专利名称：链化合物和配体、及其制备方法
技术领域：
本发明涉及可以将寡糖等糖固定在表面细胞质基因组共振中所用的传感芯片等蛋白质分析用支撑体上的链化合物，以及引入了该链化合物的配体、配体载体及其制备方法。
背景技术：
存在于生物体内的各种糖在维持生物的活动和生命的机理中起到重要的作用。为了精确地了解糖的这种机能，必须根据糖的复杂的结构而解析其机能。在糖的机能解析中所采用的方法是，使用已经明确其构造的寡糖，一部分一部分地再现糖的结构，由此揭示糖整体的结构与机能的关系。
作为上述解析糖的机能的方法，已知的有例如表面细胞质基因组共振法(以下记作SPR)。也就是，将含有模拟了糖的一部分的寡糖而形成的配体引入传感芯片表面，使用引入该配体的传感芯片，以确定与寡糖具有特异性相互作用的蛋白质等物质。由此，根据寡糖的结构可以对生物活性作出正确的评价。
另外，由于1分子寡糖的活性不会很高，在评价寡糖的生物活性时，必须将寡糖在传感芯片上集合化。也就是，通过使用集合化的寡糖，解析其与蛋白质等物质之间的相互作用，由此可以评价寡糖的生物活性。
因此，如“日本专利公开公报2003-836969号(2003年3月19号公开)”(文献1)、“日本化学会第79次春季年会-讲演预稿集II、社团法人日本化学会、2001年3月15日，1042页”(文献2)中所公开的那样，本发明者们已经得到了在分子内具有可固定于传感芯片表面的部分和可引入寡糖的部分的链化合物，还得到了在该链化合物中引入1单元(分子)或2单元的寡糖而形成的配体。因而发现通过使用该配体，可以将寡糖集合化后导入至传感芯片上。
然而，上述现有的配体虽然可以将寡糖的糖链2维地排列在传感芯片的表面上，但是其存在的技术问题在于，很难以良好的再现性实现这种排列。
即，如上所述，使多个分子的寡糖在传感芯片表面上集合化，以对寡糖的生物活性进行解析时，期望能够使寡糖糖链的集合化状态均等，以良好的再现性观测寡糖和蛋白质之间的相互作用。特别是为了观测寡糖的生物活性，必须使3单元～4单元的寡糖在传感芯片的表面集合化，并将其再现性良好地2维排列在这些传感芯片上。通过上述的这种排列，可以再现性良好地对寡糖的生物活性进行评价。
另外，上述现有的配体中，1个配体所具有的寡糖为1单元或2单元。换言之，相对于单个的链化合物，上述配体是由1个或2个寡糖结合而成的。因此，为了观测寡糖的生物活性，当把上述配体排列在传感芯片表面上时，必须通过提高配体浓度，使配体互相之间集合化，由此使3单位以上的寡糖在传感器表面上集合化。
当通过这种方法使寡糖集合化时，难以实现将寡糖的糖链之间控制在规定的间隔从而再现性良好地排列寡糖。因此，上述现有的配体不能再现性良好地观测寡糖的生物活性，有时可能难以进行糖的结构的解析和寡糖的生物活性的评价。
本发明是为了克服上述问题而完成的，旨在提供一种能够再现性良好地将糖2维地排列在蛋白质分析用等支撑体上的新型链化合物，以及将该链化合物引入糖分子而得到的新型配体、配体载体及其制备方法。
发明内容
本发明者们为了解决上述问题而进行了积极的研究，结果发现，通过使用具有可以引入3单元或4单元糖分子的部位、且具有可以和蛋白质分析用支撑体相结合的部位的新型链化合物，其中该蛋白质分析用支撑体用于检测和分离与糖分子具有特异性相互作用的蛋白质，由此可以再现性良好地将3单元或4单元糖分子2维排列在上述支撑体上，从而完成了本发明。
即，为了解决上述问题，本发明的链化合物的特征在于，其具有如通式(1) (式中，n为1到6的整数)所示的结构。上述X的结构中，具有由3或4条末端具有芳香族胺基、且主链上可以有碳-氮键的烃衍生链而形成的多分支结构部分。
上述烃衍生链是指，在由碳和氢形成的烃链中，部分的碳和氢可以被其它的原子或取代基取代的烃链。即，上述烃衍生链包括在末端的芳香族胺基，并且构成烃链骨架结构的碳-碳键(C-C键)的一部分可以被碳-氮键(C-N键)、碳-氧键(C-O键)或酰胺键(CO-NH键)所取代。
在上述结构中，上述链化合物具有芳香族胺基，该部分可以方便地引入糖分子。由于各烃衍生链中含有上述芳香族胺基，因此可以将3单元或4单元的糖分子引入上述链化合物中。此外，上述链化合物还具有S-S键，该部分可以固定在上述蛋白质分析用支撑体上。
由此，通过上述链化合物，可以将3单元或4单元的糖分子集合化地引入到上述支撑体中。此外，由于将3单元或4单元的糖分子引入到1个链化合物中，可以再现性良好地将3单元或4单元的糖分子排列在上述支撑体上。由此，可以在上述支撑体表面上观测糖分子和蛋白质之间的相互作用，同时可以再现性良好地评价糖分子的生物活性。
在具有上述通式(1)中所示结构的链化合物中，上述X优选具有通式(2)
(式中m1、m2、m3各自独立地是1到6的整数)所示的结构。
上述链化合物的X由于具有3条上述的烃衍生链，因此通过该链化合物，可以在上述支撑体上引入3单元的糖分子。由此，通过控制上述支撑体表面上3单元的糖分子之间的间隔，可以再现性良好地实现糖分子的排列，因此可以再现性良好地评价糖分子的生物活性。
此外，在具有上述通式(1)中所示结构的链化合物中，上述X优选具有通式(3) (式中m4、m5、m6、m7、p1、p2各自独立地是1到6的整数)所示的结构。
上述链化合物的X由于具有4条上述的烃衍生链，因此通过该链化合物，可以在上述支撑体上引入4单元的糖分子。由此，通过控制上述支撑体表面上4单元的糖分子之间的间隔，可以再现性良好地实现糖分子的排列，因此可以再现性良好地评价糖分子的生物活性。
此外，为了解决上述问题，本发明的配体的特征在于其是通过将糖分子引入到上述任何一个链化合物的芳香族胺基上而形成的。
更具体而言，上述配体优选具有通式(4) (式中m1、m2、m3、n各自独立地是1到6的整数)所示的结构。
或者上述配体优选具有通式(5) (式中m4、m5、m6、m7、n、p1、p2各自独立地是1到6的整数)所示的结构。
通过使用上述的任何一个配体，可以将3单元(当使用具有通式(4)所示结构的配体时)或4单元(当使用具有通式(5)所示结构的配体时)的糖分子集合化地固定在上述蛋白质分析用支撑体表面。如此，由于一个配体具有3单元或4单元的糖分子，在支撑体表面上，上述配体互相之间没有集合化，由于可以通过使用一个配体而使3单元或4单元的糖分子集合化，因此可以再现性良好地测定糖分子的生物活性。此外，在上述支撑体的表面上可以再现性良好地2维排列多个糖分子。因此，通过使用固定了本发明的配体的蛋白质分析用支撑体，可以再现性良好地评价糖分子的生物活性。
此外，为了解决上述问题，本发明的链化合物的制备方法的特征在于包含下述工序将硫辛酸与具有3条或4条支链的胺化合物进行缩合反应的步骤，其中该支链的芳香族胺基末端被保护基团保护，和对上述芳香族胺基末端的保护基团进行脱保护的步骤。
通过上述方法，可以得到本发明的化合物，其具有S-S键和芳香族胺基，S-S键部分可以固定在上述蛋白质分析用支撑体上，芳香族胺基部分可以方便地引入糖分子。
此外，为了解决上述问题，本发明的配体的制备方法的特征在于使用上述链化合物和糖分子，进行还原胺化反应。
通过上述方法，经过还原胺化反应，可以方便地向链化合物中引入糖分子，从而得到本发明的配体。
此外，为了解决上述问题，本发明的糖分子的引入方法的特征在于，将含有上述配体的溶液和支撑体表面的金属接触。
