，其中多肽Fe区中的寡糖的至少15%、更优选至少20%、更优选至少25%、更优选至少30%、更优选至少35%、更优选至少40%、更优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%，是非岩藻糖基化的。本发明方法还可以用来生产多肽，其中多肽Fe区中的寡糖至少15%、更优选至少20%、更优选至少25%、更优选至少30%、更优选至少35%、更优选至少40%、更优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%,是二等分的。仍然进一步，本发明方法可以用来生产多肽，其中多肽Fe区中的寡糖至少15%、更优选至少20%、更优选至少25%、更优选至少30%、更优选至少35%、更优选至少40%、更优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%，是二等分的、非岩藻糖基化的。本发明方法还可以用于生产多肽，其中多肽Fe区中的寡糖至少15%、更优选至少20%、更优选至少25%、更优选至少30%、更优选至少35%是二等分的杂合非岩藻糖基化的。[0137]另一实施方案中，本发明涉及通过本发明方法生产的抗体，该抗体工程化以具有提高的效应子功能和/或提高的Fe受体结合亲和性。优选，提高的效应子功能是以下的一个或多个:Fc介导的细胞毒性的提高(包括抗体依赖性细胞毒性的提高)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的提高、细胞因子分泌的提高、通过抗原递呈细胞的免疫复合体介导的抗原摄取的提闻、和NK细胞结合的提闻、和巨曬细胞结合的提闻、和单核细胞结合的提闻、和多形核细胞结合的提高、靶结合抗体交联的提高、诱导凋亡的直接信号的增强、树突细胞成熟的提高和T细胞致敏的提高。优选的实施方案中，提高的Fe受体结合亲和性是和Fe激活受体结合的提高，更优选是和Fe YRIIIa受体结合的提高。本发明进一步涉及含有Fe区的抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。这样的抗体片段和融合蛋白呈现提高的Fe受体结合亲和性和/或提高的效应子功能。
[0138]本发明进一步涉及药物组合物，包括本发明的抗体、保留Fe区的抗体片段以及融合蛋白和药物学上可接受的载体，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0139]本发明进一步涉及该药物组合物在治疗癌症方法中的用途。特别地，本发明涉及治疗癌症的方法，包括给药治疗有效量的本发明药物组合物。
[0140]本发明还涉及宿主细胞，包括含有编码融合多肽的核酸分子的表达载体，其中融合多肽具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII活性)并含有高尔基体停留多肽的定位结构域；和包括编码多肽的核酸分子的表达载体，其中多肽具有α-甘露糖苷酶II (ManII)活性。优选实施方案中，编码融合多肽的核酸分子和编码具有甘露糖苷酶II活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上或分开的表达载体上。另一优选实施方案中，融合多肽含有GnTIII的催化结构域。另外的优选实施方案中，高尔基体定位结构域是Manll、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶1、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I1、甘露糖苷酶I或α I, 6-Ν核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。进一步优选的实施方案中，宿主细胞选自哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞。优选，宿主细胞是CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、Ρ3Χ63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞。
[0141]本发明进一步提供宿主细胞，包括含有编码融合多肽的核酸分子的表达载体，融合多肽具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII活性)并含有高尔基体停留多肽的定位结构域，含有编码多肽的核酸分子的表达载体，其中多肽具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性，和含有编码多肽的核酸分子的表达载体，其中多肽具有β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II (GnTII)活性。优选实施方案中，编码融合多肽的核酸分子、编码具有ManII活性的多肽的核酸分子和编码具有GnTII活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上或分开的表达载体上。还优选的是编码融合多肽的核酸分子在一个表达载体上，而编码具有ManII活性多肽的核酸分子和编码具有GnTII活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上。还优选的是，编码具有ManII活性的多肽的核酸分子在一个表达载体上，而编码融合多肽的核酸分子和编码具有GnTII活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上。另一实施方案中，GnTII在一个表达载体上，而编码融合多肽的核酸分子以及编码具有ManII活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上。
[0142]另外一方面，本发明涉及宿主细胞，包括含有编码融合多肽的核酸分子的表达载体，其中融合多肽具有β (1，4)_半乳糖基转移酶(GalT)活性并包括高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域；和含有编码多肽的核酸分子的表达载体，其中多肽具有甘露糖苷酶II (ManII)活性。优选实施方案中，编码融合多肽的核酸分子、编码具有ManII活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上或在分开的表达载体上。优选，融合多肽含有GalT的催化结构域。另外的实施方案中，高尔基体定位结构域是ManI1、i3 (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶1、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I1、甘露糖苷酶I或α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选实施方案中，宿主细胞选自哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。优选，宿主细胞是CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、Ρ3Χ63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞。
[0143]另外一方面，本发明涉及宿主细胞，包括含有编码融合多肽的核酸分子的表达载体，其中融合多肽具有β (1，4)_半乳糖基转移酶(GalT)活性并包括高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域；和含有编码多肽的核酸分子的表达载体，其中多肽具有甘露糖苷酶
II(ManII)活性；以及含有编码多肽的核酸分子的表达载体，其中多肽具有β (1，2)_Ν_乙酰氨基葡糖转移酶II (GnTII)活性。优选，每个核酸分子在同一表达载体上。分开的实施方案中，每个核酸分子在分开的载体上。本发明进一步提供编码融合多肽的核酸分子是在一个表达载体上，而编码具有ManII活性的多肽的核酸分子和编码具有GnTII活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上。本发明还提供了编码ManII的核酸分子在一个表达载体上，而编码融合多肽的核酸分子和编码具有GnTII活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上。本发明还提供了编码具有GnTII活性的多肽的核酸分子在一个表达载体上，而编码融合多肽的核酸分子和编码具有ManII活性的多肽的核酸分子在同一表达载体上。优选实施方案中，融合多肽含有GalT的催化结构域。进一步优选的实施方案中，高尔基体定位结构域是ManI1、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶1、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶I1、甘露糖苷酶I或α 1，6-Ν核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
