专利名称：在活体细胞中筛选配体与受体结合的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及在活体细胞中高通量筛选配体-受体结合的方法和系统。
背景技术：
高通量筛选(High-throughput screening，HTS)研究得益于近年来许多其他技术的进步。巨型化合物库的合成技术和筛选过程中自动机器人的参与使许多药物开发公司能够常规地每天筛选大量的化合物。
体外和活体检测中的高通量筛选是评估化合物的重要过程。以细胞为基础的分析方法，尤其那些利用光学端点的活性筛选方法能研究这些化合物的广泛的功能特征，如特异性的细胞内生物化学通路、蛋白质间相互作用和靶点的亚细胞定位。组合化学和高通量筛选与实时药理学的整合是药物发现和开发的重要部分。
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)是细胞表面受体中极为重要的一类。所有市场上处方药中超过60％的药物都是通过与已知的G蛋白偶联受体相互作用而发挥作用的，这说明了此类受体在药学上的重要性。成百上千的受体通过异三聚体G蛋白传递信息，目前已经分离了其中至少17种不同的形式。大多数G蛋白偶联受体由线状7次跨膜单蛋白链组成。这些受体常被称为7次跨膜受体(seven-transmembrane receptors，STRs)。目前已经发现一百多种不同的GPCRs，包括许多结合同一配体的不同受体，可能还有更多的GPCRs还未被发现。开发新的药物发现分析方法以鉴定新的GPCRs调控子将会极为有益。
细胞膜受体蛋白作为治疗性用途靶点是极有价值的。细胞膜受体的例子包括G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体(receptors of tyrosine kinases，RTKs)。细胞膜受体可能参与了免疫系统调节、自主神经系统信息传递、炎症反应、细胞分化和增殖以及生理感觉如嗅觉和视觉。
在许多生物活动过程中，配体-受体结合(ligand-receptor binding，LRB)触发了一系列细胞信号转导事件的发生。除这些事件外，GPCR蛋白通路的共同特征是一个含有与配体结合的受体的内吞囊泡的内在化。在许多酪氨酸激酶通路中也能观察到细胞内吞作用。基于GPCRs和RTKs作为药物靶点的重要性，已经发展了一些研究配体受体结合的细胞内吞的方法，包括测量细胞膜电容的膜片钳技术(cell membrane capacitance，Cm)、免疫化学方法和绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)标记方法。
在GPCRs通路中几乎不存在膜电容测定所需的离子流。免疫化学方法在检测中常需要大量的细胞，且需耗几十分钟。虽然绿色荧光蛋白标记GPCR蛋白被应用，但存在许多缺点1)不能应用于野生型GPCRs；2)GPCR-GFP信号很微弱不能用于检测单个囊泡内吞；3)绿色荧光蛋白标记可能改变GCPRs自身的某些特性；GFP标记的RTKs的也拥有关于敏感性和基因工程方面相似的问题。由于GPCRs和RTKs在治疗应用上的重要性，亟待发展能用于高通量筛选系统中的高敏感性的检测方法。
发明内容
一方面，本发明是关于建立了用于检测配体与细胞膜受体结合并产生内吞的具体方法，即在单个细胞上检测配体与一种或多种细胞膜受体结合的一种方法，包括用荧光染料及配体的孵育细胞的步骤；检测内吞囊泡的荧光染料等。
另一方面，本发明涉及配体与细胞膜蛋白结合的筛选系统。一个与本发明相对应的系统包括自动液体控制装置、x-y方向定位平台、单细胞内吞囊泡成像显微镜及其配套装置，以及能够控制x-y方向单位步径的操作系统。
本发明的其它方面和优点将会在以下的说明书和权利要求书中进一步说明。
图1显示一种配体与GPCR结合后通过GRK引起磷酸化、并与β-抑制蛋白(β-arrestin)结合触发内吞等。
图2A-2B显示细胞FM孵育过程及随后的FM成像结果。
图3A-3B显示在单个DRG神经元上通过FEI方法记录到的ADP引起的内吞现象和柱状图统计结果。