通过上述的方法，上述配体(配体中包含的链化合物)的S-S键变为与上述支撑体表面的金属形成的键，从而可以将上述配体固定在支撑体表面。因此，通过将含有配体的溶液和支撑体接触这种简便的方法，可以将与链化合物结合的糖分子排列在支撑体的表面上。
此外，为了解决上述的问题，本发明的配体载体的特征在于，使上述配体在表面具有金属的支撑体上固定化。
由上述的方法，通过硫-金属键，由于可以将配体牢固地固定在支撑体表面上，可以提供使多个糖分子再现性良好地排列在支撑体表面上而形成的配体载体。因此，若使用上述配体载体，可以再现性良好地观测配体中所含的糖分子和与该糖分子相互作用的蛋白质等物质之间的相互作用，从而可以定量地评价糖分子的生物活性。
通过以下记载的内容可以进一步充分地了解本发明的其它目的、特征和优点。此外，通过下述的说明并参照附图，可以了解到本发明的效益。
图1显示的是将本发明的配体固定化的配体引入芯片和rvWF结合，对该结合进行SPR测定的结果的图。
图2显示的是将现有的配体固定化的配体引入芯片和rvWF结合，对该结合进行SPR测定的结果的图。
具体实施例方式
下面对本发明进行详细的说明，但是本发明并不限定于此。
本发明的链化合物位于SPR的传感芯片和亲和色谱法的载体等蛋白质分析用支撑体与寡糖等糖(以下记作糖分子)之间，用于使糖分子在上述支撑体上固定化。因此，上述链化合物在分子内必须具有可固定于上述支撑体上的部分和可以方便地引入糖分子的部分。
此外，对于上述SPR和亲和色谱法，其目的是鉴别和分离与糖分子具有特异性相互作用的蛋白质等物质。因此，上述链化合物必须是与蛋白质等物质不具有非特异性相互作用的物质。
因此，如前述通式(1)所示，本发明的链化合物具有双硫键(S-S键)，其作为可固定于上述支撑体上的部分。该双硫键的硫(S)例如与涂敷在蛋白质分析用支撑体表面上的金(Au)结合，形成硫-金键(S-Au键)，可以牢固地与上述支撑体结合。
此外，为将多个糖分子2维排列在蛋白质分析用支撑体的表面上，同时控制各个糖分子的糖链之间的距离，上述链化合物具有包含多个胺基的多分支结构，作为可以方便地引入糖分子的部分。即，本发明的链化合物的多分支部分是具有前述通式(1)中X所示结构的部分，如前所述，该X具有包含3条或4条末端具有芳香族胺基、且同时在主链上可以有碳-氮键和酰胺键的烃衍生链的结构。另外，在上述通式(1)中，n只要是1到6的整数，则没有特别的限定。
上述芳香族胺基的胺基(-NH2基)是通过与寡糖等糖分子的还原胺化反应，向上述链化合物中引入糖分子的反应基团。也就是说，由糖分子中的平衡而产生的醛基(-CHO基)或酮基(-CRO基，R为烃基)与上述链化合物所具有的胺基反应。接着，通过继续还原由该反应形成的席夫碱，可以容易地将糖分子引入到芳香族胺基中。
由此，前述通式(1)的X通过含有3条或4条如上述的烃衍生链，其具有了同时包含多个可引入糖分子的芳香族胺基的多分支型部分。由于在该多分支部分中所含的各芳香族胺基中，引入了寡糖等糖分子，通过具有前述通式(1)中所示结构的链化合物，可以再现性良好地将多个糖分子2维排列在蛋白质分析用支撑体的表面上。
具体而言，上述X如前述通式(2)中所示，3条烃衍生链通过在与芳香族胺基相反侧的末端上与1个碳原子(C)结合，形成分支结构。即该碳原子与-NH-结合。由此，上述X形成具有3条烃衍生链的多分支部分，另外，在上述通式(2)中，m1、m2、m3只要是1到6的整数，则没有特别的限定，其可以是彼此不同的整数，也可以是部分或全部相同的整数。其中，从便于制造具有上述多分支部分的化合物的角度出发，上述m1～m3优选是彼此相同的整数，特别优选2。
或者也可以如前述通式(2)所示，上述X的2条烃衍生链各自在与芳香族胺基相反侧的末端上具有和1个氮原子(N)结合的2分支的结构。这时，2条2分支结构中的上述氮原子通过-CO-CH2-，连接到1个氮原子(N)上形成分支结构。由此，上述X形成具有4条烃衍生链的作为多分支型部分的结构。另外，在上述通式(3)中，m4、m5、m6、m7只要是1到6的整数，则没有特别的限定，其可以是彼此不同的整数，也可以是一部分或全部相同的整数。其中，从便于制造具有上述多分支部分的化合物的角度出发，上述m4～m7优选是彼此相同的整数，特别优选2。此外，p1、p2只要是1到6的整数，则没有特别的限定，其可以是彼此不同的整数，也可以是部分或全部相同的整数。其中，从制备的方便性的角度出发，p1、p2优选是彼此相同的整数，特别优选1。
由此，上述X的结构中，具有在碳、氮等原子上形成结合了多条烃衍生链的分支结构的多分支型部分。另外，上述X中所含的多条烃衍生链虽然优选是全部相同的，但如果在末端具有芳香族胺基，则也可以是彼此不同的结构。
如上所示，具有通式(1)所示结构的链化合物具有可与蛋白质分析用支撑体结合的S-S键，和可与寡糖等糖分子结合的胺基。从而，由于通过例如S-Au键使上述链化合物固定在蛋白质分析用支撑体上，由上述链化合物，可以简单且牢固地将糖分子与上述支撑体结合。
此外，上述链化合物具有多分支型部分，在该多分支型部分的各末端上具有芳香族胺基。因此，通过使用在上述链化合物中引入糖分子而形成的配体(见后述)，可以高效率地使糖分子在上述支撑体表面上集合化。此外，由于具有多分支型部分，当含有链化合物而形成的配体与支撑体表面结合时，可以再现性良好地2维排列多个糖分子。
进一步的，上述链化合物几乎可以忽略其与蛋白质的非特异性相互作用的影响。由此，通过使用本发明的链化合物，可以再现性良好地评价糖分子的生物活性。
上述链化合物可以通过如下所示的制备方法进行制备。即，上述化合物可以通过，将硫辛酸与具有3条或4条支链的胺化合物进行缩合反应，其中该支链的芳香族胺基末端被保护基团保护，然后对上述芳香族胺基末端的保护基团进行脱保护而制备。
上述硫辛酸具有如下述通式(6)
所示的结构。
此外，上述胺化合物只要含有其芳香族胺基末端被保护基团保护的支链即可，没有特别的限定，也可以含有相当于上述链化合物的多分支部分的结构。
因此，上述支链除了具有被保护基团保护的芳香族胺基末端以代替上述烃衍生链中所含的芳香族胺基以外，可以具有上述烃衍生链的结构。也就是，上述分支链在由碳和氢形成的烃链中，一部分的碳和氢可以被其它的原子或取代基取代。更具体而言，上述分支链在具有被保护基团保护的芳香族胺基末端的同时，以烃链为主要结构的碳-碳键(C-C键)的一部分可以被碳-氮键(C-N键)或碳-氧键(C-O键)取代。
此外，上述保护基团是指为了使芳香族胺基的胺基不参加上述缩合反应而引入的取代基。这种保护基团只要是在对仲胺基进行脱保护时不受其影响的基团，则没有特别的限定。作为上述保护基团，可以列举例如叔丁氧基羰基(-COO(CH3)3基；记作Boc基)、苄基、氨基甲酸烯丙酯基(-COOCH2CH＝CH2、Alloc基)等。
作为上述胺化合物，可以列举例如，具有如下述通式(7)和下述通式(8)所示结构的化合物。
另外，上述通式(7)、(8)中的n、m1～m7、p1、p2各自独立地是1到6的整数。关于这些胺化合物的合成方法，在后面的实施例中有详细的描述。
通过上述硫辛酸和胺化合物的缩合反应，硫辛酸的羧基(-COO基)和胺化合物的胺基(-NH2)缩合，形成酰胺键。然后对芳香族胺基的保护基团进行脱保护，通过脱去保护基团而形成胺基，可以得到上述的链化合物。