[0144]本发明进一步提供了宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GnTIII活性的融合多肽的核酸和至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，其中宿主细胞产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0145]本发明还提供了宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GnTIII活性的融合多肽的核酸、至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸和至少一种编码具有GnTII活性的多肽的核酸，表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，其中宿主细胞产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0146]本发明另外提供了宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GalT活性的融合多肽的核酸和至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，其中宿主细胞产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。[0147]分开的实施方案中，本发明还提供了宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GalT活性的融合多肽的核酸、至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸和至少一种编码具有GnTII活性的多肽的核酸，表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，其中宿主细胞产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。优选，作为修饰的结果通过宿主细胞产生的多肽呈现提高的Fe受体结合亲和性。另外的优选实施方案中，作为修饰的结果宿主细胞产生的多肽呈现提高的效应子功能。优选，提高的效应子功能是以下的一个或多个:Fc介导的细胞毒性的提高、和NK细胞结合的提高、和巨噬细胞结合的提高、和多形核细胞结合的提高、和单核细胞结合的提高、诱导凋亡的直接信号的增强、树突细胞成熟的提高和/或T细胞致敏的提闻。[0148]另外的实施方案中，本发明涉及在宿主细胞中生产多肽的方法，包括在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GnTIII活性的融合多肽的核酸和至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，所产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中融合多肽表达的量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖；和分离多肽。优选，进一步将宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GnTII活性的多肽的核酸。另外的优选实施方案中，融合多肽包括GnTIII的催化结构域。进一步优选的实施方案中，融合多肽包括异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域。优选，高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶I1、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶1、甘露糖苷酶1、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II或α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选，作为上述修饰的结果，多肽具有提高的效应子功能。
[0149]本发明进一步涉及在宿主细胞中生产多肽的方法，包括在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞是工程化来表达至少一种编码具有GalT活性的融合多肽的核酸和至少一种编码具有ManII活性的多肽的核酸，所产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中融合多肽的表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖。另外的实施方案中，进一步将宿主细胞工程化来表达至少一种编码具有GnTII活性的多肽的核酸。优选，融合多肽包括GalT的催化结构域。还优选的是融合多肽进一步包括异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域。优选，高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶I1、β (1，2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶1、甘露糖苷酶1、β (I, 2)-N-乙酰氨基葡糖转移酶II或α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选，作为上述修饰的结果，多肽具有提高的效应子功能。特别地，优选实施方案中，宿主细胞产生的多肽在Fe区中具有比例增加的二等分、非岩藻糖基化的寡糖。优选，二等分、非岩藻糖基化的寡糖是杂合的。更优选，二等分、非岩藻糖基化的寡糖是复合的。优选实施方案中，多肽Fe区中的寡糖至少约10%至95%是二等分、非岩藻糖基化的。特别优选本发明糖基化多肽 Fe 区中的寡糖约 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%是二等分、非岩藻糖基化的。
[0150]另外的优选实施方案中，本发明提供了根据本发明方法工程化的具有提高的效应子功能的抗体。
[0151]另外的实施方案中，本发明进一步提供了含有根据本发明方法工程化的抗体的药物组合物。优选，本发明药物组合物包括药物学上可接受的载体。
[0152]本发明进一步提供了治疗恶性肿瘤的方法，包括将治疗有效量的本发明药物组合物给药于需要的患者 。
[0153]本发明进一步涉及在宿主细胞中生产具有提高的Fe介导的细胞毒性的多肽的方法，包括在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞是工程化来表达至少一种编码GalT的核酸和至少一种编码ManII的核酸，所产生的多肽选自整个抗体分子、包括免疫球蛋白Fe区的抗体片段，其中GalT或ManII中的一个或两个的表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，且其中作为修饰的结果多肽具有提高的Fe介导的细胞毒性；和分离具有提高的Fe介导的细胞毒性的多肽。另外的优选实施方案中，GalT的表达水平产生了具有提高的Fe介导的细胞毒性的抗体分子或包括免疫球蛋白Fe区的抗体片段。
