细胞极性模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞研宄领域，尤其是涉及一种细胞极性模型的构建方法。
【背景技术】
[0002] 传统的在观察研宄因子诱导下细胞运动方向发生改变主要依靠专门的设备，如 μ -SIideChemotaxis2D/3D。该设备的基本原理是搭配微量分注器用于两侧储液槽中制造 出化学物质的线性浓度梯度，此时培养于储液槽中间的观察管道中的细胞即处于稳定的线 性浓度梯度培养环境中，适于分析2D/3D基质表面缓慢迀移的细胞的趋化性反应，例如癌 细胞、内皮细胞或成纤维细胞等；其他缓慢迀移的细胞趋化性试验以及利用显微视频进行 细胞示踪的试验等。
[0003] 虽然y-SlideChemotaxis2D/3D等设备能够证明趋化因子浓度梯度可以改变研 宄对象运动方向，但依然存在以下几个问题：第一，此设备并不能很好的限定待研宄因子的 具体方向；第二，不能够确切的观察细胞内部各研宄指标极性方向的改变；第三，显微镜视 频进行示踪是必不可少的，而这对显微镜是一种过分的耗损；第四，设备价格昂贵。
【发明内容】
[0004] 基于此，有必要提供一种能够方便、直观的观察化学因子作用下细胞内待研宄的 目标物质的极性方向变化的细胞极性模型的构建方法。
[0005] 一种细胞极性模型的构建方法，包括如下步骤：
[0006] 步骤一：使用激光共聚焦培养皿作为细胞极性模型的研宄装置，围绕所述激光共 聚焦培养皿中间的培养槽将所述激光共聚焦培养皿分成至少两个极性控制区；
[0007] 步骤二：围绕所述培养槽在所述极性控制区加入培养基，至少有两个极性控制区 内的培养基存在待研宄的化学因子浓度差，其中，所述培养基为固体或半固体培养基；
[0008] 步骤三：向所述培养槽内加入细胞悬浮液，进行细胞培养，加入的细胞悬浮液的高 度大于所述培养槽的深度且小于所述培养槽的深度与所述培养基的厚度之和；
[0009] 步骤四：细胞培养结束后，针对细胞中待研宄的目标物质对培养槽内的细胞使用 免疫荧光法染色，并采用激光共聚焦显微镜进行拍照观察，以研宄所述目标物质对所述化 学因子的极性。
[0010] 在其中一个实施例中，所述步骤一中，在对所述激光共聚焦培养皿划分极性控制 区时，是围绕所述培养槽将所述激光共聚焦培养皿平均分成至少两个极性控制区。
[0011] 在其中一个实施例中，所述步骤二中，在围绕所述培养槽在所述极性控制区加入 培养基时，首先在相应的极性控制区加入不含有所述化学因子的空白培养基，待空白培养 基固化或半固化后，再在其他极性控制区依次加入含有所述化学因子的培养基，进行固化 或半固化处理，并使至少有两个极性控制区内的培养基中所述化学因子存在浓度差。
[0012] 在其中一个实施例中，所述步骤四中，所述针对细胞中待研宄的目标物质对培养 槽内的细胞使用免疫荧光法染色包括：
[0013] 对所述细胞依次进行固定处理、透膜处理及封闭处理；
[0014] 加入与所述目标物质对应的抗体溶液进行孵育处理；
[0015] 加入与所述抗体对应的荧光染料标记的二抗进行标记处理；
[0016] 对标记处理后的样品使用染色液染色处理。
[0017] 在其中一个实施例中，所述步骤四中，所述采用激光共聚焦显微镜进行拍照观察 包括在所述培养槽中选取圆形的观察范围的步骤，选取的所述观察范围需排除因细胞与所 述化学因子的距离而引起的实验误差。
[0018] 在其中一个实施例中，所述极性控制区有四个，其中三个所述极性控制区加入空 白培养基，其中一所述极性控制区加入含有所述化学因子的培养基，所述圆形的观察范围 的边界与含有所述化学因子的培养基的内侧边缘相切，且与该培养基两侧的极性控制区在 所述培养槽内的延伸边界相切。
[0019] 在其中一个实施例中，所述步骤四中，所述研宄细胞中的目标物质对所述化学因 子的极性包括统计所述目标物质发生极化的细胞数目占所述观察视野内总的细胞数目的 百分比。