下面，对于在上述链化合物的芳香族胺基上引入糖分子而形成的配体进行说明。在本发明的配体中，链化合物的胺基与通过糖分子中的平衡而产生的醛基或酮基反应，通过继续还原由该反应形成的席夫碱，可以将糖分子引入到芳香族胺基中。即，通过该还原胺化反应，上述链化合物和糖分子结合。
本发明的配体中所含的糖分子只要在其还原末端具有还原糖，则没有特别的限定。可以列举例如，葡萄糖、半乳糖、甘露糖等单糖类，结合的糖数为2糖～10糖的麦芽糖、乳糖，后述的硫酸化寡糖等寡糖类，将单糖类和寡糖类组合起来糖数为11以上的肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素等多糖类。
此外，作为上述寡糖类，还可以列举，在已知具有抗血液凝固活性的硫酸化多糖肝素中，具有下述通式(9) 所示的特定部分的二糖结构(GlcNS6S-IdoA2S)的硫酸化寡糖、具有在该硫酸化寡糖的还原末端的羟基上引入葡萄糖而形成的如下述通式(10) 所示结构的寡糖。
另外，上述寡糖类和多糖类可以是由同样的单糖分子形成的单一寡糖或单一多糖，也可以是由各种单糖分子及其衍生物形成的复合糖族，包含各种单糖分子及其衍生物、寡糖类的复合多糖类。此外，上述的任何一种糖分子都可以是从自然界中分离·精制而得到的各种天然的糖，也可以是人工合成的糖。
具体而言，本发明的配体具有如前述通式(4)所示的结构。具有该通式(4)所示结构的配体是在如前述通式(1)所示、且通式(1)中的X具有如前述通式(2)所示结构的链化合物中，引入具有如上述通式(10)所示结构的糖分子而形成的。通式(2)所示的X由于具有包含3条烃衍生链的结构，因此具有通式(4)所示结构的配体在上述链化合物中结合了3单元的糖分子。此外，在上述通式(4)中，m1～m3与通式(2)中的m1～m3一样，只要是1到6的整数，则没有特别的限定，其可以是彼此不同的整数，也可以是部分或全部相同的整数。另外，n只要是1到6的整数，则没有特别的限定。
此外，本发明的其它的配体具有如前述通式(5)所示的结构。具有该通式(5)所示结构的配体是在如前述通式(1)所示、且通式(1)中的X具有如前述通式(3)所示结构的链化合物中，引入具有如上述通式(10)所示结构的糖分子而形成的。通式(3)所示的X由于具有包含4条烃衍生链的结构，因此具有通式(5)所示结构的配体在上述链化合物中结合了4单元的糖分子。此外，在上述通式(5)中，m4～m7与通式(2)中的m4～m7一样，只要是1到6的整数，则没有特别的限定，其可以是互相不同的整数，也可以是部分或全部相同的整数。另外，在上述通式(5)中，p1、p2与通式(3)中的p1、p2一样，只要是1到6的整数，则没有特别的限定，其可以是彼此不同的整数，也可以是部分或全部相同的整数。另外，n只要是1到6的整数，则没有特别的限定。
由于上述的任一个配体都含有链化合物和糖分子，链化合物中的S-S键可以和蛋白质分析用支撑体表面的金属以硫(S)-金属键，例如硫-金(S-Au)键的形式结合。由此，通过该S-Au键，可以提供使3单元或4单元的糖分子集合化后固定在上述支撑体表面上而形成的配体载体。因而，通过使用上述配体，可以实现能将多个糖分子再现性良好地2维排列在例如蛋白质分析用支撑体表面上的配体载体，通过使用该配体载体，可以再现性良好地对糖分子的生物活性进行评价。另外，作为上述支撑体表面的金属，除了上述Au以外，还可以使用Cu、Ag、Pt等金属，但是优选Au。
还有，本发明还包含通过S-金属键将配体在支撑体表面固定化而形成的配体载体。该配体载体不局限于蛋白质分析用的用途，也可以用于研究蛋白质以外的物质与糖分子之间的相互作用的分析用途。
上述配体载体通过将含有该配体的溶液与表面具有金属膜的支撑体接触，配体的S-S键的各S原子与支撑体表面的金属以S-金属键的形式结合，从而在支撑体表面上引入上述配体。具体地说，通过将蛋白质分析用的支撑体在上述配体溶液中浸渍一定的时间，或者向上述支撑体中注入配体溶液(配体溶液在支撑体表面上流动)，上述配体(配体中所含的链化合物)的S-S键与上述支撑体表面的金等结合而变为S-Au键，由此可以将上述配体固定在支撑体表面上。
作为配体溶液中使用的溶剂，没有特别的限定，可以列举例如，甲醇、水、二甲基乙酰胺(DMAc)及其混合溶剂。此外，浸渍时间为0.5小时～12小时即可，注入量为0.01mM～1mM即可。
如此，由于本发明的配体具有S-S键，可以简单地在蛋白质分析用支撑体的表面上固定化，可以将糖分子简单地引入到上述支撑体上。
另外，如上所述的向支撑体引入糖分子的方法也包含在本发明中。
本发明的配体载体可以用于对糖分子与例如蛋白质等其它物质的相互作用的分析中。具体而言，上述配体载体可以适用于SPR测定、亲和色谱法等中。
例如，作为蛋白质分析，在进行SPR测定时，可以如下进行。即，在蒸镀了金属膜等金属薄膜的支撑体上，使用将本发明的配体固定化而形成的配体载体，使该配体载体与蛋白质接触，根据一般方法，若采用表面细胞质基因组共振装置测定共振角度时，可以观察该配体载体和蛋白质的结合作用。另外，作为用于SPR测定中的上述支撑体(传感芯片)，可以使用例如，玻璃、塑料等，特别优选玻璃。此外，配体载体与蛋白质的接触可以通过，例如将溶解了蛋白质的流态缓冲剂(running buffer)溶液流过该配体载体的表面而进行。作为该流态缓冲剂，可以列举例如，磷酸缓冲溶液等。
本发明的配体载体由于具有上述配体，可以再现性良好地将多个糖分子2维排列在支撑体表面上。因而，可以再现性良好地观测糖分子的生物活性，可以进行对糖分子的结构的解析，定量地评价糖分子的生物活性。
此外，作为本发明的配体载体，即引入了配体的传感芯片可以用于例如下述的SPR测定中。也就是，使用将第1糖分子在支撑体表面上固定化而形成的第1传感芯片和将末端结构与上述第1糖分子不同的第2糖分子在支撑体表面上固定化而形成的第2传感芯片，比较用第1传感芯片得到的SPR测定的检测结果和用第2传感芯片得到的SPR测定的检测结果之差，可以观测糖分子的相互作用。这些传感芯片可以使用固定化的糖分子不同的配体。作为比较的糖分子，可以列举乳糖和葡萄糖、麦芽糖和葡萄糖、曲二糖和葡萄糖等。其中，使用了2个传感芯片，也可以使用多于该个数的、所引入的糖分子的种类不同的传感芯片。另外，糖分子的末端是指没有固定在传感芯片上的那一侧。
在上述SPR测定中，使用对第1糖分子具有特异性作用的蛋白质，规定测定条件，使其作用于上述2个传感芯片，观测两者的共振角度。通过检测两者的共振角度之差，可以测定糖分子与蛋白质等的特异性的相互作用。
此外，观测与糖分子的相互作用的物质不局限于蛋白质。
以上是同时测定2种传感芯片的，但是也不局限于此，可以测定2种以上的传感芯片，也可以不同时测定。此外，也可以使用至少在1个传感芯片上没有引入糖分子的传感芯片。可以使用例如，只固定了链化合物的传感芯片。
若按照上述进行SPR测定，除了糖分子以外，可以使用至少2个具有同样结构的配体的传感器，因此所观测到的该至少2个传感器的相互作用之差是由糖分子引起的。因而，若采用上述测定方法，可以降低糖分子以外的部分和其它物质之间的非特异性相互作用，而观测糖分子和其它物质之间的特异性的相互作用。
下面通过实施例和比较例，对本发明进行更详细的说明，但是本发明不受其任何的限制。
通过下述的步骤，合成作为本发明的链化合物的、前述通式(1)中n为1，X具有如前述通式(2)所示，其中m1、m2、m3为2的结构的链化合物。