[0154]本发明进一步涉及在宿主细胞中生产具有提高的Fe介导的细胞毒性的多肽的方法，包括在允许多肽产生的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞是工程化来表达至少一种编码GalT的核酸和至少一种编码ManII的核酸，所产生的多肽选自整个抗体分子、包括免疫球蛋白Fe区的抗体片段，其中GalT或ManII中的一个或两个的表达水平足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，且其中作为修饰的结果多肽具有提高的Fe介导的细胞毒性；和分离具有提高的Fe介导的细胞毒性的多肽。优选实施方案中，上述宿主细胞进一步包括至少一种编码GnTIII的核酸，其中GnTIII的表达量足以修饰宿主细胞产生的多肽Fe区中的寡糖，且其中作为修饰的结果多肽具有提高的Fe介导的细胞毒性。优选，GalT、ManII或GnTIII中的一个或多个的表达水平足以形成多肽Fe区中的二等分寡糖。更优选，Fe区中的二等分寡糖对Fe区中总寡糖的比例至少约25、35、45、55、60、65、70、75、80、85、90或95%。优选，Fe区中的二等分寡糖对Fe区中总寡糖的比例至少约45%。优选实施方案中，二等分寡糖是复合的或杂合的。优选，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。更优选，宿主细胞是植物细胞。
[0155]另一方面，本发明涉及在宿主细胞中生产多肽的方法:
[0156]a.在允许产生多肽的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞是工程化来表达至少一种编码具有α-甘露糖苷酶II活性的核酸分子，所产生的多肽选自整个抗体分子、抗体片段和融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域，其中所述具有α-甘露糖苷酶II活性的多肽的表达量足以修饰所述宿主细胞产生的所述多肽的Fe区中的寡糖；和
[0157]b.分离所述宿主细胞产生的所述多肽。
[0158]本发明还涉及作为所述修饰寡糖的结果具有提高的效应子功能和/或提高的Fe受体结合的多肽，尤其是抗体，以及它们在治疗疾病尤其是肿瘤的治疗组合物中的用途。
[0159]需要修饰糖基化模式的蛋白的编码核酸的鉴定和产生
[0160]本发明提供了生产的方法和宿主系统的用途，用来生产糖基化形式的抗体、含有Fe区的抗体片段和融合蛋白，融合蛋白的一个区域等价于免疫球蛋白的Fe区，具有提高的Fe受体结合亲和性，优选Fe激活受体，和/或具有提高的效应子功能，包括抗体依赖性细胞毒性。靶表位的鉴定和具有潜在治疗价值的其糖基化模式需要修饰的抗体的产生，及其各自编码核酸序列的分离都在本发明范围之内。
[0161]可以使用各种本领域已知的方法来生产目的靶表位的抗体。这样的抗体包括但不限制于多克隆、单克隆、嵌合、人源化、全人、单链、Fab片段和通过ScFv、Fab、VH、IgG表达文库产生的片段。这样的抗体可以用作如诊断剂或治疗剂。作为治疗剂，特别优选中和抗体，即那些和配体、底物以及连接物分子结合相竞争的抗体。 [0162]对于抗体生产，通过注射目的靶蛋白来免疫各种宿主动物，包括但不限制于兔子、小鼠、大鼠等。通过多次皮下(SC)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生多克隆抗体。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来增强免疫应答，包括但不限制于，弗氏佐剂(完全和不完全的)、矿物胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、皂苷、油乳浊液，匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和可能有用的人佐剂如BCG (卡介苗)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。通过将如100g或5g蛋白质或缀合物(各自对于兔子和小鼠)和3体积弗氏完全佐剂，并在多个部位将溶液皮内注射来将动物免疫以对抗抗原、免疫缀合物或衍生物。一个月后，通过在多个部位皮下注射弗氏佐剂中1/5至1/10原始量的肽和缀合物来加强动物，7至14天后，将动物去毛并分析血清的抗体滴定。加强动物直至滴定平稳。优选，用相同抗原但和不同的蛋白质和/或通过不同的交联剂缀合的缀合物加强动物。还可以在重组细胞培养物如蛋白融合中制得缀合物。
[0163]使用通过连续培养细胞系产生抗体分子的任何技术来制备靶目标的单克隆抗体。这些包括，但不限制于，杂交瘤技术，最初描述于Kohler和Milstein, Nature256:495-97 (1975),人 B 细胞杂交瘤技术(Kosbor 等，ImmunologyToday4: 72 (1983) ; Cote 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.80: 2026-30 (1983),和 EBV-杂交瘤技术(Cole 等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy77-96 (Alan R.Liss, Inc., 1985));此外，可以使用发展来生产“嵌合抗体”的技术(Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81:6851-55 (1984) ; Neuberger等,Nature312:604-08 (1984) ; Takeda 等,Nature314:452-54 (1985)，通过拼接来自合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自合适生物活性的人抗体分子的基因。这些技术可以用来产生嵌合抗体，还包括其他哺乳动物的抗体分子。或者，可以使用描述用来生产单链抗体的技术(美国专利4，946，778)来生产具有理想特异性的单链抗体。本发明进一步涉及根据本发明方法已经糖基工程化的人源化抗体。生产人化抗体的方法公开于例如，Queen等的美国专利N0.6，180, 320，在此以其整体引入作为参考。
[0164]可以通过已知技术来生产含有目的靶蛋白特异性结合位点的抗体片段。例如，这样的片段包括，但不限制于，通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段和通过还原F(ab’)2片段的二硫桥键产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库((Huse等，Science246:1275-81 (1989))来快速而容易地鉴定出带有目的靶蛋白理想特异性的单克隆Fab片段。
[0165]一旦鉴定出糖基化模式具有需要修饰的抗体或抗体片段，使用本领域公知的技术鉴定和分离编码核酸序列。
[0166]a.用于产生具有改变的糖基化模式的蛋白质的细胞系的生产
[0167]本发明提供了用于生产具有改变的糖基化模式的蛋白质的宿主细胞表达系统。尤其是，本发明提供了用于生产具有提高治疗价值的糖基化形式的蛋白质的宿主细胞系统。因此，一方面，本发明提供了宿主细胞表达系统，其是经选择或工程化来表达例如具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并包括异源高尔基体停留多肽的定位结构域的融合多肽。特别地，这样的宿主细胞表达系统可以工程化来含有编码这样的融合多肽的重组核酸分子，可操作地和组成型或调节的启动子系统连接。
[0168]一特定实施方案中，本发明提供了宿主细胞，该宿主细胞已经工程化来表达至少一种编码具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异源高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的核酸。一方面，将宿主细胞工程化来包括至少一种编码具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的基因的核酸分子。
[0169]通常，任何类型的培养细胞系可以用作来工程化本发明宿主细胞系的背景。优选实施方案中，CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、Ρ3Χ63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、其他哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞用作产生本发明工程化宿主细胞的背景细胞系。(参见Ma，J.K.-C.，等，NatureGenetics4:794-805 (2003年10月)及其引用的参考文献)(其全部内容在此引入作为参考)。
[0170]本发明涉及包括如在此所定义的表达具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III(GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的任何工程化宿主细胞。
