专利名称：测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法
技术领域：
本专利涉及一种测定受体和配体之间结合常数的毛细管电泳方法，尤其是涉及一种以气压为驱动力的亲和毛细管电泳法。
背景技术：
亲和毛细管电泳法(AffinityCapillary Electrophoresis, ACE)[1]是研究分子之间相互作用的一种常用模式。由于其具有样品用量少，不需要提纯，操作简单，可在模拟生理环境的水溶液中进行测定等优点，在蛋白结合研究领域中应用越来越广泛。它主要包括两种研究方法一种称为“L/’法，是以受体为缓冲液添加剂，以配体为进样样品，测定配体在含有不同浓度受体的缓冲液中有效电泳淌度的变化；另一种称为“IV’法，是以配体为缓冲液添加剂，以受体为进样样品，测定受体在含有不同浓度配体的缓冲液中有效电泳淌度的变化。有效电泳淌度的变化是判断受体与配体是否发生结合作用，以及计算结合常数的依据。但是，淌度往往受到很多因素的影响[2]。例如，毛细管柱温的变化会影响缓冲液的粘度，进一步影响电渗流和电泳淌度的大小；毛细管电泳过程是在高电压下完成的，长时间的高电压会引起缓冲液中电解质的电离，破坏缓冲液PH的稳定；毛细管内表面的吸附问题不仅影响淌度大小，还会造成样品峰形变化。采用常规的ACE方法测定样品有效电泳淌度时， 不能有效地解决重现性和准确性差的问题，结合常数的计算结果也会有较大的偏差。采用内管壁涂层的毛细管[3]作为亲和毛细管电泳的分离通道，虽然可以抑制管壁吸附，改善重现性，但是涂层步骤繁琐，且涂层柱寿命较短。1996年Williams和￥18&4]提出了一种快速测定淌度的方法，在毛细管的恒温区实现电渗流和样品电泳淌度的快速、准确测定。该方法已被广泛用于涂层毛细管电泳、非水毛细管电泳的电渗流测定，以及PKa值的测定等领域。[1]Liu X J, Dahdouh F, Salgado M, Gomez F A. Recent advances in affinity capillary electrophoresis(2007), J.Pharm. Sci. ,2009,98(2) :394-410.[2]朱健萍，胡昌勤，刘文英.毛细管电泳迁移时间重现性影响因素的探讨，色谱， 2006,24(4) :396-401.[3] Horvath J, Dolni k V. Polymer wall coatings for capillary electrophoresis, Electrophoresis,2001, 22 :644-655.[4]Williams B A,Vigh G. Fast,accurate mobility determination method for capillary electrophoresis, Anal. Chem. ,1996,68 :1174-1180.
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术ACE方法测定结合常数时存在的问题，提供一种快速、准确的测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法。本发明的技术方案概述如下测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法，包括如下步骤
(1)使用毛细管电泳仪设备，将毛细管依次用氢氧化钠水溶液和缓冲液冲洗，然后向毛细管中充满缓冲液或充满一系列不同受体浓度的缓冲液溶液，用下面0)-(7)的步骤，分别测定配体在缓冲液中的有效电泳淌度μ ο，和配体在一系列不同受体浓度的缓冲液中的有效电泳淌度μ！；(2)第一次进样采用气压进样的方法向毛细管中进样，所进样品为含有待测配体和可以产生检测信号的中性标记物的混合物；(3)样品的推进将毛细管进样端插入缓冲液槽，施加与步骤( 相同的气压，将第一次进样的样品推入到毛细管位于所述毛细管电泳仪设备的恒温区；(4)电泳过程向毛细管两端施加200-300V/cm场强的分离电压，使第一次进样的样品向检测窗口迁移，但不能经过检测窗口 ；(5)第二次进样采用与步骤( 所述气压进样相同的方法向毛细管中进样，所进样品为可以产生检测信号的中性标记物；(6)检测将毛细管进样端插入缓冲液槽，施加与步骤( 相同的气压，将两次进样的样品推向毛细管的检测窗口，工作站上出现三个峰，记录三个峰的出峰时间；(7)有效电泳淌度的计算峰一和峰二代表第一次进样的待测配体和中性标记
物，峰三代表第二次进样的中性标记物；峰三的出峰时间t3，体现了气压推动的快慢，根据
t3和毛细管的有效长度Ld，可以计算气压推动速度vm，如公式1 ；峰一和峰二之间的距离为
待测配体的有效迁移距离La，且该距离产生在毛细管的恒温区，不受温度的影响；根据峰一
和峰二的出峰时间差△ t和气压推动速度vm，计算出La，如公式2 ；根据公式3，计算待测配
体的有效电泳淌度μ ； Ld
权利要求