如下述通式(11)所示，在65-70℃的二甲氧基乙烷中，在氢氧化苄基三甲基铵的存在下，相对于硝基甲烷(化合物1)迈克尔加成3单位的丙烯酸叔丁酯，以91％的收率得到化合物3。然后在氢气氛围下(6kg/cm2)，在50℃的乙醇中，用雷尼镍(Raney Ni)还原上述化合物3的硝基，以98％的收率得到化合物4。
然后在CH2Cl2中，在1.1当量的1-羟基-7-氮杂苯并三唑(式中记作HOAt)、1.1当量的水溶性碳二亚胺盐酸盐(式中记作WSCI·HCl)的存在下，在上述化合物4中缩合1.1当量的Z-甘氨酸，以85％的收率得到Z-甘氨酸体(化合物5)。
更具体而言，根据文献(G.R.Newkome等，OPPI BRIEFS，28卷，495页，1996)的方法，首先将硝基甲烷(12.2g，200mmol)溶解于50mL 1，2-二甲氧基乙烷中，加热至65-70℃，加入40％氢氧化苄基三甲基铵-甲醇溶液(2mL)，制成硝基甲苯。然后将该硝基甲烷溶液的温度升至75℃，缓慢滴加丙烯酸叔丁酯(90.8mL，620mmol)，溶液温度保持在70-75℃，分4次每次滴加1mL的40％氢氧化苄基三甲基铵-甲醇溶液，搅拌2.5小时，得到硝基甲烷/丙烯酸叔丁酯反应溶液。通过倾析除去该硝基甲烷/丙烯酸叔丁酯反应溶液中的不溶物质，得到的残渣溶于乙醚，通过用冰块冷却的10％盐酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和水各清洗2次，得到残渣溶液。然后使用无水硫酸钠作为干燥剂，干燥该残渣溶液，用钙铁石除去该干燥剂，减压浓缩得到浓缩残余物。然后将浓缩残渣溶解于乙醇进行重结晶，得到白色针状结晶的化合物3(81.8g，91％)。
然后加入化合物3的结晶(10g，22.4mmol)和T-1雷尼镍(6.0g)以及50mL无水乙醇，在6kg/cm2的氢气氛围下，在50℃下搅拌23小时后，用钙铁石滤去T-1雷尼镍得到化合物3反应溶液，减压浓缩该溶液。通过该化合物3反应溶液的减压浓缩得到的浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/甲醇＝20/1)进行精制，得到白色固体的化合物4(产量9.2g，收率98％)。
更具体而言，将Z-甘氨酸(1.26g，6.62mol)、HOAt(0.90g，6.62mmol)、WSCI·HCl(1.27g，6.62mmol)溶于无水二氯甲烷(25mL)，制成Z-甘氨酸溶液，在0℃的温度条件下，向该溶液中加入将化合物4(2.50g，6.02mmol)溶于无水二氯甲烷(2mL)溶液而形成的化合物4溶液，在氩气氛围下，在室温下搅拌36小时，得到Z-甘氨酸/化合物4反应溶液。向该Z-甘氨酸/化合物4反应溶液中加入二氯甲烷和10％柠檬酸水溶液，用二氯甲烷进行萃取。萃取过程中的有机层用水、饱和碳酸氢钠水溶液、以及水各清洗一次，使用无水硫酸钠作为干燥剂干燥后，滤去该干燥剂进行减压浓缩。通过减压浓缩得到的浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/甲醇＝20/1)进行精制，得到白色固体的化合物5(产量3.09g，收率85％)。
对制得的上述化合物5进行ESI-MS(正)测定(飞行时间型质谱分析计测定)，为m/z(质量/电荷比)629.4[(M+Na)+]。由此，可以确认化合物5的结构。
然后，如下述通式(12)中所示，在CH2Cl2/H2O＝10/1的混合溶剂中，用三氟乙酸(以下记做TFA)对上述化合物5的叔丁氧基羰基(-COOC(CH3)3基；通式(12)中的tBu)进行脱保护，以95％的收率得到化合物6。
然后，在4.5当量的五氟苯基二苯基磷酸酯(式中的FDPP)、11当量的二异丙基乙基胺(式中的DIPEA)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的存在下，使上述化合物6与被Boc基保护的间苯二胺衍生物(化合物7，10当量)缩合，以99％的收率得到N-Boc胺衍生物(化合物8)。然后，在甲醇(图中的MeOH)中，在Pd/C(活性炭负载钯)的存在下进行接触氢还原，对与化合物8缩合的上述Z-甘氨酸的苄氧基羰基(式中的Z基)进行脱保护，以79％的收率得到化合物9。
为了制得上述化合物6～9，如下具体地进行操作。
即，为了制得化合物6，将化合物5(2.98g，4.90mmol)溶于二氯甲烷(15mL)后，在-10℃下加入TFA(15mL)和水(1.5mL)后，在室温下搅拌1.5小时，得到化合物5反应溶液。减压浓缩该化合物5反应溶液后，在冰浴中向浓缩残渣中加入10％氢氧化钠水溶液，直至pH达到5，进而加入浓盐酸直至pH达到2，析出白色固体。用水清洗所得的白色固体，得到白色固体的化合物6(产量2.04g，收率95％)。
对制得的上述化合物6进行ESI-MS(负)测定，为m/z 437.1[(M-H)-]。此外，进行核磁共振(1H-NMR、400MHz，d6-DMSO)的结果为δ＝7.34-7.14(6H，m)，5.00(1H，S)，3.55(2h，d，J＝5.9Hz)，3.33(3H，bs)，2.11(6H，m)，1.81(6H，m)。由此，可以确认化合物6的结构。
此外，为了制得化合物7，将间苯二胺(0.50g，4.62mmol)溶于甲醇(35mL)后，在0℃下加入(Boc)2O(1.06mL，4.62mmol)和三乙胺(0.65mL，4.65mmol)后，在室温下搅拌24小时，进行减压浓缩。通过该减压浓缩得到的浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/丙酮＝10/1)进行精制，得到白色固体的化合物7(产量665mg，收率68％)。
对制得的上述化合物7进行ESI-MS(正)测定，为m/z 231.2[(M+Na)+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的结果为δ＝7.02(1H，t，J＝8.0Hz)，6.95(1H，bs)，6.54(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.0Hz)，6.41(1H，bs)，6.35(1H，dd，J＝2.2Hz，J＝7.9Hz)，3.66(2H，bs)，1.53，1.50(9H，s，s)。由此，可以确认化合物7的结构。
此外，为了制得化合物8，将上述化合物6(100mg，228μmol)、上述化合物7(475mg，2.28mmol)、FDPP(394mg，1.03mmol)和二异丙基乙基胺(447μL，2.57mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(2mL)，在氩气氛围下，在室温下搅拌29小时后，加入乙酸乙酯和水，通过乙酸乙酯萃取，有机层用0.5N盐酸、水、饱和碳酸氢钠水溶液、以及饱和食盐水各清洗一次，使用无水硫酸钠作为干燥剂干燥，得到干燥反应溶液。从得到的干燥反应溶液中滤去该干燥剂进行减压浓缩。通过该减压浓缩得到的浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/丙酮＝3/1)进行精制，得到白色固体的化合物8(产量228mg，收率99％)。