[0171]可以在组成型启动子或可调表达系统控制下，表达一个和数个编码具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII活性)并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的核酸。合适的可调表达系统包括，但不限制于，四环素可调表达系统、蜕皮激素可诱导的表达系统、Iac-开关表达系统、糖皮质激素可诱导的表达系统、温度诱导的启动子系统和金属硫蛋白金属诱导的启动子系统。如果宿主细胞系统中包括数个不同的编码具有β ( 1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的核酸，其中的一些可以在组成型启动子控制下表达，而另一些在可调表达系统控制下表达。认为最大表达水平是稳定融合多肽表达的对细胞生长率没有显著副作用的最高可能水平，使用常规试验来测定。通过本领域通常已知的方法来测定表达水平，包括Western印迹分析，使用对具有GnTIII活性的多肽特异性的抗体或对和具有GnTIII活性的多肽融合的肽标记特异性的抗体,Northern印迹分析，使用对编码具有GnTIII活性的多肽的基因特异性的核酸探针或对编码和具有GnTIII活性的多肽融合的肽标记的核酸特异性的探针，或测量GnTIII活性。或者，可以使用和GnTIII的生物合成产物结合的凝集素，例如，E4-PHA凝集素。或者，可以使用功能性试验，其测量了通过细胞产生的抗体介导的提高的Fe受体结合和提高的效应子功能，该细胞工程化而具有编码GnTIII活性多肽的核酸。进一步的替换方案中，核酸可以和报告基因可操作地连接；通过测量报告基因表达水平相关的信号来测定具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶
III(GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的表达水平。报告基因可以和编码融合多肽的核酸作为单个mRNA分子一起转录；通过内部核糖体进入位点(IRES)和通过帽独立翻译增强子(CITE)来连接各自的编码序列。报告基因可以和至少一个编码具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的核酸一起翻译，使得形成单个肽链。编码本发明融合多肽的核酸可以在单个启动子的控制下可操作地和报告基因连接，使得编码融合多肽的核酸和报告基因转录成RNA分子，其可变剪接成两个分开的信使RNA (mRNA)分子；所得到mRNA中的一个翻译成报告蛋白，另一个翻译成融合多肽。
[0172]如果表达了数个不同的编码具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域融合多肽的核酸，它们可以这样安排使得它们以一个和数个mRNA分子转录。如果它们作为单个mRNA分子转录，通过内部核糖体进入位点(IRES)和通过帽子独立翻译增强子(CITE)来连接各自的编码序列。可以将它们从单个启动子转录成RNA分子，其可变剪接成数个分开的信使RNA (mRNA)分子，然后其每个翻译成各自编码的融合多肽。
[0173]另一实施方案中，本发明提供了宿主表达系统，用于生广治疗抗体，具有提闻的Fe受体结合亲和性，尤其是和Fe激活受体结合，和提高的效应子功能，包括抗体依赖性细胞毒性。通常，宿主细胞表达系统已经工程化和/或选择来表达编码需要产生改变的糖基化形式的抗体的核酸，和至少一种编码具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的核酸一起表达。一实施方案中，用至少一种编码这样的融合多肽的核酸来转染宿主细胞系统。通常，选择转染的细胞来鉴定和分离稳定表达本发明融合多肽的克隆。
[0174]任何类型的培养细胞系可以用作来工程化本发明宿主细胞系的背景。优选实施方案中，可以使用CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、Ρ3Χ63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、其他哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。通常，这样的细胞系工程化来进一步包括至少一种转染的核酸，该核酸编码整个抗体分子、含有免疫球蛋白Fe区的抗体片段或融合蛋白，融合蛋白包括等价于免疫球蛋白Fe区的区域。通常这样的抗体生产细胞系源自以20至120pg/(细胞.天)高特异性产量产生和分泌抗体的克隆。可替换的实施方案中，表达目的特定抗体的杂交瘤细胞系用作生产本发明工程化细胞的背景细胞系。
[0175]—实施方案中，将编码抗体、抗体片段或Fe融合多肽的核酸克隆进抗体表达载体中，然后转染进宿主细胞中，并选择和筛选特异性抗体产量高且稳定的细胞克隆。然后用糖蛋白-修饰糖基转移酶表达载体转染这样所选择的克隆，该表达载体含有编码以下的核酸，例如，(a)具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性的融合多肽，或(b)具有β (1，4)_半乳糖基转移酶(GalT)活性的融合多肽，或(C)具有高尔基体α-甘露糖苷酶II (ManII)活性的多肽，或(d)具有GnTIII活性的融合多肽和进一步具有ManII活性的多肽，或(e)具有GalT活性的融合多肽和进一步具有ManII活性的多肽。然后选择和筛选克隆，该克隆在导致抗体特异性高产量的水平上稳定表达抗体编码基因，和在导致Fe区糖基化模式修饰的表达水平上稳定表达糖蛋白修饰糖基化转移酶基因，所述修饰包括非岩藻糖基化寡糖部分的增加，寡糖是二等分或非二等分的，其进一步可以是复合型或杂合型，其和增加的Fe受体结合相关，特别是Fc-Fc YRIII结合亲和性的提高，和Fe受体介导的效应子功能的提高，包括但不限于Fe依赖性细胞毒性。以下描述选择和筛选方法。
[0176]另一实施方案中,颠倒上述两个转染即抗体表达载体转染和糖蛋白修饰糖基化转移酶表达系统载体转染的次序，即首先用糖蛋白修饰糖基转移酶表达载体转染宿主细胞，然后用抗体表达载体转染。这样的方法中，可以通过以下进一步描述的任一方法筛选来自第一个转染足够稳定表达水平的糖基转移酶基因的克隆，或者用抗体表达载体瞬时转染该克隆的复制子，然后用以下进一步描述的筛选方法，以便鉴定出稳定表达水平的糖基转移酶基因的克隆，该表达水平导致Fe区糖基化模式的修饰和导致提高Fe受体包括Fe Y RIII受体的结合亲和性以及提高Fe受体介导的效应子功能，包括Fe依赖性细胞毒性。
[0177]进一步实施方案中，在单个转染步骤中一起转染抗体编码基因和糖基转移酶基因，在单个表达载体中或在分开的载体中。[0178]通常，宿主细胞系统中的至少一种核酸编码具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性或β (1，4)-半乳糖基转移酶活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽，或者，其编码具有高尔基体α -甘露糖苷酶II活性的多肽。
[0179]可以在组成型启动子或可调表达系统的控制下来表达一个或数个编码本发明融合多肽的核酸。合适的可调表达系统包括，但不限制于，四环素可调表达系统、蜕皮激素可诱导的表达系统、Iac-开关可调表达系统、糖皮质激素可诱导的表达系统、温度可诱导的启动子系统和金属硫蛋白金属诱导的表达系统。如果宿主细胞系统中包括数个不同的编码具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的核酸，其中的一些可以在组成型启动子控制下表达，而另一些在可调表达系统控制下表达。认为最大表达水平是稳定融合多肽表达的对细胞生长率没有显著副作用的最高可能水平，使用常规试验来测定。通过本领域通常已知的方法来测定表达水平，包括Western印迹分析，例如使用对具有GnTIII活性的多肽特异性的抗体或对和具有GnTIII活性的多肽融合的肽标记特异性的抗体,Northern印迹分析,例如使用对编码具有GnTIII活性的多肽的基因特异性的核酸探针或对编码和具有GnTIII活性的多肽融合的肽标记的核酸特异性探针，或测量GnTIII活性。或者，可以使用和GnTIII的生物合成产物结合的凝集素，例如,E4-PHA凝集素。或者，可以使用功能性试验，其测量了通过细胞产生的抗体介导的提高的Fe受体结合和提高的效应子功能，该细胞工程化而具有编码GnTIII活性多肽的核酸。进一步的替换方案中，核酸可以和报告基因可操作地连接；通过测量报告基因表达水平相关的信号来测定本发明融合多肽的表达水平。报告基因可以和编码所述糖蛋白-修饰糖基转移酶的核酸作为单个mRNA分子一起转录；通过内部核糖体进入位点(IRES)和通过帽独立翻译增强子(CITE)来连接各自的编码序列。报告基因可以和至少一个编码具有β (1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的核酸一起翻译，使得形成单个肽链。编码融合多肽的核酸可以在单个启动子的控制下可操作地和报告基因连接，使得编码本发明融合多肽的核酸和报告基因转录成RNA分子，其可变剪接成两个分开的信使RNA (mRNA)分子；所得到mRNA中的一个翻译成报告蛋白，另一个翻译成融合多肽。