图4A-4B显示在单个DRG神经元上通过FEI方法记录到的5-HT引起的内吞现象和柱状图统计结果。
图5A-5B显示在单个DRG神经元上通过FEI方法记录到的NGF引起的内吞现象和柱状图统计结果。
图6A-6B显示本发明的一种用于在同一DRG神经元上观察不同类型的配体与其相应的多种受体结合的方法。
图7A-7D显示本发明的一种用于实时检测配体-受体结合及其产生内吞的方法。
图8A-8E显示本发明的一种在同一细胞上应用不同颜色的荧光染料检测不同配体-受体结合的方法。
图9A-9C显示本发明的一种在多孔板上筛选配体-受体结合及其产生内吞的方法。
图10显示一套应用本发明方法进行高通量筛选的自动系统的示意图。
具体实施例方式本发明提供了筛选配体与细胞膜受体结合的具体方法和系统。本发明的方法是建立在检测或监测配体-受体结合后产生的内吞小泡。这些方法不针对某种特定的受体，而是普遍适用于细胞膜上众多的受体同与其相应的配体结合后产生的内在化(内吞)。这样的受体包括如G蛋白偶联偶联受体(GPCR)和酪氨酸激酶受体(RTK)家族。因此，本发明有很多应用价值，包括用于筛选与不同细胞膜受体结合的治疗性药物。
本发明适合于任何能够产生内在化(内吞)的受体，为明晰起见，下面以GPCR和RTK家族为例详细说明。然而，这些例证并不用于限定本发明的适用范围。
七次跨膜的GPCR是最大的一种细胞膜受体家族。这种受体将细胞外生物信号通过配体-GPCR结合后转化为一系列的细胞内生物信号，参见Conner等，“Regulated Portals of Entry into the Cell，”Nature，42237-44(2003)。激动剂与GPCR结合导致包括GPCR反应失敏、GPCRs内在化以及GPCRs的同与G蛋白无关的信号转导通路的结合。GPCR失敏是第二信使依赖的蛋白激酶(secondmessenger-dependent protein kinase)或G蛋白偶联受体激酶(GRKs)引起的G蛋白磷酸化反应导致与G蛋白解偶联的结果。GRK介导的受体磷酸化加速与β-抑制蛋白的结合，β-抑制蛋白与许多种GPCRs结合后能够引起网络蛋白包埋的受体囊泡内在化(比如，内吞)，参见Ferguson，S.S.，“Evolving Concepts in GProtein-Coupled Receptor Endocytosisthe Role in Receptor Desensitizationand Signaling，”Pharmacology Review，531-24(2001).在所有的GPCR中，配体-受体结合引起的内在化(内吞)都涉及一个高度保守的区域。因此，配体-受体结合引起的内吞是大多数GPCRs的共性。
GPCRs参与了许多刺激-反应通路，从通过细胞内信息传递到生理感应，如视觉和味觉。GPCR功能的多样性是与其识别极其众多种类的配体相匹配的，这些配体中包括蛋白质，小分子甚至光子。GPCR在正常生理过程和病理状况中的普遍参与使得GPCR成为40-50％的现代药物的作用靶点。
RTK是由配体-受体结合产生内吞的另一大的受体家族。这种受体参与细胞内信号转导并调控细胞的关键性功能活动，比如细胞增殖、分化、抗凋亡和神经突生长等。这些酶的活性失控，例如通过点突变或过渡表达等机制，将导致各种癌变或者良性增生。确实，70％以上的已知癌基因和原癌基因都是为RTKs编码的。
配体-受体结合引起的内吞已经被广泛研究。该过程是通过细胞膜内陷形成囊泡从细胞膜脱离，使得囊泡再进入细胞内的过程。图1详细显示了这一经典的GPCR的内吞过程。除产生第二信使外，受体-配体结合还引起GPCR的细胞内GPCR的C末端磷酸化(由G蛋白受体激酶介导)，随后β-抑制蛋白与磷酸化的GPCR结合触发受体通过囊泡内吞而内在化。类似的过程(受体内在化)也发生在RTKs上。
多种技术已经被开发并应用于研究配体-受体结合引起的内吞过程。有少部分GPCRs能够调控离子通道和/或细胞内钙库，GPCR与其受体结合会产生离子电流或细胞内瞬间的钙离子浓度的升高。然而绝大多数GPCRs不能产生任何瞬时离子电流，因此促成了其它技术的发展。