对制得的上述化合物8进行ESI-MS(正)测定，为m/z 1009.5[(M+H)+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的结果为δ＝8.75(3H，s)，7.67(3H，s)，7.30-6.95(18H，m)，6.52(1H，bs)，5.04(2H，s)，3.71(2H，d，J＝5.0Hz)，2.23(6H，m)，1.97(6H，m)，1.47(27H，s)。由此，可以确认化合物8的结构。
此外，化合物9具体地可以如下得到。即，将化合物8(200mg，198μmol)溶解于甲醇(3mL)，加入10％Pd/C(62.3mg)，在氢气氛围下，在室温下搅拌15小时后，滤去上述Pd/C，进行减压浓缩。通过该减压浓缩得到的浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/甲醇＝8/1)进行精制，得到白色固体的化合物9(产量136mg，收率78％)。
对制得的上述化合物9进行ESI-MS(正)测定，为m/z 875.5[(M+H)+]。由此，可以确认化合物9的结构。
进而，如下述通式(13)所示，在1.0当量的WSCI·HCl、1.0当量的1-羟基苯并三唑(通式(13)中，HOBt)和CH2Cl2中，使上述化合物9和1.0当量的硫辛酸(化合物10)缩合，以75％的收率得到硫辛酸衍生物(化合物11)。
在CH2Cl2中，在存在氯化三甲基甲硅烷(式中记做TMSCl)和苯酚(PhOH)的酸性条件下，对上述Boc基进行脱保护，得到化合物12(收率32％以上)，即含有3条具有芳香族胺基的烃衍生链的链化合物。
为了得到化合物11、12，具体地进行如下的操作。
即，为了得到化合物11，将化合物10(23.6mg，114mol)和HOBt(15.4mg，114mmol)溶解于无水二氯甲烷(2.3mL)，在0℃的温度条件下，加入化合物9(2.50mg，6.02mmol)，在氩气氛围下，遮蔽光线在室温下搅拌36小时后，加入10％柠檬酸水溶液，用氯仿萃取。有机层用饱和碳酸氢钠水溶液清洗，使用无水硫酸钠作为干燥剂干燥。然后，滤去该干燥剂进行减压浓缩。浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/甲醇＝40/1)进行精制，得到白色固体的化合物11(产量91.0g，收率75％)。
对制得的上述化合物11进行ESI-MS(正)测定，为m/z 1085.5[(M+H)+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的结果为δ＝9.01(3H，bs)，7.67(3H，s)，7.31(1H，bs)，7.27-7.00(12H，m)，3.71(2H，bs)，3.64-3.39(1H，m)，3.12-2.99(2H，m)，2.33(1H，m)，2.32(6H，m)，2.20(2H，m)，2.04(6H，m)，1.82-1.73(1H，m)，1.62-1.47(4H，m)，1.47(27H，s)，1.39-1.25(2H，m)。由此，可以确认化合物11的结构。
此外，为了制得化合物12，将氯化三甲基甲硅烷(0.25mL，2.64mmol)溶解于二氯甲烷(0.49mL)中，加入将苯酚(549mg，5.83mmol)溶解于二氯甲烷(1.46mL)中而形成的苯酚溶液，搅拌后进一步加入化合物11(34.7mg，32.6μmol)，在室温下，遮蔽光线搅拌1.5小时，得到化合物11反应溶液。然后向该化合物11反应溶液中加入氯仿，有机层用饱和碳酸氢钠水溶液清洗，析出黄色固体。析出的黄色固体溶解于乙酸，冷却至4℃，滤去凝聚的固体，得到白色固体的化合物12(产量7.9mg，收率32％)。
对制得的上述化合物12进行ESI-MS(正)测定，为m/z 736.6[(M+H)+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)的结果为δ＝9.57(3H，s)，7.97(1H，m)，6.87(6H，m)，6.67(3H，d，J＝7.7Hz)，6.21(3H，d，J＝7.7Hz)，4.98(6H，bs)，3.67(2H，d，J＝5.1Hz)，3.56(1H，m)，3.16-3.04(2H，m)，2.36(1H，m)，2.25(6H，m)，2.19-2.07(2H，m)，1.93(6H，m)，1.83(1H，m)，1.50(4H，m)，1.33(2H，m)。由此，可以确认化合物12的结构。
使用在实施例1中得到的链化合物12，通过下述的步骤合成具有前述通式(4)中m1、m2、m3为2、且n为1的结构的配体。
如下述通式(14)所示，将实施例1中得到的链化合物12和作为前述通式(10)所示的糖分子的化合物13(5当量)溶解于H2O/二甲基乙酰胺(式中为DMAc)/乙酸(AcOH)＝5/20/1的混合溶剂中，在pH3～4，37℃下，形成席夫碱，将溶剂变为H2O/DMAc/AcOH＝20/5/24的混合体系，在pH3～4，37℃下，加入30当量的NaBH3CN进行还原胺化反应。然后用Sephadex G-50(アマ—シヤムバイオシステムズ公司制造)，通过凝胶过滤色谱法对得到的化合物进行精制，然后进行脱盐处理，得到作为含有3单元糖分子的配体的化合物14。
更具体而言，为了制得化合物14，将实施例1中得到的链化合物12(0.5mg，655nmol)和化合物13(2.8mg，3μmol)溶解于水(25mL)、二甲基乙酰胺(100mμL)和乙酸(5μL)的混合溶剂中，于密封管中在37℃下加热一晚，得到链化合物12/化合物13反应液。将NaBH3CN(2.7mg，39.2μmol)溶解于乙酸(20μL)中制成的NaBH3CN溶液加入到上述链化合物12/化合物13反应液中，在37℃下加热3天后，减压浓缩，用SephadexG-50(溶剂加入0.3M NaCl的PBS)进行凝胶过滤色谱法。对得到的目标馏分进行减压浓缩，用Sephadex G-25(溶剂水)对浓缩残渣进行脱盐，将其溶解于水进行冷冻干燥，得到白色粉末的化合物14(产量1.5mg，收率66％)。
得到的化合物14的质量为3291.28道尔顿(dalton)，由飞行时间型质谱分析计测定得到的m/z 1008.19的峰是以上述通式(14)中所示化合物14为3价离子[M-12Na+9H]3-的形式观测到的。此外，进行1H-NMR(500MHz，D2O)的结果为δ＝7.20(3H，m)，6.82(6H，m)，6.64(3H，m)，5.35(3H，d，J＝3.5Hz)，5.13(3H，J＝2.5Hz)，4.51(3H，d，J＝2.4Hz)，4.29(6H，m)，4.18(6H，m)，4.06(6H，m)，3.97(9H，m)，3.87(3H，m)，3.82(3H，m)，3.78(6H，m)，3.68(9H，m)，3.56(9H，s)，3.34(6H，m)，3.24(3H，dd，J＝3.4，10.5Hz)，3.08(4H，m)，2.44(6H，m)，2.33(1H，m)，2.27(2H，t)，1.86(1H，m)，1.56-1.46(2H，m)，1.35-1.14(4H，m)。由此，可以确认化合物14的结构。
通过下述的步骤，合成作为本发明的链化合物的、前述通式(1)中n为1，X具有如前述通式(3)所示且其中m4、m5、m6、m7全为2、p1和p2为1的结构的链化合物。