[0180]如果表达了数个不同编码具有β (I, 4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的核酸，它们可以这样排列使得它们转录成一个和数个mRNA分子。如果它们作为单个mRNA分子转录，通过内部核糖体进入位点(IRES)和通过帽子独立翻译增强子(CITE)来连接各自的编码序列。它们可以从单个启动子转录成RNA分子，其可变剪接成数个分开的信使RNA (mRNA)分子，然后其每个翻译成各自编码的融合多肽。
[0181]1.表达系统
[0182]可以使用本领域据技术人员公知的方法来构建表达载体，该表达载体含有目的蛋白质的编码序列和具有β (1，4)-Ν-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的编码序列以及合适的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。参见，例如描述于 Maniatis 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, N.Y.(1989)和 Ausubel 等,Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates 和 Wiley Interscience, N.Y(1989)中的技术。
[0183]可以利用各种宿主-表达系统来表达本发明目的蛋白质的编码序列和融合多肽的编码序列。优选，哺乳动物细胞用作宿主细胞系统，用含有目的蛋白质的编码序列和融合多肽的编码序列的重组质粒DNA或粘粒DNA表达载体来转染。更特别地，CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、其它哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞用作宿主细胞系统。表达系统和选择方法的一些实例描述于以下的参考文献中，在此作为参考:Borth等，Biotechnol.Bioen.71 (4): 266-73 (2000-2001), Werner 等，Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8):870-80(1998), Andersen 和 Krummen, Curr.0p.Biotechnol.13:117-123(2002), Chadd 和 Chamow, Curr.0p.Biotechnol.12:188-194(2001),和 Giddings, Curr.0p.Biotechnol.12:450-454(2001)。另一实施方案中，可以使用其它真核宿主细胞系统，包括酵母细胞，用含有目的蛋白质的编码序列和本发明的融合多肽的编码序列的重组酵母表达载体转染；昆虫细胞系统，用含有目的蛋白质的编码序列和本发明融合多肽的编码序列的重组病毒表达载体(例如,杆状病毒)感染；植物细胞系统，用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV ;烟草花叶病毒，TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转染，表达载体含有目的蛋白质的编码序列和本发明融合多肽的编码序列；或动物细胞系统，用重组病毒表达载体(例如，腺病毒，牛痘病毒)感染，表达系统包括工程化来含有多拷贝的编码目的蛋白质DNA的序列和本发明融合多肽的编码序列的在双微染色体中(例如小鼠细胞系)稳定扩增(CHO/dhfr)或不稳定扩增的细胞系。 [0184]对于本发明的方法，通常稳定表达比瞬时表达优选，因为稳定表达通常获得更多重现性的结果还更易于大规模生产，即，在生产规模的细胞系中生产本发明的糖基工程化抗体。除了使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞还可以用通过合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)来控制的各自编码核酸和可选择标记转化。引入外源DNA后，使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换至选择培养基。重组质粒中的可选择标记给予了用来选择的抗性并选择细胞，该细胞稳定地将质粒整合进它们的染色体并生长来形成基因座(foci)，接着克隆并扩展成细胞系。
[0185]可以使用多种选择系统，包括但不限制于，单纯疱疹病毒胸苷激酶((Wigler等，Cellll:223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA48:2026 (1962)),和腺嘌呤憐酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell22:817 (1980))基因，其各自可以用于tk_、hgprt_或aprt_细胞中。还有，抗代谢物抗性可以用作选择以下的基础:dhfr，其给予了氨甲喋呤抗性(Wigler 等，Natl.Acad.Sc1.USA77: 3567 (1989) ; O，Hare 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:1527 (1981)) ；gpt,其给予霉酌.酸抗性(Mulligan&Berg, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:2072 (1981)) ；neo,其给予了氨基糖苷 G-418 抗性(Colberre-Garapin 等，J.Mol.Biol.150:1 (1981)),和 hygro,其给予了潮霉素抗性(Santerre 等,Gene30:147 (1984)。最近，描述了其它选择基因，即trpB，其使细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其使细胞利用组氨醇替代组氨酸(Hartman&Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:8047 (1988))；谷氨酰胺合酶系统；和0DC(鸟氨酸脱羧酶)，其给予了鸟氨酸脱羧酶抑制剂、2-( 二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO 的抗性(McConlogue: Current Communication in MolecularBiology, Cold Spring Harbor Laboratory 编辑(1987))。
[0186]i1.表达具有修饰的糖基化模式蛋白质的转染子或转化子的鉴定
[0187]通过至少四个常规方法来鉴定含有编码序列和表达生物活性基因产物的宿主细胞；(a) DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(b) “标记”基因功能的存在或缺失；(c)评价转录水平，通过宿主细胞中各自mRNA转录本的表达来测量；和(d)检测基因产物，通过免疫试验或其生物活性来测量。
[0188]第一个方法中，使用含有和各自编码序列或其部分或其衍生物同源的核苷酸序列的探针通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交来检测插入表达载体中的目的蛋白质的编码序列和本发明融合多肽的编码序列的存在。
[0189]第二个方法中，基于特定“标记”基因功能的存在或不存在(例如，胸苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲喋呤抗性、转化表型、杆状病毒中包涵体的形成等)来鉴定和选择重组表达载体/宿主系统。例如，如果目的蛋白质的编码序列和本发明的融合多肽编码序列插入载体的标记基因序列中，通过标记基因功能的缺失来鉴定含有各自编码序列的重组子。或者，标记基因可以和编码序列串联放置，在用来控制编码序列表达的相同或不同启动子的控制下。标记响应诱导或选择的表达表明了目的蛋白质的编码序列和融合多肽的编码序列的表达。
