基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，特别涉及一种基于 结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法。
[0002] 发明背景 蛋白质作为生命有机体的基本组成部分和细胞功能的重要执行者，几乎参与了所有的 生理和病理过程，而这些过程又往往涉及到蛋白质和小分子配体之间的相互作用。因此蛋 白质-小分子配体相互作用的相关研宄，特别是以此为基础的小分子配体靶蛋白的分析检 测具有十分重要的意义。它不仅有助于揭示蛋白质和小分子配体参与的复杂细胞通路机 制，而且可以为临床诊断、新药开发设计等提供必要的数据信息支持。传统的小分子配体靶 蛋白的检测技术主要包括毛细管电泳、蛋白质片断互补测定、表面等离子共振和荧光各向 异性分析等。这些方法虽各有优势，但同时也存在操作繁琐、仪器设备昂贵、灵敏度不足等 缺陷。
[0003] 近年来，通过共价键合的方式将小分子与寡核苷酸DNA链相耦连发展出了一类新 型的小分子配体功能化的核酸探针，其既具备小分子配体高亲和力和高特异性的靶蛋白结 合能力，又具有DNA分子良好的设计灵活型。利用这类新型核酸探针，若干种简便快捷且灵 敏度高的小分子配体靶蛋白检测新方法得以建立，进一步促进了相关领域的发展。但与此 同时，这些新方法往往依赖于核酸工具酶参与的末端保护机制，而工具酶的活性在血清等 复杂样本中易受酸度、离子浓度和其他分子的影响或污染，这将严重阻碍相应方法在复杂 样本中的实际应用。在此背景下，发明一种无需工具酶参与的简单、灵敏的小分子配体靶蛋 白检测新方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是，针对现有方法的不足，提出一种无需工具酶参与的 具有较高选择性和灵敏度的检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法。该方法依赖于寡 核苷酸DNA链末端修饰的特定小分子配体与其靶蛋白的特异性分子识别以及结合抑制的 点击化学反应，并借助由铜纳米颗粒和石墨烯组成的荧光淬灭纳米探针体系，实现对于目 标蛋白的荧光定量检测。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下机理：设计两条碱基完全互补的DNA单链Pl和 P2,其中Pl的5'末端含有叠氮（azide)基团，P2的3'末端修饰有特定小分子配体；在室 温条件下，Pl和P2在溶液中杂交形成双链，成为具有荧光发射特性的铜纳米颗粒合成的 模板。另外设计一条3'末端进行炔基（alkyne)功能化的DNA单链P3,其可以在亚铜离子 (Cu+)存在的条件下通过末端炔基与叠氮基团间的偶极环加成"点击化学"反应实现与Pl链 的连接，形成具有单链分支的P1-P2-P3复合DNA结构；此时，若向检测体系中引入氧化石墨 烯，上述DNA复合结构由于单链分支与氧化石墨烯之间的相互作用而被稳定吸附到氧化石 墨烯表面，最终导致以P1-P2双链为模板合成的铜纳米颗粒的荧光被显著淬灭。另一方面， 当检测体系中存在小分子配体靶蛋白时，靶蛋白可以通过与小分子配体间的高亲和力和特 异性的分子识别过程而连接到P2链末端，形成蛋白结合的P1-P2双链。这种情况下，由于 蛋白结合所形成的巨大位阻效应，Pl和P3链末端的叠氮和炔基基团无法彼此靠近，从而抑 制了点击化学反应的发生；此时，若向检测体系中引入氧化石墨烯，只有游离的P3单链被 吸附至氧化石墨烯表面，而P1-P2双链远离氧化石墨烯，从而使以其为模板形成的铜纳米 颗粒的荧光得以较好地保持。基于以上过程，我们就可以通过分析最终反应体系中铜纳米 颗粒的荧光强度，实现对小分子配体靶蛋白的定量检测。
[0006] 根据上述机理，本发明采用的技术方案： 一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，其特征 在于该方法的具体步骤为： (a) 设计并合成三条末端分别修饰叠氮基团（Azide)、小分子配体和炔基基团 (Alkyne)的寡核苷酸DNA单链；其中，修饰有叠氮基团的寡核苷酸DNA单链Pl的序列为： 5' -Azide-GAAGTCATGAGCGTATGAGTA-3'，修饰有小分子配体的寡核苷酸DNA单链P2的序列 为：5' -TACTCATACGCTCATGACTTC-小分子配体-3'，修饰有炔基基团的寡核苷酸DNA单链P3 