如下述通式(15)中所示，在MeOH中加入2.3当量的三氟化硼·乙醚加成物(式中为BF3·OEt2)，在酸性条件下进行回流，酯化二元羧酸(化合物15)，以79％的收率得到酯化体(化合物16)。
然后，在1.1当量的HOBt、1.1当量的二环己基碳二亚胺(式中为DCC)和CH2Cl2中，将1.1当量的Z-甘氨酸与上述化合物16缩合，以94％的收率得到甘氨酸衍生物(化合物17)。
然后，在MeOH中加入2N的NaOH，在碱性条件下水解化合物17的酯基，以98％的收率得到二元羧酸衍生物(化合物18)。
为了制得上述化合物16～19，如下具体地进行操作。
即，为了制得化合物16，将化合物15(亚氨基二乙酸；10.0g，75.1mmol)和BF3·OEt2(三氟化硼-乙醚螯合物；22mL，173mmol)溶于50mL无水甲醇中，在氩气氛围下回流5小时后，加入饱和碳酸氢钠水溶液中和，用氯仿萃取。然后向水层中加入二乙胺，直至pH达到9，再用氯仿萃取，使用无水硫酸钠作为干燥剂干燥后，滤去该干燥剂进行减压浓缩，得到黄色油状物的化合物16(产量9.61g，收率79％)。
对制得的上述化合物16进行ESI-MS(正)测定，为m/z 162.1[(M+H)+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的结果为δ＝3.74(6H，s)，3.48(4H，s)，2.00(1H，s)。由此，可以确认化合物16的结构。
此外，为了制得化合物17，将化合物16(1.00g，6.21mmol)和二环己基碳二亚胺(1.41g，6.83mmol)和HOBt(0.92g，6.83mmol)溶解于25mL无水二氯甲烷中，在氩气氛围下，在0℃下搅拌0.5小时后，加入Z-甘氨酸(1.42g，6.83mmol)，在室温下搅拌5天。将通过搅拌析出的沉淀物滤去，滤液用氯仿萃取，有机层用1N的盐酸和饱和碳酸氢钠水溶液分别清洗2次，再用水清洗1次，使用无水硫酸钠作为干燥剂干燥后，滤去该干燥剂进行减压浓缩。通过减压浓缩得到的浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/丙酮＝2/1)进行精制，得到白色固体的化合物17(产量2.05g，收率94％)。
对制得的上述化合物17进行ESI-MS(正)测定，为m/z 375.1[(M+Na)+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的结果为δ＝7.36(5H，m)，5.69(1H，bs t)，5.12(2H，s)，4.22，4.12(4H，s，s)，4.06(2H，d)，3.78，3.73(4H，s，s)。由此，可以确认化合物17的结构。
此外，为了得到化合物18，将化合物17(1.50g，4.26mmol)溶解于甲醇(20mL)中，加入2N的NaOH(9mL)，在0℃下搅拌2.5小时后，加入Dowex 50WX-8(H+型)中和直至pH达到6，滤去该Dowex 50WX-8进行减压浓缩。在通过减压浓缩得到的浓缩残渣中加入水，滤去不溶物质后，进行减压浓缩和冷冻干燥，得到白色固体的化合物18(产量1.30g，收率98％)。
对制得的上述化合物18进行ESI-MS(负)测定，为m/z 321.1[(M-2H+Na)-]。此外，进行1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)的结果为δ＝7.32(5H，m)，7.21(1H，m)，5.01(2H，s)，3.93，3.84(4H，s，s)，3.72(2H，d，J＝5.4Hz)。由此，可以确认化合物18的结构。
然后，如下述通式(16)中所示，在2.5当量的FDPP、2.5当量的DIPEA、DMF中，将用Boc基保护芳香族胺基末端的化合物19(2.5当量)与上述化合物18反应，以60％的收率得到N-Boc胺衍生物(化合物20)。
然后，在MeOH中，在Pd/C存在下，进行接触氢还原。对和化合物20缩合的上述Z-甘氨酸的Z-基进行脱保护，以92％的收率得到胺衍生物(化合物21)。
为了制得化合物19～21，具体地进行如下的操作。
即，为了制得化合物19，将4-氨基苯甲酸(3.33g，14.0mmol)和HOBt(1.93g，14.3mmol)在无水二氯甲烷(60mL)中悬浊，在氩气氛围下，在0℃下搅拌15分钟后，加入将WSCI·HCl(2.87g，15.0mmol)溶于无水二氯甲烷(30mL)中而制成的WSCI·HCl溶液，搅拌50分钟，制成4-氨基苯甲酸/HOBt反应溶液。将二乙胺(0.79mL，7.00mmol)加入到该4-氨基苯甲酸/HOBt反应溶液中，遮蔽光线在室温下搅拌一晚，得到白色结晶。过滤得到该白色结晶后，用甲醇重结晶，得到白色结晶的化合物19。产量为3.53g(收率92.9％)。
对上述化合物19进行ESI-MS(正)测定，为m/z 542.4[(M+H)+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的结果为δ＝7.77-7.74(4H，d，J＝8.7Hz)，7.50-7.48(4H，d，J＝8.6Hz)，3.70-3.66(4H，m，J＝5.2Hz)，3.34-3.28(4H，m，J＝5.6Hz)，1.53(18H，s)。由此，可以确认化合物19的结构。
此外，为了制得化合物20，将上述化合物18(50.0g，154μmol)、化合物19(209mg，386μmol)、FDPP(148mg，386μmol)溶于无水二甲基甲酰胺(3mL)后，加入二异丙基乙基胺(67.2μL，386μmol)，在氩气氛围下，在室温下搅拌20小时后，制得化合物18/化合物19反应溶液。减压浓缩该化合物18/化合物19反应溶液，得到的浓缩残渣用氯仿萃取，有机层用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠水溶液清洗，使用无水硫酸钠作为干燥剂干燥后，滤去该干燥剂进行减压浓缩。通过减压浓缩得到的浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/甲醇＝10/1)进行精制，得到白色固体的化合物20(产量125mg，收率59％)。
对上述化合物20进行ESI-MS(正)测定，为m/z 1393.7[(M+Na)+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的结果为δ＝7.88(1H，bs)，7.73-7.66(10H，m)，7.56(1H，bs)，7.38(4H，d，J＝8.4Hz)，7.34-7.29(6H，m)，7.17，7.05(2H，bs，bs)，5.35(1H，bs)，5.00(2H，s)，3.96(2H，bs)，3.64(4H，带)，3.55(4H，带)，3.51(6H，带)，3.43，3.27，3.17(6H，bs，bs，bs)，1.50，1.49(36H，s，s)。由此，可以确认化合物20的结构。
此外，为了制得化合物21，将化合物20(103mg，74.4μmol)溶解于甲醇(3mL)，加入10％Pd/C(84mg)，在氢气氛围下，在室温下搅拌47小时后，滤去上述Pd/C，进行减压浓缩。得到白色固体的化合物21(产量84.9mg，收率92％)。