[0190]第三个方法中，通过杂交试验来评价目的蛋白质的编码序列和本发明融合多肽的编码序列的转录活性。例如，使用和目的蛋白质的编码序列和本发明融合多肽的编码序列或其特定部分同源的探针通过Northern印迹来分离和分析RNA。或者，可以提取宿主细胞的总核酸并试验和这样探针的杂交。
[0191]第四个方法中，可以免疫学评价目的蛋白的蛋白产物的表达和具有β (1，4)-Ν-乙酰氨基葡糖转移酶III (GnTIII)活性并含有异种高尔基体停留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的编码序列的表达,例如通过Western印迹，免疫试验如放射性免疫沉淀、酶联免疫试验等。然而，表达系统的成功最终试验包括生物活性基因产物的检测。
[0192]b.具有改变的糖基化模式的蛋白质和蛋白质片段的产生和用途
[0193]1.具有提高的效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性的抗体的产生和用途
[0194]优选实施方案中，本发明提供了具有提高的Fe受体结合和/或效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性的糖基化形式的抗体和抗体片段。
[0195]未缀合单克隆抗体(mAb)用于治疗一些癌症的临床试验最近已经产生了鼓舞人心的结果。Dillman, Cancer Biother.&Radiopharm.12:223-25 (1997) ；Deo 等，ImmunologyTodayl8:127 (1997)。嵌合的、未缀合 IgGl已经批准用于低级或滤泡B-细胞非霍奇金氏淋巴瘤。Dillman, Cancer Biother.&Radiopharm.12:223-25 (1997),而另一未缀合mAb,祀向实体乳腺肿瘤的人源化IgGl,已经在III期临床试验中显示出远景结果。Deo等，Immunology Todayl8:127 (1997)。这两个mAb的抗原在它们各自的肿瘤细胞中高度表达且通过效应细胞在体外或体内抗体介导有效的肿瘤破坏。相反，许多其它未缀合mAb带有细微的肿瘤特异性不能引发足以有效用于临床应用的效应子功能。Frost等，Cancer80:317-33 (1997) ; Surfus 等,J.1mmunother.19:184-91 (1996)。对于这些较弱 mAb中的一些，最近测试了辅助细胞因子治疗。添加细胞因子通过提高循环淋巴细胞的活性和数量可以刺激抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。Frost等，Cancer80:317-33 (1997) ；Surfus等，J.1mmunother.19:184-91 (1996)。ADCC，抗体靶细胞的溶胞攻击，由于白细胞受体和抗体恒定区(Fe)的结合而被引发。Deo 等，Immunology Todayl8:127 (1997)。
[0196]提高未缀合IgGl的ADCC活性的不同但互补的方法是工程化抗体的Fe片段。蛋白质工程研究已经显示Fe YR和IgG CH2结构域的较低铰链区相互作用。Lund等，J.1mmunol.157:4963-69(1996)。然而，Fe Y R结合还需要存在和CH2区保守Asn297处共价连接的寡糖。Lund 等,J.1mmunol.157:4963-69 (1996) ；ffright 和 Morrison, TrendsBiotech.15:26-31 (1997)，提出寡糖和多肽都直接提供了相互作用位点或需要寡糖来保持活性CH2多肽构象。因此，寡糖结构的修饰可以发展成提高相互作用亲和性的方法。
[0197]IgG分子在其Fe区中携带两个N-连接寡糖,每个重链中一个。和任何糖蛋白一样，抗体以糖基化形式的群体产生，其共享相同多肽主链但具有和糖基化位点连接的不同寡糖。通常发现于血清IgG Fe区中的寡糖是复合双触角型(b1-antennary type) ((Wormald等，Biochemistry36:130-38 (1997)),带有低含量的末端唾液酸和二等分N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)，和可变程度的末端半乳糖基化和核心岩藻糖基化。一些研究表明Fe Y R结合需要的最小糖结构位于寡糖核心中。Lund等，J.1mmunol.157:4963-69(1996)。
[0198]用于工业和学术界中来生产未缀合治疗mAb的小鼠或仓鼠来源的细胞系通常将所需寡糖决定簇连接至Fe位点。然而,这些细胞系表达的IgG缺乏在低量血清IgG中发现的二等分 GlcNAcο Lifely 等,Glycobiology318:813-22 (1995)。相反,最近观察到大鼠骨髓瘤产生的人源化IgGl (CAMPATH-1H)在其一些糖基化形式中携带二等分GlcNAc。Lifely等，Glycobiology318:813-22(1995)。大鼠细胞来源的抗体达到和标准细胞系中产生的CAMPATH-1H抗体相似最大量的体外ADCC活性，但是在非常低的抗体浓度。
[0199]CAMPATH抗原通常以高水平存在淋巴瘤细胞上，且在二等分GlcNAc缺失下该嵌合mAb 具有高 ADCC 活性。Lifely 等，Glycobiology318:813-22 (1995)。N-连接糖基化途径中，通过酶β (1,4) -N-乙酰氨基葡糖转移酶III(GnTIII)加入二等分GlcNAc。Schachter,Biochem.Cell Biol.64:163-81(1986)。
[0200]之前的研究使用了单个抗体产生CHO细胞系，该细胞系之前已经工程化以外部调节方式来表达不同水平的克隆GnTIII基因酶(Umana, P.等，NatureBiotechnol.17:176-180 (1999))。该方法第一次建立了 GnTIII表达和修饰抗体ADCC活性之间的严格相关性。
[0201]进一步本发明具有提高的Fe受体结合亲和性和提高的效应子功能的抗体，包括但不限制于，通过本发明方法产生的抗人成神经细胞瘤单克隆抗体(chCE7)，通过本发明方法产生的嵌合抗人肾细胞癌单克隆抗体(chG250)，通过本发明方法产生的人源化抗HER2单克隆抗体(例如，Trastuzumab (HERCEPTIN)，通过本发明方法产生的嵌合抗人结肠、肺和乳癌单克隆抗体(ING-1)，通过本发明方法产生的人源化抗人17-1A抗原单克隆抗体(3622W94)，通过本发明方法产生的人源化抗人结肠直肠的肿瘤抗体(A33)，通过本发明方法产生的直接对抗GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体(R24)，和通过本发明方法产生的嵌合抗人鳞状细胞癌单克隆抗体(SF-25)，通过本发明方法产生的抗人小细胞肺癌单克隆抗体(BEC2, Imclone Systems, Merck KgaA),通过本发明方法产生的抗人非霍金奇氏淋巴瘤单克隆抗体(Bexxar (tositumomab, Coulter Pharmaceuticals), Oncolym(Techniclone, Alpha Therapeutic)),通过本发明方法制得的抗人鳞状细胞头和颈癌单克隆抗体(C225, ImClone Systems),通过本发明方法制得的抗人直肠和结肠癌单克隆抗体(PanoreX (edrecolomab), Centocor, Glaxo Wellcome),通过本发明方法产生的抗人卵巢癌单克隆抗体(Theragyn, Antisoma)，通过本发明方法产生的抗人急性骨髓性白血病癌单克隆抗体(SmartM195, Protein Design Labs, Kanebo),通过本发明方法产生的抗人恶性神经胶质瘤单克隆抗体(Cotara, Techniclone, Cambridge Antibody Technology),通过本发明方法产生的抗人B细胞非霍金奇氏淋巴瘤单克隆抗体(IDEC-Y2B8，IDECPharmaceuticals)，通过本发明方法产生的抗人实体肿瘤的单克隆抗体(CEA-Cide, Immunomedics),通过本发明方法产生的抗人结肠直肠癌单克隆抗体(碘131-MN-14, Immunomedics),通过本发明方法产生的抗人卵巢、肾脏、乳腺和前列腺癌单克隆抗体(MDX-210, Medarex, Novartis),通过本发明方法产生的抗人结肠直肠和胰腺癌单克隆抗体(TTMA, Pharmacie&Upjohn),通过本发明方法产生的抗人TAG-72表达癌单克隆抗体(MDX-220，Medarex)，通过本发明方法产生的抗人EGFr-表达癌单克隆抗体(MDX-447)，通过本发明方法产生的抗VEGF单克隆抗体(Genentech)，通过本发明方法产生的抗人乳腺、肺、前列腺和胰腺癌和恶性黑素瘤单克隆抗体(BrevaRex, AltaRex)，通过本发明方法产生的抗人急性骨髓性白血病单克隆抗体(MonoclonalAntibody Conjugate, Immunex)。此外,本发明涉及抗体片段和融合蛋白，融合蛋白含有等价于免疫球蛋白Fe区的区域。