最近开发的两种技术涉及使用绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)标记GPCR或β-抑制蛋白。荧光共振能量的转移(Fluoresenceresonance energy transfer，FRET)用于检测有GFP标记的GPCR的配体-受体结合。标记有GFP的β-抑制蛋白也可以用于以同样的方式检测配体与GPCR的结合。然而，这两种方法都存在有缺陷(i)FRET不适用于分析野生型的GPCRs；(ii)GPCR-GFP的信号太弱而不能用于检测单个囊泡内吞；(iii)GPCRs链接GFP后可能会使GCPRs失去其原有的部分特性；(iv)带GFP标记的β-抑制蛋白仅适用于由细胞工程改造过的表达适当量的GFP标记的β-抑制蛋白、GRK和受体的细胞。由于多种类型的β-抑制蛋白，GRKs和受体的存在，这种技术不适用于天然受体。研究RTks内吞的技术中也出现了类似的问题。
通常引起胞吐和内吞的两种刺激是去极化和化学配体。虽然对配体-受体结合不能实时检测，但是一些方法能够实时检测胞吐和内吞。共聚焦FM成像已经用于实时分析胞吐以及延期测定在单个细胞上的内吞(时间延迟约3-5分钟)。参见Zhang等，“Calcium-And Dynamin-Independent Endocytosis In Dorsal RootGanglion Neutrons，”Neuron，42225-236(2004)。FM成像的优点是可以显示内吞囊泡的空间分布。另一种实时检测是用膜片钳分析细胞膜电容(membranecapacitance，Cm)的变化。Cm已经被用于研究去极化引起的胞吐和内吞过程。该方法同样可以记录配体引起的胞吐。
本发明的方法基于FM内吞成像(FM endocytosis imaging，FEI)。共聚焦成像能够用于检测配体-受体结合引起的内吞。FEI方法的原理是(i)细胞外苯乙烯基FM染料(如FM2-10)通过内吞囊泡被吞噬；(ii)FM染料分子被吞入囊泡后亮度会增加100倍左右。这样，经过适当的刺激，负载FM的单个囊泡在通用的共聚焦显微镜下就可以被检测到。
图2A显示本发明的一种方法。如图2A所示，单个细胞用含有一种染料(比如一种FM染料)和一种能够与该细胞膜上一种已知的受体结合的配体进行处理。配体与其受体结合触发该受体内在化(内吞)。在内吞过程中，FM染料也会同时被吞噬进入内吞囊泡。然后，将多余的FM染料清洗干净，这样只有装载有FM染料的囊泡才能够检测到荧光。通过这种方法，在单细胞中的单个囊泡就可以应用FM成像而被观察到。需指明的是，在这个例子中使用的是一种FM染料，而其它适合的染料也可以使用，并且不超过本发明的应用范围。再者，既然FM染料(或其它类似的染料)被吞噬入囊泡后已经实质上地增加了荧光强度(增加大约100倍)，也就没有必要将细胞外多余的FM染料完全清洗干净。因此，本发明的一些其它方法可能没有包括这一清洗步骤。
含有染料的细胞囊泡的图像可以通过合适的显微镜被观察到，包括共聚焦显微镜和多光子显微镜。共聚焦显微镜扫描成像(Go et al.，AnalyticalBiochemistry 247210-215(1997))和多光子显微镜成像(Denk et al.，Science24873(1990))是得到高精度显微镜样品的图像分析的成熟方法。这些系统的优点在于它们的焦深很窄，这就能够在有限的轴相范围内进行特征分析。例如，这使得细胞胞浆内的特性和细胞膜表明的特性能够被区分开。多光子扫描成像使用的是短脉冲式激光，因此，用这种系统可以检测到荧光的延续时间(Lakowicz et al.，Anal.Biochem.202316-330(1992))，提供一些额外的不同的检测性能。下面描述的是来自共聚焦显微镜获得的结果。然而，本领域的一般技术人员会懂得这些只是用以描述，而本发明的具体实例可以用其它类似功能的显微镜来实现。