对制得的上述化合物21进行ESI-MS(正)测定，为m/z 630.5[(M+H+Na)2+]。由此，可以确认化合物21的结构。
进而，如下述通式(17)所示，在CH2Cl2/DMF＝4/1的混合溶剂中，在1.1当量的HOBt、1.0当量的WSCI·HCl的存在下，使上述化合物21和1.1当量的硫辛酸(化合物10)缩合，以75％的收率得到酰胺化合物(化合物22)。
进而，在CH2Cl2中，在存在TFA的酸性条件下，对上述Boc基进行脱保护，得到化合物23(收率91％以上)，即含有4条具有芳香族胺基的烃衍生链的链化合物。
为了得到化合物22、23，具体地进行如下的操作。
即，为了得到化合物22，将化合物10(12.8mg，62.2μmol)和HOBt(8.4mg，62.2μmol)溶解于无水二氯甲烷(10mL)，在氩气氛围下，在0℃下遮蔽光线搅拌，制成化合物10/HOBt反应溶液。然后将化合物21(70.0mg，56.5μmol)溶于二甲基甲酰胺(0.5mL)，滴加上述化合物10/HOBt反应溶液后，在室温下搅拌19小时后，用乙酸乙酯萃取，得到萃取液。该萃取液的有机层用10％柠檬酸水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液各清洗1次，使用无水硫酸钠作为干燥剂干燥后，滤去该干燥剂进行减压浓缩。通过减压浓缩得到的浓缩残渣用制备硅胶色谱法(溶剂氯仿/甲醇＝15/1)进行精制，得到白色固体的化合物22(产量60.8mg，收率75％)。
对制得的上述化合物22进行ESI-MS(正)测定，为m/z 735.3[(M+2Na)2+]。此外，进行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的结果为δ＝7.76-7.79(11H，m)，7.55(1H，bs)，7.42(4H，d，J＝8.6Hz)，7.35(5H，m)，7.13，7.00，6.97(3H，bs，bs，bs)，5.84(1H，bs)，4.04(2H，bs)，3.67(4H，带)，3.55(4H，带)，3.48(8H，带)，3.41，3.29，3.22(6H，bs，bs，bs)，3.16-3.03(2H，m)，2.39(1H，m)，2.02(2H，m)，1.84(1H，m)，1.58-1.52(4H，m)，1.51，1.49(36H，s，s)，1.35(2H，m)。由此，可以确认化合物22的结构。
此外，为了制得化合物23，将化合物22(48.2mg，33.8μmol)溶解于二氯甲烷(1mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，遮蔽光线在0℃下搅拌1小时后，进行减压浓缩，得到的残渣溶于甲醇，加入Dowex MarathonA(OH-型)中和。中和后，滤去该Dowex Marathon A，减压浓缩，得到白色固体的化合物23(产量31.6mg，收率91％)。
对制得的上述化合物23进行ESI-MS(正)测定，为m/z 534.2[(M+2Na)2+]。由此，可以确认化合物23的结构。
使用在实施例3中得到的链化合物23，通过下述的步骤，合成具有前述通式(5)中m4、m5、m6、m7全为2、n为1且p1、p2为1的结构的配体。
如下述通式(18)所示，将实施例3中得到的链化合物23和作为下述通式(18)所示的糖分子的链化合物23(5当量)溶解于H2O/DMAc/AcOH＝5/20/1的混合溶剂中，在pH3～4，37℃下，形成席夫碱(式中的亚胺型)，然后将溶剂变为H2O/DMAc/AcOH＝9/20/22的混合体系，在pH3～4，37℃下，加入64当量的NaBH3CN进行还原反应(式中的还原)。然后用Sephadex G-50，通过凝胶过滤色谱法对得到的化合物进行精制，再进行脱盐处理，得到作为含有4单元糖分子的配体的化合物24。
为了制得化合物24，将链化合物23(0.5mg，488nmol)和化合物13(2.1mg，2.4μmol)溶解于水(25μL)、二甲基乙酰胺(100μL)和乙酸(5μL)的混合溶剂中，于密封管中在37℃下加热3小时，得到链化合物23/化合物13反应液。将NaBH3CN(2.18mg，31.2μmol)溶解于乙酸(45μL)，加入到上述链化合物23/化合物13反应液中，在37℃下加热3天后，减压浓缩，用Sephadex G-50(1.6×80cm，PBS-0.3N NaCl)精制。对通过精制得到的目标馏分进行减压浓缩，用Sephadex G-25(1.6×40cm，水)对浓缩残渣进行脱盐，对通过该脱盐得到的馏分进行减压浓缩，将其溶解于水进行冷冻干燥，得到白色粉末的化合物24(产量1.0mg，收率47％)。
得到的化合物24的质量为4396.37道尔顿，由飞行时间型质谱分析计测定得到的m/z 1368.93的峰是以上述通式(18)中所示化合物24为3价离子[M-13Na+10H]3-的形式观测到的。此外，质谱测定的结果为8＝7.70-7.55(8H，m)，6.78-6.64(8H，m)，5.34(4H，s)，5.20(8H，d，J＝3.3Hz)，5.15(4H，bs)，4.52(4H，bs)，4.29(8H，m)，4.19(8H，m)，4.05(4H，m)，3.99(4H，带)，3.87-3.80(16H，带)，3.73-3.66(24H，m)，3.87(3H，m)，3.57(12H，s)，3.49(4H，dd，J＝3.8，9.7)，3.39-3.34(14H，m)，3.26-3.19(12H，m)，2.60(1H，m)，2.21-2.13(2H，m)，1.77(1H，m)，1.50-1.13(4H，m)。由此，可以确认化合物24的结构。
使用在实施例2中得到的，具有在前述通式(4)中m1、m2、m3均为2、且n为1的结构的配体的化合物14，进行SPR测定。
即，通过在蒸镀金属膜的玻璃基板表面进行下述的操作，使配体(化合物14)固定化，观测化合物14和作为肝素结合性蛋白质的重组[冯]维勒布兰德因子(recombinant von Willebrand factor)(以下简称为rvWF)的结合过程。
(5-1配体引入芯片的制造)首先，把在13×20×0.7mm的玻璃基板上蒸镀有50nm金薄膜的传感芯片(日本レ-ザ-电子株式会社制造)放入UV臭氧清洁器(商品名NL-UV253，日本レ-ザ-电子株式会社)中，紫外线照射20分钟，通过臭氧清洁传感芯片的金表面。然后，将该传感芯片安装在培养池内的特氟隆(注册商标)制培养池支架上，在该培养基内加入50mL 0.1mM的化合物14的甲醇溶液密封，在室温下，使用Bio Dancer(商品名，NewBrunswick Scientific公司)，柔和地振荡一晚。然后，用100μL甲醇清洗上述培养池6次，从特氟隆制培养池支架上拆下传感芯片。接着将拆下的传感器浸渍在充满甲醇的皿中，平稳地振荡以重复进行2次清洗操作，按照水、甲醇的顺序与上述同样地对传感芯片进行清洗，得到配体引入芯片(配体载体)。风干该配体引入芯片后，安装到表面细胞质基因组共振装置SPR670(商品名日本レ-ザ-电子株式会社)的传感芯片盒(玻璃棱柱)中。