[0202]i1.促进Fe介导细胞毒性的融合蛋白的产生和用途，融合蛋白含有等价于免疫球蛋白Fe区的区域
[0203]如上所述，本发明涉及提高治疗抗体的Fe受体结合亲和性和/或效应子功能的方法。这通过工程化这样抗体的Fe区的糖基化模式来实现，尤其是通过工程化抗体产生细胞来产生例如具有GnTIII活性或GalT活性或ManII活性的多肽，该多肽修饰了和这样抗体Fe区连接的寡糖。该策略可以用来提高通过带有等价于免疫球蛋白Fe区的区域的任何分子介导的而不仅是通过治疗抗体介导的对抗不理想细胞的Fe介导的细胞毒性，由于通过糖基化工程引入的改变只影响了 Fe区，因此和ADCC机理中涉及的效应细胞表面上的Fe受体相互作用。可以运用本发明公开的方法的含有Fe的分子，包括但不限制于，(a)由和Fe区N-端融合的革巴蛋白结构域制得的可溶性融合蛋白(Chamov和Ashkenazi, TrendsBiotech.14:52(1996))，和(b)由定位于和Fe片段N-端融合的原生质膜的II型跨膜结构域制得的原生质体膜锚定的融合蛋白(StabiIa, P.F., Nature Biotech.16:1357(1998)) 。
[0204]在可溶性融合蛋白(a)的情况中，靶向结构域引导融合蛋白和不期望细胞如癌细胞结合，即，以与治疗抗体类似的方式。因此，本发明公开的提高这些分子介导的效应子功能包括Fe介导的细胞毒性活性的方法的应用和运用至治疗抗体的方法相同。
[0205]在膜锚定融合蛋白(b)的情况中，体内不期望的细胞必须表达编码融合蛋白的基因。这可以通过基因治疗方法获得，即用指导融合蛋白编码基因表达的质粒或病毒载体体内转染细胞至不期望细胞，或通过将基因工程化在其表面上表达融合蛋白的细胞移植入体内。后者细胞通常在聚合物胶囊中移植入体内(胶囊化细胞治疗)，其中它们不受到Fe介导细胞毒性机理的破坏。然而，胶囊装置破碎和逃逸的细胞变得不理想，可以通过Fe介导细胞毒性来消除。Stabila等,NatureBiotech.16:1357 (1998)。在这种情况下,可以使用本发明公开的方法，通过将引导本发明融合多肽合适或最大表达水平的其它基因表达盒并入基因治疗载体中，或工程化待植入来表达合适或最大表达量的本发明融合多肽的细胞。[0206]根据本发明方法产生的抗体、抗体片段和融合多肽的治疗应用
[0207]本发明的抗体(即抗体、抗体片段和融合蛋白，其含有等价于免疫球蛋白Fe区的区域)可以单独用来靶向和杀死体内的肿瘤细胞。抗体还可以结合合适的治疗剂使用来治疗人癌症。例如，抗体可以结合常规治疗方法如化疗、放疗一起使用或和治疗药物或毒素以及淋巴因子或肿瘤抑制生长因子缀合或连接来将治疗剂传送至癌部位。
[0208]将这样的治疗剂和抗体缀合的技术是公知的[参见，例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld 等(编辑)，pp.243-56(AlanR.Liss, Inc.1985) ;Hellstrom 等，“Antibodies For Drug Delivery，，，Controlled DrugDelivery (第 2 版)，Robinson 等.(编辑)，pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987) ; Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review，，，MonoclonalAntibodies’84:Biological And Clinical Applications, Pinchera 等.(编辑),pp.475-506 (1985);和 Thorpe 等，“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62:119-58(1982)]。
[0209]或者，糖工程化抗体可以和高能辐射例如同位素如〈131>1结合，当其定位于肿瘤部位时，导致数个细胞直径的杀灭[参见，例如，Order, “Analysis, Results, andFuture Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy，，,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等(编辑)，pp.303-16(Academic Pressl985)]。仍然根据另一实施方案,本发明的抗体可以和第二抗体缀合来形成抗体异种缀合物来治疗肿瘤细胞，如Segal在美国专利N0.4，676，980中描述的。
[0210]仍然对于本发明抗体的其它治疗应用包括例如通过重组DNA技术缀合或连接至能够将前体药物转化成细胞毒性药物的酶并使用抗体-酶缀合物结合前体药物来将前体药物在肿瘤部位转化成细胞毒性剂[参见，例如，Senter等,“Ant1-Tumor Effectsof Antibody-alkaline Phosphatase ”，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4842-46(1988)；“Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of PhosphorylatedMitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal.Antibody-AlkalinePhosphatase Conjugates”， Cancer Research49:5789-5792(1989);和 Senter，“Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates:A New Approach to CancerTherapy, ” FASEB J.4:188-193 (1990)]。
[0211]仍然本发明抗体的另一治疗应用，涉及在补体或部分抗体-药物或抗体-毒素缀合物存在下，用于从癌症患者的骨髓中除去肿瘤细胞。根据该方法，通过用抗体处理可以在体外清洗自体骨髓并将骨髓灌输回患者[参见，例如，Ramsay等.，"Bone Marrow PurgingUsingMonoclonal Antibodies", J.Clin.Tmmunol., 8(2):81-88(1988)]。
[0212]此外，本发明含有所需单克隆抗体的特异性抗原结合区域的嵌合抗体、重组免疫毒素和其它重组构建体可以用于治疗。例如，本发明的单链免疫毒素可以用来体内治疗人癌症。
[0213]类似地，和具有抗肿瘤活性的另一种蛋白例如淋巴因子或制瘤素的至少功能活性部分结合的含有至少本发明抗体的抗原结合区的融合蛋白，可以用来体内治疗人癌症。此外，本领域已知的重组技术可以用来构建双特异性抗体，其中抗体的一个结合特异性涉及肿瘤相关抗原，而抗体的另一结合特异性是除了所述肿瘤相关抗原以外分子的。
[0214]本发明提供了选择性地杀灭肿瘤细胞的方法，该肿瘤细胞表达和本发明单克隆抗体或功能等价物特异性结合的抗原。该方法包括将本发明的糖基工程化抗体或含有其的免疫缀合物(例如免疫毒素)和所述肿瘤细胞接触。这些肿瘤细胞可能形成人癌症。
[0215]此外，本发明提供了体内治疗癌症(例如人癌症)的方法。该方法包括将治疗有效量的组合物给药于患者，组合物包括至少一种本发明的糖基工程化抗体或含有其的免疫缀合物(例如，免疫毒素)。