在操作共聚焦显微镜时，改变不同的扫描层可得到相应层的光切面(Optical slides，OSs)。图2B是一例图，显示的是细胞在共聚焦显微镜下扫描厚度1-2μm得到的OS。这些数据可以观测到一层或全细胞扫描图片的FM荧光亮点(单个囊泡)分布，全细胞扫描图片是该细胞各层OSs叠加图。查看单个OS的优点是可以观察到细胞内内吞囊泡的行踪轨迹，这就为研究囊泡细胞内行踪提供了可能。全细胞扫描图可以观察到囊泡的总数，提供了所有分析中的最高敏感度。例如，全细胞扫描图片可以用于监测配体-受体结合事件的时间效应——比如实时监测。
与本发明一些具体内容相一致，全部的过程从细胞的制备、荧光染料的添加、配体的添加、多余的染料的洗脱、FM荧光亮点成像的OS以及数据的分析都可以由自动操作系统控制(将在后面描述)。再者，由于FEI是一种光学技术，应该能够很好的适用于发展一种快速的高通量生物分析。因此，FEI技术应该能够在评估后选药物与所选的受体的结合上具有应用价值。
FEI生物分析举例 图3A显示在单个背根神经节(DRG)神经元上ADP引起的内吞FM成像。DRG取自雄性Wistar大鼠(80-120g，SLACCAS公司，上海)胸段和腰段脊髓，并在4℃的DMEM溶液(GIBCO Laboratories，NY)中用95％ O2和5％ CO2充氧，神经节放于37℃含有1.0mg/ml的胶原酶(IA型，Sigma)和0.3mg/ml胰酶(III型，Sigma)的培养液中消化40分钟，用标准细胞外液洗脱5次，用光滑细滴管吹打神经节至无明显的块状物质。将细胞悬浊液滴加在小的玻片上。处理好的细胞可以使用1-8小时。实验只观察直径＜25μm的神经元。
在图3A，细胞表明用白圈标记。对照组细胞用含有FM染料的细胞外液孵育3分钟，实验组细胞用含有ADP和FM染料的细胞外液孵育3分钟。标准细胞外液(ES)的成份150mM NaCl，5mM KCl，2.5mM CaCl2，1mM MgCl2，10mMHEPES，和10mM葡萄糖，调pH＝7.4。FM染料，比如可能是FM2-10或FM4-64，配置成适宜的浓度(比如10-100μM)。所有的实验都在室温(22-25℃)下进行。然后将细胞外含有FM的溶液洗去(用细胞外液漂洗，洗3次)，这样以去除细胞外非特异性的FM沾染。给液和灌洗都可采用已知的液体控制或给药系统来完成。例如，本实验中使用的武汉INBIO公司生产的MPS-2给药系统。MPS-2给药系统是通过电磁阀控制可以快速切换(＜50ms)的7道给药系统。
细胞内含有染料的囊泡可通过共聚焦显微镜成像观察，比如Zeiss LSM510(Germany)。FM2-10和FM4-64都可被488nm激光激发，FM2-10的发射光是505-600nm，而FM4-64的发射光＞630nm。因此，细胞内同时存在有这两种染料，采用不同的滤光镜就可以将这两种信号分别显示出来。
图3A结果所显示的FM亮点数(代表内吞囊泡的多少)在用ADP刺激的细胞中有非常显著的增加，暗示ADP通过与其GPCR(P2Y)结合产生了内吞效应。图3A显示的是细胞一个1μm OS图像和由20个OS叠加的全细胞图像。从单个OS的FM亮点分别来分析，ADP引起的囊泡在DRG神经元胞浆区域的分布多于周边区域的分布。这种空间分布可以为研究囊泡的行踪轨迹提供可能。
每张OS中的FM亮点可以人工或自动计数，比如利用一些辅助软件，例如Media Cybernetics公司的Image-ProPlus软件(Silver Spring，MD)。囊泡成像的大小在0.04μm2到1μm2之间。所以，通过FM亮点图像的象素大小就可以计算出囊泡的相应大小。工艺上普遍采用影像处理技术，本领域的一般技术人员会知道这些图像是可以进行技术的，比如对图像的平滑以及动态分布(荧光强度分布)等进行调节，使绝大部分(一般＞90％)的荧光亮点都能够被计数，尽可能地减少背景干扰。
这种定量数据在任何已知的分析中都可被应用，比如柱状图形式，如图3B所示，用于分析配体-受体结合和内吞过程。柱状图可以清楚地显示经ADP作用后细胞内FM亮点显著性的增多。柱状图代表的所有FM亮点数比所有OSs多。图3C的柱状图显示细胞内囊泡的分布情况。胞浆区域的内吞囊泡数是周边区域囊泡数将近2倍。
通过上述介绍，由于配体-受体结合引起的内吞是一种普遍现象，本发明方法应该可用于其它配体和/或受体，如图4A和4B所示的是5-HT(5-羟色胺)与其相应的受体结合的检测结果。