[0020] 在其中一个实施例中，在统计所述百分比时，是以相应细胞的细胞核中心点为圆 心，细胞最长轴作为直径画圆，得到的圆形区域即代表该细胞，然后根据圆形区域代表的细 胞中所述目标物质的朝向性判断是否为所述目标物质发生极化的细胞。
[0021] 在其中一个实施例中，所述根据圆形区域代表的细胞中所述目标物质的朝向性判 断是否为所述目标物质发生极化的细胞是：若朝向含有所述化学因子的极性控制区的所述 目标物质的表达量大于其它方向上的表达量，并且在该圆形区域内，所述目标物质的表达 量至少有二分之一位于朝向含有该化学因子的极性控制区的圆心角为120°的扇形区域 中，则判断为目标物质发生极化的细胞。
[0022] 在其中一个实施例中，所述构建方法还包括设置对照组的步骤，所述对照组的各 个极性控制区的培养基中不含有所述化学因子，或者所述对照组的多个极性控制区中至少 存在一个与实验组同样位置的极性控制区中的培养基具有不同浓度的所述化学因子。
[0023] 上述细胞极性模型的构建方法具有以下优点：
[0024] 1.使用激光共聚焦培养皿作为细胞趋化性的研宄装置，通过将培养槽周围的区域 分成多个极性控制区，并在极性控制区加入培养基，使至少有两个极性控制区内的培养基 存在待研宄的化学因子浓度差，从而在细胞培养后，可以准确的给出该化学因子的方向，从 而能够更清楚的了解该化学因子对目标物质极性方向的影响。
[0025] 2.方便操作，实验者可根据实验要求制成2D或者3D形式进行实时观察。
[0026] 3.在趋化性研宄过程中，显微镜示踪并非必须的，因此可以节约资源。
[0027] 4.采用激光共聚焦培养皿，培养槽的底部为盖玻片，可用于要求放大倍数高、培养 皿底面透光性能好的显微实验，如激光共聚焦显微实验、荧光显微实验和相差显微实验等， 同时盖玻片上述设有的小孔也能减少实验过程中抗体等试剂的使用量，节约资源，降低实 验成本。
【附图说明】
[0028] 图1为一实施方式作用的激光共聚焦培养皿的结构示意图；
[0029] 图2为在一实施方式中对皿体划分极性控制区的示意图；
[0030] 图3为处理Oh后采用激光共聚焦显微镜拍摄的照片；
[0031] 图4为处理6h后采用激光共聚焦显微镜拍摄的照片；
[0032] 图5为处理12h后采用激光共聚焦显微镜拍摄的照片；
[0033] 图6为处理18h后采用激光共聚焦显微镜拍摄的照片；
[0034] 图7为处理24h后采用激光共聚焦显微镜拍摄的照片；
[0035] 图8为细胞的空间范围设定示意图；
[0036] 图9为目标细胞占整个视野细胞的百分比与基质胶浓度的关系示意图；
[0037] 图10为目标细胞占整个视野细胞的百分比与VEGF刺激时间的关系示意图。
【具体实施方式】
[0038] 以下主要结合具体实施例及附图对本发明的细胞极性模型的构建方法作进一步 详细的说明。
[0039] -实施方式的细胞极性模型的构建方法，使用激光共聚焦培养皿作为细胞极性模 型的研宄装置。如图1所示，本实施方式所用的激光共聚焦培养皿100包括皿体110和与 皿体110相配合的皿盖120。皿体110中设有培养槽102,培养槽102的槽底为盖玻片130。 培养槽102中用于培养细胞。盖玻片130优选厚度为0. 19~0. 22mm的进口盖玻片，可用于 要求放大倍数高、透光性能好的显微实验。在本实施方式的细胞极性模型的构建方法中，首 先将皿体110内围绕培养槽102的部分分成至少两个极性控制区，用于加入细胞极性研宄 的培养基。如图2所示，在一实施方式中如可以将皿体110分成4个极性控制区112、114、 116和118。可理解，在其他实施方式中，极性控制区的数量也可以为2个、3个、5个或更多。
[0040] 在本实施方式中，在对皿体110划分极性控制区时，是围绕培养槽102将皿体110 平均分成至少两个极性控制区，以排除因极性控制区大小不一导致的细胞极化发生误差的 现象。
[0041] 在对皿体110划分极性控制区之后，该细胞极性模型的构建方法还包括如下步 骤：
[0042] 步骤一：围绕培养槽在极性控制区加入培养基，并使至少有两个极性控制区内的 培养基存