[0216]再一方面，本发明涉及基于B细胞耗尽(cbpletion)治疗由致病自体抗体全部或部分产生的免疫疾病的改良方法，包括将治疗有效量的免疫活性抗体给药于需要的患者，改良包括给药治疗有效量的根据本发明方法制得的具有提高ADCC的抗体。优选实施方案中，抗体是抗CD20抗体。自体免疫疾病或失调，包括但不限制于，免疫介导的血小板减少症，如急性特发性血小板减少紫癜和慢性特发性血小板减少紫癜，皮肌炎，舞蹈病，狼疮肾炎，风湿热，多腺综合症，Henoch-Schonlein紫癜,末期链球菌肾炎，结节性红斑，Takayasu's动脉炎,艾迪生氏病,多形红斑,结节性多动脉炎，僵硬脊柱炎，古德帕斯丘综合征，血栓性脉管炎ubi teran，原发性胆汁肝硬化，Hashimoto^ s甲状腺炎，甲状腺毒症，慢性活动性肝炎，多肌炎/皮肌炎，多发性软骨炎，pamphigus vulgaris，韦格内氏肉芽肿病，膜肾病，肌萎缩性侧索硬化，脊髓痨，多肌痛，恶性贫血，快速进行性肾小球性肾炎和纤维组织形成肺泡炎，炎性反应如皮炎，包括牛皮癣和皮肤炎(例如，特异性皮炎)；全身硬皮病和硬化病；与肠炎相关的反应(例如，节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合症(包括成人呼吸窘迫综合症；ARDS);皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；变应性病症，例如湿疹和哮喘以及其它病症，包括T细胞浸润和慢性炎症反应；动脉粥样硬化；白细胞粘着不足；类风湿性关节炎；全身红斑狼疮(SLE);糖尿病(例如，I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化病；Reynaud’ s综合症，自身免疫甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；SjorgenJ s综合症；少年开始的糖尿病；和通常在肺结核、结节病、多肌炎、肉芽肿病和结节性脉管炎中发现的由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和延迟性过敏症相关的免疫应答；恶性闭经(艾迪生氏病)；涉及白细胞渗出的疾病，中枢神经系统(CNS)炎症；多器官损伤综合症；溶血性贫血(包括但不限制于冷球蛋白血症或库姆斯氏阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合体介导的疾病；抗血管小球肌膜病；抗磷脂综合症；变应性神经炎；格雷夫斯氏病；Lambert-Eaton肌无力综合症；类天疱疮大疱；天大疱；自身免疫多内分泌腺病；Reiter’s疾病；强直人综合症；BehCet疾病；巨大细胞动脉炎；免疫复合体肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫血小板减少紫癜(ITP)或自身免疫血小板减少症等。本发明这方面中，本发明的抗体消耗血液中的正常B细胞以延长的时间段。
[0217]根据本发明的实施，患者可以是人、马、猪、牛、鼠、犬、猫和鸟患者。其它温血动物也包括于本发明中。[0218]本发明还提供了治疗癌症患者的方法。患者可以是人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔子、马、山羊、绵羊、牛、鸡。癌症可以鉴定为乳腺、膀胱、成视网膜细胞瘤、卵巢乳头状囊腺癌、Wilm's肿瘤或小细胞肺癌,通常表征为具有细胞表面上抗原相关肿瘤的细胞群。该方法包括将癌症杀灭量的和细胞毒性剂结合的肿瘤靶向抗体给药于患者。通常，在允许结合的抗体结合细胞表面上的目标的条件下形成肿瘤靶向抗体和细胞毒性剂的结合。通过结合目标，肿瘤祀向抗体直接或间接导致或引起结合细胞的杀灭,因此来治疗患者。
[0219]还提供了抑制哺乳动物肿瘤细胞增生的方法，其包括将哺乳动物肿瘤细胞和足够浓度的本发明糖基工程化抗体或含有其的免疫缀合物接触，使得抑制哺乳动物肿瘤细胞的增生。
[0220]本发明进一步提供了抑制人肿瘤细胞生长、治疗患者肿瘤和治疗患者增生型疾病的方法。这些方法包括将有效量的本发明组合物给药于患者。
[0221]因此很清楚本发明包括了治疗人癌症的药物组合物、混合物和方法。例如，本发明包括用于治疗人癌症的药物组合物，组合物包括药物有效量的本发明抗体和药物学上可接受的载体。[0222]组合物可以含有抗体或抗体片段，未修饰的、和治疗剂(例如，药物、毒素、酶或第二抗体)缀合的或以重组形式(例如，嵌合抗体、嵌合抗体的片段、双特异性抗体)。组合物可以另外包括治疗癌症的其它抗体或缀合物(例如，抗体混合物)。
[0223]可以使用常规给药方式来给药本发明的抗体、抗体缀合物和免疫毒素组合物，包括但不限制于静脉内、腹膜内、口服、淋巴内或直接给药进肿瘤内。优选静脉内给药。
[0224]本发明组合物可以是多种剂型，包括但不限制于，液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、聚合微胶囊或微泡、脂质体和可注射或能注入的溶液。优选形式取决于给药方式和治疗应用。
[0225]本发明的组合物还优选包括本领域已知的常规药物学可接受载体和佐剂如人血清白蛋白、离子交换剂、氧化铝、卵磷脂、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾和盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐。
[0226]本发明组合物的最有效给药方式和给药方案取决于疾病的严重程度和进程、患者的健康和对治疗的响应以及治疗医师的判断。因此，滴定单个患者的组合物剂量。尽管如此，本发明组合物的有效量为约I至约2000mg/kg。
[0227]在此描述的分子可以是多种剂型，包括但不限制于，液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、聚合微胶囊或微泡、脂质体和可注射或能注入的溶液。优选形式取决于给药方式和治疗应用。
[0228]本发明分子的最有效给药方式和给药方案取决于待治疗肿瘤的位置、癌症的严重程度和进程、患者的健康和对治疗的响应以及治疗医师的判断。因此，应当滴定单个患者的组合物剂量。
[0229]基于表面积mg/kg的各种大小和物种的动物以及人的剂量相互关系描述于Freireich, E.J.等 Cancer Chemother.，Rep.50 (4): 219-244 (1966)。可以进行给药方案的调整来最佳化肿瘤细胞生长抑制和杀灭响应，例如，可以以日基础将剂量分开和给药或根据情况部分减少剂量(例如，每日给药数个分开的剂量或根据特定治疗情况部分减少)。
[0230]应当清楚的是获得治疗需要的本发明组合物剂量可以随着日程表最佳化而进一步减少。[0231]根据本发明的实施，药物载体可以是脂质载体。脂质载体可以是磷脂。此外，脂质载体可以是脂肪酸。还有，脂质载体可以是去污剂。如在此所用的，去污剂是改变液体表面张力通常是降低液体表面张力的任何物质。
[0232]本发明一实施例中，去污剂是非离子去污剂。非离子去污剂的实例，包括但不限制于，聚山梨酸酯80 (也称为吐温80或(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)，Brij和Triton (例如 Triton WR-1339 和 Triton A-20)。
[0233]或者，去污剂可以是离子去污剂。离子去污剂的实例，包括但不限制于，烷基三甲
基溴化铵。
[0234]此外，根据本发明，脂质载体可以是脂质体。如该申请中所用的，“脂质体”是结合载体的任何膜，其含有本发明的任何分子或其组合物。
[0235]以下实施例将更详细解释本发明。以下所给的制备和实施例能够使本领域那些技术人员更清楚地理解和实施本发明。然而，本发明不限制于示范实施方案的范围，其仅仅是本发明单个方面的说明，以及功能等价的方法也在本发明范围之内。实际上，除了在此描述的，根据之前的描述和附图，那些对于本发明的各种改变对本领域那些技术人员变得显而易见。这样的改变确定落入所附权利要求的范围中。
实施例
[0236]实施例1
[0237]材料和方法
[0238]1.抗体表达载体的构建
[0239]杭CD20杭体表汰载体DETR1502
[0240]C2B8抗CD20抗体表达载体pETR1502由四个独立的、分开的表达盒组成(一个用于C2B8抗体轻链，一个用于C2B8抗体重链，一个用于新霉素抗性基因和一个用于鼠dhfr基因)。所有基因在骨髓增生肉瘤病毒(MPSV)启动子的控制下并含有源自兔子β球蛋白基因的聚腺苷酸化信号的合成共有聚腺苷酸化信号。
[0241]在一步法中使用PCR从一系列重叠的单链寡核苷酸组装编码抗⑶20抗体C2B8的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的 CDNA (Kobayashi ,N.等，Biotechniques23:500-503(1997))。从公开的国际专利申请中获得编码C2B8VL和VH片段的原始序列(国际
【发明者】P·乌马纳, P.布林克, C·费拉拉, T·苏特尔 申请人:罗氏格黎卡特股份公司