图4A左图显示的是对照组(用细胞外液和FM孵育3分钟)FM成像图，DRG神经元胞浆中仅有非常少的FM亮点。与之相反，图4A右图显示的是5-HT(0.1mM)处理(用细胞外液、5-HT和FM孵育3分钟)后DRG神经元胞浆中出现了大量的内吞囊泡。图4B显示的是该现象的柱状图统计结果。
综上所述，本发明的方法也能够用于其它非GPCR家族的细胞膜受体，假如这些受体也通过配体-受体结合引起的内吞起作用。图5举例说明神经生长因子(NGF)与一种酪氨酸激酶(RTK)家族的受体结合的实验结果。NGF是一种多效性神经营养调节蛋白，调节NGF敏感神经元的发育，保护和再生等。在DRG神经元上，NGF可以和RTK结合。如同ADP和5-HT一样，FEI成像结果显示NGF(50ng/ml)可引起细胞胞浆中内吞囊泡明显的增多。图5B是该结果的统计柱状图。
应用FEI，在同一个细胞上能够量化不同GPCRs的相对丰度。如图6A所示，在单个DRG神经元上对应6种不同的GPCR分别添加了6种不同配体并进行了FM亮点计数(FM亮点数代表内吞囊泡数)。这6种配对的GPCR(配体)分别是P2Y受体(ADP)，5HT受体(5-HT)，M型ACh受体(MCh)，GABAB受体(baclofen)，α肾上腺素受体(NE)和δ-鸦片受体(deltorphin)。如图6B所示，激动P2Y受体，5HT受体和δ-鸦片受体产生的FM亮点数比激动α肾上腺素受体，GABAB受体和M型ACh受体多2-3倍，即暗示在DRG神经元细胞膜上前面几种受体数量要比后面几种受体丰富很多。
如上述所示，天然细胞含有多种能够介导内吞的受体。这些细胞不适合用于筛选作用于一个特定受体的药物。对于这样的药物筛选，可以通过在细胞上表达特定的靶受体来解决。即在细胞上只表达一种特定的受体，这种受体可以是天然的也可以是转染产生的。本发明的方法同样适合于转染特定受体的细胞。转染靶受体的方法已经是众所皆知了。
例如，在正常不表达某种GPCR的哺乳类细胞上异源性表达重组哺乳动物该受体，就为研究该受体功能或该受体的特异性激动剂和拮抗剂提供了便利参见美国，专利号5,401,629，申请人Harpold等)。该专利揭示了在小鼠细胞表达人类毒蕈碱受体(human muscarinic receptor，HM1)。这些异位表达研究给受体信号机制研究和基因突变研究提供了可能。基因突变研究在确定受体与配体结合的有效部位或受体信号转导有效部位十分有效。另外，除这种对机制的研究外，按照本发明的具体内容，细胞转染也可以用于检测配体(如激动剂)与特定受体结合。
FEI的实时记录 如上所述，本发明的方法能够相对简单地提供内吞囊泡的图像信息。因此，这些方法在用于检测配体-受体结合引起的内吞时可用于实时监测内吞过程。这一技术被命名为荧光强度FEI记录(fluorescence intensity of FEI recording，FIF记录)，如图7A-7D所示。应用于实时监测，上述的FEI方法将作以下调整以获得更理想的FIF记录结果(i)空间分布效应将减弱，即增加OS厚度以提高检测的灵敏度；(ii)共聚焦扫描将Z轴固定(通常Z轴固定在接近于细胞的中间)；(iii)细胞成像记录时，细胞外液中有FM染料(即不再洗去细胞外液中的染料)。在这些条件下，FIF记录能够快速获得许多配体结合后X-Y轴细胞图像以便实时监测配体-受体结合引起的效应。
图7A举例说明实时记录配体-受体结合引起的效应。如图所示，细胞放置于含有荧光染料(如FM2-10)的细胞外液中，OS的检测厚度是2.5μm。右图显示的扫描图像的从1到k(即从t1到tk)，这段显示的是给予配体前的记录，即背景记录。扫描图像从K+1到m(即时间从tk+1到tm)，这段显示细胞给予含有配体(ADP)的细胞外液后的记录。这些图像提供的信息可以推测配体与受体结合后的效应。
图7B显示在单个DRG神经元上从t＝tk(对照)和t＝tm(ADP)的记录。对照图像是即将给予配体(ADP)前的记录，而“ADP”图像是给予ADP一段时间后的记录。该结果证实给予配体结合后引起细胞内荧光亮点数(内吞囊泡)明显地增加。