(5-2由配体引入芯片和蛋白质之间的疏水性相互作用引起的非特异性相互作用的研究)在上述得到的配体引入芯片上，在25℃的温度条件下，以15μL/分钟的流速，直到用上述表面细胞质基因组共振装置测定的共振角度变化达到固定值，排出作为流态缓冲剂的磷酸缓冲溶液(PBS；pH7.4)。然后，将牛血清白蛋白(BSA)溶解于流态缓冲剂中配制成BSA溶液，将60μL该BSA溶液以15μL/分钟的流速注入至配体引入芯片中，以使在SPR测定中作为蛋白质使用的BSA的浓度达到0.1mg/mL。
为了研究由流入上述BSA溶液的配体引入芯片表面的金和作为蛋白质的BSA之间的疏水性相互作用引起的非特异性相互作用，用表面细胞质基因组共振装置测定时，基本没有观测到共鸣角度变化。由此，认为在使用引入化合物14而形成的配体引入芯片时，可以降低由蛋白质和配体引入芯片之间的非特异性相互作用产生的影响，因此可以定量地进行蛋白质和糖之间的结合相互作用的评价。
(5-3rvWF的解离常数的解析)除了在前述(5-1)中得到的配体引入芯片上使用rvWF溶液以代替上述(5-2)的BSA溶液以外，其余按照与上述(5-2)同样的步骤，将rvWF溶液注入至配体引入芯片表面。另外，配制rvWF溶液时，将rvWF溶解于上述流态缓冲剂中进行配制，以达到125nM～1600nM范围的浓度。
改变上述rvWF溶液的浓度，将rvWF溶液注入至配体引入芯片表面，相对于rvWF溶液的注入时间(时间(秒))的经过，用表面细胞质基因组共振装置测定研究基于化合物14和rvWF的结合所产生的响应(Response(RU；响应单位))。其结构如图1所示。
另外，上述引入了rvWF的配体引入芯片可以通过在该配体引入芯片的表面上，以60μL/分钟的流速流过10mM的NaOH达1分钟以上进行再生，从而实现再利用。
此外，使用表面细胞质基因组共振装置(SPR670)中附属的软件，根据作为配体的化合物14与rvWF的结合过程的观测结果(图1)，计算出解离常数(KD)、结合速度常数(Ka)、解离速度常数(Kd)的值。其结果如表1所示。
(表1)
根据文献1中记载的步骤，制备含有1单元具有前述通式(10)所示结构的寡糖、具有下述通式(19)所示结构的配体的该化合物25。
然后，除了用上述化合物25代替前述化合物14以外，其余按照和前述实施例5的(5-1)同样的步骤，得到配体引入芯片。使用该配体引入芯片，按照和前述实施例5的(5-2)同样的步骤，确认没有发生由配体引入芯片和蛋白质之间的疏水性相互作用而引起的非特异性相互作用。然后，按照和前述实施例5的(5-3)同样的步骤，将rvWF溶液注入至配体引入芯片表面，用表面细胞质基因组共振装置测定伴随着rvWF溶液的注入时间经过而产生的共振角度变化，研究化合物25和rvWF的结合过程。其结果如图2所示。
此外，根据图2，按照和前述实施例5的(5-3)同样的步骤，计算出解离常数(KD)、结合速度常数(Ka)、解离速度常数(Kd)的值。其结果如表1所示。
如上述表1所示，可以看出，使用作为本实施例的配体的化合物14的配体引入芯片与使用化合物25的配体引入芯片相比，对于rvWF显示出较高的亲和性。由此可知，若使用本实施例的配体引入芯片，可以再现性良好地观测糖分子的生物活性，上述配体引入芯片对于进行糖分子的结构解析和评价糖分子的生物活性是非常良好的。
另外，对于在本发明的最佳实施方式这部分内容中进行的具体实施方式
和实施例，严格地说，其是为了揭示本发明的技术内容而列举的，本发明不应该被狭义地解释为仅限于这些具体的示例，在本发明的宗旨和下面记载的权利要求的范围内，可以进行各种变化而实施。
工业实用性如上所示，通过本发明，可以提供一种能够将3单元或4单元的糖分子再现性良好地2维排列在蛋白质分析用等支撑体上的链化合物。此外，上述链化合物基本可以忽略由其和蛋白质之间的非特异性相互作用而产生的影响。
此外，本发明的配体是通过在上述链化合物中引入糖分子而形成的，由于可以使3单元或4单元的糖分子集合化，因此可以再现性良好地测定糖分子的生物活性。
因此，通过运用本发明的链化合物和配体，可以用于生物科技产业中，以检测生物分子之间的相互作用。特别是可以用于采用芯片工艺和亲和色谱柱的领域中。此外，也可以用于利用生物探测器和生物传感器的领域，以及用于制药领域和诊断·检查等医疗技术中。
权利要求
1.一种链化合物，其特征在于具有如通式(1) (式中，n为1到6的整数)所示的结构，上述X的结构中，具有由3或4条末端具有芳香族胺基、且主链上可以有碳-氮键的烃衍生链而形成的多分支结构部分。
2.权利要求1记载的链化合物，其特征在于上述X具有通式(2) (式中m1、m2、m3各自独立地是1到6的整数)所示的结构。
3.权利要求2记载的链化合物，其特征在于在上述通式(2)中，m1、m2、m3全为2。
4.权利要求1记载的链化合物，其特征在于上述X具有通式(3) (式中m4、m5、m6、m7、p1、p2各自独立地是1到6的整数)所示的结构。
5.权利要求2记载的链化合物，其特征在于在上述通式(3)中，m4、m5、m6、m7全为2，p1、p2均为1。
6.一种配体，其特征在于其是通过在权利要求1至5中任一项记载的链化合物的芳香族胺基上引入糖分子而形成的。
7.权利要求6记载的配体，其特征在于上述糖分子为选自单糖类、寡糖类、多糖类中的至少一种。
8.一种配体，其特征在于具有通式(4) (式中m1、m2、m3、n各自独立地是1到6的整数)所示的结构。
9.权利要求8记载的配体，其特征在于在上述通式(4)中，m1、m2、m3全为2，n为1。
10.一种配体，其特征在于具有通式(5) (式中m4、m5、m6、m7、n、p1、p2各自独立地是1到6的整数)所示的结构。
11.权利要求10记载的配体，其特征在于在上述通式(5)中，m4、m5、m6、m7全为2，n为1，p1、p2均为1。
12.一种链化合物的制备方法，其特征在于包含下述工序将硫辛酸与具有3条或4条支链的胺化合物进行缩合反应的步骤，其中该支链的芳香族胺基末端被保护基团保护，和对上述芳香族胺基末端的保护基团进行脱保护的步骤。
13.一种链化合物的制备方法，其特征在于使用权利要求1至5中任一项记载的链化合物和糖分子进行还原胺化反应。
14.一种将糖分子设置在支撑体表面上的糖分子的引入方法，其特征在于将含有权利要求6至11中任何一项所记载的配体的溶液和表面具有金属的支撑体接触。
15.一种配体载体，其特征在于使权利要求6至11中任何一项所记载的配体在表面具有金属的支撑体上固定化。
16.权利要求15记载的配体载体，其特征在于其用于表面细胞质基因组共振测定用的传感芯片。
17.权利要求15记载的配体载体，其特征在于其用于亲和色谱法所用的柱中。
全文摘要
一种链化合物，其具有通式(1)，(式中，n为1到6的整数)所示的结构。上述X的结构中，具有由3或4条末端具有芳香族胺基且主链上可以有碳－氮键的烃衍生链而形成的多分支结构部分。此外，配体是通过将上述链化合物引入糖分子而形成的。
文档编号C07K5/00GK1688598SQ0382453
公开日2005年10月26日 申请日期2003年9月8日 优先权日2002年9月9日
发明者隅田泰生, 荒野明男, 楠本正一, 迈克尔·索贝尔 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 国立大学法人鹿儿岛大学