的序列为：5'-CGATCCAGGTCATGC-Alkyne-3' ； (b) 单链Pl和单链P2互补杂交形成DNA双链，且杂交形成双链后叠氮基团和小分子配 体位于双链的同一侧末端；具体步骤为：将单链Pl和单链P2按1:1的摩尔比混合于MOPS 缓冲溶液中，搅拌均匀后在20~30 °C条件反应2~3小时，以使Pl和P2链互补杂交形成双 链； (c) 将含有待测的小分子配体靶蛋白的样品溶液加入步骤（b)所得的P1-P2双链溶液 中，通过靶蛋白与小分子配体间的特异性分子识别，形成靶蛋白结合的P1-P2双链；识别结 合反应时间为1~2小时，反应温度为30~40 °C ; (d) 向步骤（c)所得反应体系中加入单链P3, P3链和P1-P2双链的摩尔比为1:1)，再 加入还原剂抗坏血酸，混合均匀后加入含有二价铜离子的MOPS缓冲溶液，以进行点击化学 反应并合成铜纳米颗粒；反应所用时间为20~40分钟，温度为20~30 °C ;所述的P3链和抗 坏血酸的摩尔比为1 : 2000~3000，P3链和二价铜离子的摩尔比为1 : 200~300; (e) 向步骤（d)所得反应体系中加入氧化石墨稀，使反应体系中氧化石墨稀和P3链的 终浓度比为25~50 ug/mL :1 uM ;混匀后在20~30 °C条件下反应20~40分钟以进行荧光淬 灭；反应结束后，使用荧光光谱仪记录反应体系最终的荧光图谱，并根据荧光发射强度实现 对小分子配体靶蛋白的定性定量检测。
[0007] 步骤（a)中所使用的Pl和P2链的碱基序列并非已知序列，而是根据本发明的技 术原理随机设计而成。其基本原则是两者碱基完全互补，且在实验过程中能够保持稳定的 双链结构，以作为铜纳米颗粒合成的模板。同时考虑到长链DNA不易合成且成本较高，因此 Pl和P2链的最优序列长度为15~35 bp。一旦Pl和P2链的序列被设计出来，其合成将交 由专业的核酸合成公司完成。
[0008] 步骤（c)中所使用的P3链的序列同样是随机设计而成，其基本设计原则是：首先， 为了在维持低合成成本的同时保证P3链与氧化石墨烯之间有效的相互作用，序列长度应 为12~20 bp ;其次，为了避免P3链成为铜纳米颗粒合成的模板，序列中不应存在多个连续 的胸腺嘧啶碱基。
[0009] 在步骤（c)中，二价铜离子在溶液中被抗坏血酸还原成Cu+，后者一方面发生歧化 反应生成零价铜原子，进而在P1-P2双链的大沟位置发生富集并最终生成铜纳米颗粒；另 一方面可以催化Pl和P3链末端的叠氮和炔基基团间的偶极环加成"点击化学"反应，形成 具有单链分支的P1-P2-P3复合DNA结构。
[0010] 步骤（e)中所使用的荧光光谱仪为日立F-7000 Fluorescence Spectrophotometer，激发波长为340 nm，发射波长扫描范围为500~670 nm。
[0011] 本发明建立的检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，利用所发现的结合抑 制点击化学反应，将寡核苷酸DNA链末端修饰的特定小分子配体与靶蛋白之间的分子识别 作用与"铜纳米颗粒-石墨烯"荧光淬灭纳米探针体系相偶联，实现了小分子配体靶蛋白的 定量检测。该方法灵敏度高，特异性强，同时无需蛋白酶参与，操作快速简便，因而在临床诊 断、药物研发等领域具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明建立的检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法的原理示意图。
[0013] 图2为未发生（A)或发生（B)点击化学反应的实验体系在氧化石墨烯淬灭40分钟 前后的荧光光谱。
[0014] 图3为检测8.0 nM叶酸受体及对照实验中所得到的荧光图谱。（a)实验组，体系 中含有8.0 nM叶酸受体；（b)对照组，体系中不含叶酸受体；（c)对照组，体系中含有1 μΜ 血红蛋白。
[0015] 图4为检测不同浓度叶酸受体(从下至上分别为0 nM、0. 2 nM、0. 4 nM、0. 8 ηΜ、1. 6 ηΜ、3. 2 ηΜ、4. 8 nM、6. 4 ηΜ和8. 0 ηΜ)时得到的荧光图谱。
[0016] 图5为最终检测体系中铜纳米颗粒在598 nm处的荧光发射强度F598值与叶酸受 体浓度间的关系，插入图为叶酸受体浓度在〇. 2-6. 4 nM范围内，F598值与叶酸受体浓度之间 的线性关系。
[0017] 图6为检测（a)0 nM、（b)4 n