图7C显示的是一典型的时间变化过程，FM强度的变化是与时间相关的。荧光强度的大小代表内吞囊泡总数的多少。图7D显示21次实验时间变化的平均值。这些结果清楚地显示了给予ADP能够显著性地增加细胞内荧光强度(即内吞囊泡数)。也可以明显地观察到配体-受体结合引起的内吞发生的时间需要数秒。因此，FIF记录的采样率可以用1Hz或稍低一点。这些结果显示本发明的上述方法可以实时监测配体-受体结合引起的内吞。
不同的FEI标记 以上实例显示细胞内吞囊泡空间分布的图像足以适用于观察不同位置的囊泡。例如，用于探测囊泡在细胞内的去向。现已知道GPCR通过激活载体产生囊泡内吞，并且每种不同的GPCR囊泡可以有其自身特异的装载途径。在同一细胞上将囊泡用不同的颜色的FM染料标记可以在不同条件下(如时间、配体不同等)分别观察它们不同的装载通路。
图8A显示的是用两种不同的染料标记的细胞。如左图所示，细胞先用含有ADP和FM2-10(绿色荧光)的细胞外液孵育，然后染料和ADP漂洗后再用含有5-HT和FM4-64(红色荧光)的细胞外液孵育，再将染料和5-HT漂洗，最后在共聚焦显微镜下观察，如右图所示。FM2-10和FM4-64都可被488nm激光激发，FM2-10的发射光在530-600nm内可被检测，而FM4-64的发射光＞635nm可被检测。
参见图8B，ADP和5-HT引起的内吞囊泡能够被红色的FM4-64和绿色的FM2-10分别被标记。这两种内吞囊泡数也很接近(图8D)，可以肯定，在DRG神经元上ADP和5-HT相应的受体数目相近(见图6B)。FM叠加图显示大多数绿色和红色FM亮点在整个胞浆中是分散分布的，暗示ADP引起的内吞囊泡和5-HT引起的内吞囊泡的装载途径是不同的。
为了验证ADP引起的内吞囊泡和5-HT引起的内吞囊泡是否有装载的共性。用80mM KCl处理细胞3分钟，如图8C所示，囊泡数量明显地减少了。图8E统计结果显示大约43％的红色/P2Y内吞囊泡和大约37％的绿色/5-羟色胺受体被排出。这一结果暗示ADP和5-HT引起的内吞囊泡大约有40％有一共同的装载途径，即将它们运送到预释放池(readily releasable vesicle pool，RRP)中，这种RRP内的囊泡可因随后的动作电位排出细胞。
药物的高通量筛选方法 以上的描述已经清楚的阐明了本发明的方法能够提供研究配体-受体结合引起内吞的灵敏度、时间和空间分辩图像。因为在治疗性药物当中，细胞膜受体经常被作为作用靶点，本发明的方法对筛选针对特定受体的药物具有很好的实用性。
高通量筛选(HTS)已经成为药物开发中鉴定药物潜在先导分子能否作用于特定疾病靶点的关键一环。成功的筛选由下列几个因素衡量，其中包括通量和成本，但是最终要看有多少高通量筛选的阳性物能通过药物发现的过程检验。通过使用96孔到384孔再到536孔板可将分析试验微型化，然后利用自动化装置实现提高效率和减少筛选成本。
在单个细胞上能够快速检测内吞囊泡的方法，使FEI技术作为快速药物/配体生物分析成为可能。因为FEI是一种光学分析方法，所以可适用于自动化控制的针对有配体-受体结合引起的内吞现象的受体的治疗性药物的高通量筛选，并且这一方法非常。
多孔程序举例 图9A-8B显示本发明的一种方法，即使用多孔板(2*2孔板)进行高通量筛选配体-受体结合引起的内吞效应。多孔板孔底是0.17mm厚的玻璃，其它与标准细胞培养板相同。本例中，单个DRG细胞被接种在玻璃底壁上。
如图9A所示，四个孔中分别用不同的试剂进行处理。孔(1，1)是用含FM的细胞外液孵育；孔(1，2)是用含FM和80mM KCl细胞外液孵育；孔(2，1)是用含FM和ADP的细胞外液孵育；孔(2，2)是用含FM、苏拉明和ADP的细胞外液孵育。每孔的孵育时间都是3分钟。
每孔按顺序扫描后得到图像在图9B显示，内吞信号(FM亮点/细胞)的分析统计结果用柱状图在图9C显示。在图9B中，四栏图像代表的是四个不同的孔的细胞，也就是四种不同的处理方式。在每一栏的顶端图像是可见光图像，显示细胞在孔中的状况。方框内的细胞是用于图像分析的细胞。
被选中的细胞进行单层OS成像(中间图像)和全细胞成像(底层图像)(图9B)。图9C显示的是孔内配体-受体结合的荧光亮点(内吞囊泡)数的柱状统计结果图。从统计结果可以看出ADP可以明显地引起内吞，此内吞可以被苏拉明(特异性的酪氨酸磷酸酯酶抑制剂)阻抑。
虽然以上只介绍了4孔板的人工操作，但是本领域中的技术人员可以理解这种技术可能在任何多孔板(96孔甚至更多)上应用。再者，结合电子定位系统进行同步定位、细胞移植、配体添加/漂洗、FM成像和/或FM分析等，可以使部分或全部的配体/药物筛选程序实现自动化。将表达有所需受体的(如GPCR或RTK)的细胞系细胞种植于多孔板内，可以检测多种不同化学制剂在各孔内的效应。在一些孔内，配体若能够产生大量的FM亮点(即内吞囊泡)则说明配体对受体是有作用的。
上述自动化系统是本发明提供的实施系统的一些具体体现。这些系统从最近的仪器制造学的发展中吸取优点。参见Taylor等.，美国科学家，80322-335(1992)，提出了许多方法和它们的应用。例如，Proffitt等，(Cytometry24204-213(1996))，描述了半自动化荧光数字式成像系统应用于各种组织培养平板的原位定量法细胞计数，其中包括了96孔微滴定量盘。并且，美国专利6,875,578号，申请人Giuliano等发现了基于荧光系统的个别细胞分析技术。
与本发明具体化相一致，一套系统需要有共聚焦显微镜(或其它合适的显微镜)配置有机动载物台、视频照相机、计算机和相应的软件等组成。计算机和软件控制用于机动载物台、扫描标本和产生图像等。另外，软件能够进行图像分析和计算各种的荧光值。该系统的机动载物台可适用于各种组织培养平板的配置，比如通常用的96孔板。
另外，本发明的系统还可包括液体流动自动控制/输送系统。有许多商品化的系统都适用，例如前面描述过的MPS-2给药系统。
与本发明的具体化相一致，图10显示的是细胞筛选系统100的示意图。如图所示，筛选系统100由荧光成像系统101，包括显微镜、XY方向载物平台104能够夹持培养皿105以及能够将培养皿进行定位移动并调节培养皿的位置以便聚焦)；成像设备103(比如数码相机)；光源102可定向产生视觉效应的可见光和激发荧光的发射光以及将荧光导向成像设备(相机)；计算机系统106从相机103接收和处理数字化数据，包括显示和输入设备，(比如键盘、鼠标等)。计算机系统106可进一步包括数字存储和文件存档以及结果的对照、获取、处理和显示的方法。应该要指出的是其中有些功能(比如数据的存储或分析)可在不同的计算机上完成。另外，细胞扫描系统100可以包括微量给药系统107用于向培养皿添加试剂或从培养皿中移走溶液。
如图10所示的例子中，显微镜系统101是倒置的。任何具有相似功能的显微镜都可以适用，比如蔡司倒置荧光显微镜。光源102，例如，100瓦汞弧灯或75瓦氙气灯。XY方向平台104是用于移动培养皿105，使培养皿在显微镜物镜上方进行XY方向移动。成像装置103相当于高辨率的数码相机。
应该指出的是，高通量“整盘”检读系统已是众所周知的，并通常用于高通量筛选系统进行大批量的筛选。参见Beggs，J.of Biomolec.Screening271-78(1997)和Macaffrey等，J.Biomolec.Screening 1187-190(1996)。然而，细胞筛选系统，与本发明具体化相一致，是对单个孔中单个细胞的进行成像。一种本发明的系统能够提供空间分辨率，而“整盘”检读系统则不可能做到。
一种本发明的系统提供便捷的方法用于高通量筛选配体-受体结合，能够显著性地提高药物筛选效率。如上所述，本发明的方法能够提供高度的空间和时间分辨率来监测受体与配体结合后产生的内在化。这种性能使得检测药物对于复杂的分子活动和细胞功能提供了可能，比如观察信号转导通路，细胞凋亡、细胞分化、细胞黏附、移动、胞吐和细胞间的信号交流等。另外，应用多颜色荧光，在一次筛选中可能对多靶点及多种细胞活动进行分析处理。细胞各种反应间的相互关系有可能成为评估靶点及优化先导物的极其有用的信息。
本发明的具体化包括下面一个或更多的优点。本发明的方法提供一种便捷的光学生物分析方式用于筛选能够与细胞膜上众多的受体结合的配体。这些方法通常可应用于任何能够在与配体结合后产生内吞的受体。这些方法能够应用于针对与配体结合后产生内吞的受体进行的高通量药物筛选。许多这样的受体已经被发现参与某种疾病的发生。本发明的具体化同时也提供了一种可用于药物高通量筛选的自动化筛选系统。
虽然本发明被描述成有限的几个具体方面，本领域的技术人员可从其公开中受益，并且正确评价其他的可能被设计的并不脱离在这里公开的本发明的具体化。因此，本发明的范围应该仅被附属的权利要求书所限制。
权利要求
1.一种检测与细胞膜受体结合的配体的方法，其特征在于，包括以下步骤用染料和配体对细胞进行孵育；和在细胞中检测含有染料的内吞囊泡。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括在孵育后、检测前漂洗细胞，从而去除细胞外染料。
3.如权利要求1和2中任一权利要求所述的方法，其中所述的染料为荧光染料。
4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，所述的细胞膜受体是G蛋白偶联受体或酪氨酸激酶受体家族中的一种。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于使用显微镜进行检测。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的显微镜是共聚焦显微镜。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在一张或多张光学图片中进行检测。
8.如权利要求3至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括获得一个或多个细胞内含染料的内吞囊泡的图像的步骤。
9.如权利要求3至8中任一权利要求所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括对细胞内含染料内吞囊泡进行定量的步骤。
10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其特征在于，该方法进一步检测步骤以时间为可变因素进行。
11.如权利要求1至10中任一权利要求所述的方法，其特征在于，在一个多孔板的单个孔中操作此法。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的各步骤程序由自动装置操作。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法还进一步包括下列步骤漂洗细胞后，用第二种染料和第二种配体孵育细胞；和于检测前，漂洗细胞以去除细胞外的第二种染料和第二种配体。
14.一种筛选与细胞膜结合的配体的系统，其特征在于，包括自动液体操作装置；x-y方向载物台；观察单个细胞内吞囊泡成像的显微镜配置；和控制x-y载物平台和显微镜移动的控制装置。
15.如权利要求14所述的系统，其所述的控制装置还包括用于分析内吞囊泡的软件。
16.如权利要求14和15中任一权利要求所述的系统，其特征在于，所述的显微镜是共聚焦显微镜。
17.如权利要求14至16中任一权利要求所述的系统，其特征在于，所述的培养皿是多孔板。
全文摘要
本发明涉及筛选配体与细胞膜受体结合并产生内吞的方法和系统。检测配体与细胞膜受体结合的方法，包括用染料和配体孵育细胞和检测细胞中含染料的内吞囊泡。筛选与细胞膜受体结合的配体的系统包括自动液体控制装置、x－y控制载物平台、单个细胞的内吞囊泡成像的显微镜装置、自动分析FM亮点(内吞囊泡)软件以及控制x－y载物平台和显微镜移动的控制装置。
文档编号G01N33/50GK101063657SQ20061002624
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月29日 优先权日2006年4月29日
发明者周专, 程和平 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 北京大学