1.测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法，其特征是包括如下步骤(1)使用毛细管电泳仪设备，将毛细管依次用氢氧化钠水溶液和缓冲液冲洗，然后向毛细管中充满缓冲液或充满一系列不同受体浓度的缓冲液溶液，用下面0)-(7)的步骤，分别测定配体在缓冲液中的有效电泳淌度μ C1，和配体在一系列不同受体浓度的缓冲液中的有效电泳淌度μ！；(2)第一次进样采用气压进样的方法向毛细管中进样，所进样品为含有待测配体和可以产生检测信号的中性标记物的混合物；(3)样品的推进将毛细管进样端插入缓冲液槽，施加与步骤( 相同的气压，将第一次进样的样品推入到毛细管位于所述毛细管电泳仪设备的恒温区；(4)电泳过程向毛细管两端施加200-300V/cm场强的分离电压，使第一次进样的样品向检测窗口迁移，但不能经过检测窗口 ；(5)第二次进样采用与步骤( 所述气压进样相同的方法向毛细管中进样，所进样品为可以产生检测信号的中性标记物；(6)检测将毛细管进样端插入缓冲液槽，施加与步骤( 相同的气压，将两次进样的样品推向毛细管的检测窗口，工作站上出现三个峰，记录三个峰的出峰时间；(7)有效电泳淌度的计算峰一和峰二代表第一次进样的待测配体和中性标记物，峰三代表第二次进样的中性标记物；峰三的出峰时间、，体现了气压推动的快慢，根据t3和毛细管的有效长度Ld，可以计算气压推动速度vm，如公式1 ；峰一和峰二之间的距离为待测配体的有效迁移距离La，且该距离产生在毛细管的恒温区，不受温度的影响；根据峰一和峰二的出峰时间差At和气压推动速度vm，计算出LA，如公式2 ；根据公式3，计算待测配体的有效电泳淌度μ ；
2.根据权利要求1所述的测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法， 其特征是所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，硼砂缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
3.根据权利要求1所述的测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法，其特征是所述中性标记物为N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，硫脲，异亚丙基丙酮或丙酮。
4.测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法，其特征是包括如下步骤(1)使用毛细管电泳仪设备，将毛细管依次用氢氧化钠水溶液和缓冲液冲洗，然后向毛细管中充满缓冲液或充满一系列不同配体浓度的缓冲液溶液，用下面0)-(7)的步骤，分别测定受体在缓冲液中的有效电泳淌度μ 3，和受体在一系列不同配体浓度的缓冲液中的有效电泳淌度μ4;(2)第一次进样采用气压进样的方法向毛细管中进样，所进样品为含有待测受体和可以产生检测信号的中性标记物的混合物；(3)样品的推进将毛细管进样端插入缓冲液槽，施加与步骤( 相同的气压，将第一次进样的样品推入到毛细管位于所述毛细管电泳仪设备的恒温区；(4)电泳过程向毛细管两端施加200-300V/cm场强的分离电压，使第一次进样的样品向检测窗口迁移，但不能经过检测窗口 ；(5)第二次进样采用与步骤( 所述气压进样相同的方法向毛细管中进样，所进样品为可以产生检测信号的中性标记物；(6)检测将毛细管进样端插入缓冲液槽，施加与步骤( 相同的气压，将两次进样的样品推向毛细管的检测窗口，工作站上出现三个峰，记录三个峰的出峰时间；(7)有效电泳淌度的计算峰一和峰二代表第一次进样的待测受体和中性标记物，峰三代表第二次进样的中性标记物；峰三的出峰时间、，体现了气压推动的快慢，根据t3和毛细管的有效长度Ld，可以计算气压推动速度vm，如公式1 ；峰一和峰二之间的距离为待测受体的有效迁移距离Lb，且该距离产生在毛细管的恒温区，不受温度的影响；根据峰一和峰二的出峰时间差At和气压推动速度vm，计算出LB，如公式5 ；根据公式6，计算待测受体的有效电泳淌度μ ；
5.根据权利要求4所述的测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法， 其特征是所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，硼砂缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
6.根据权利要求4所述的测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法，其特征是所述中性标记物为N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，硫脲，异亚丙基丙酮或丙酮。
全文摘要
本发明公开了测定受体配体间结合常数的压力驱动亲和毛细管电泳方法，步骤为(1)使用毛细管电泳仪设备，冲洗毛细管并充满缓冲液或一系列不同受体浓度的缓冲液溶液，用(2)一(7)的步骤，分别测定配体在缓冲液中的有效电泳淌度μ0，和配体在一系列不同受体浓度的缓冲液中的有效电泳淌度μ1；(2)第一次进样；(3)样品推进；(4)电泳；(5)第二次进样；(6)检测；(7)有效电泳淌度计算；(8)结合常数计算。本发明的方法消除了毛细管内温度不均一对淌度的影响，减小了高电压下缓冲液电解质解离现象的发生。准确测定出含有不同浓度受体缓冲液中配体的有效电泳淌度，并由此计算结合常数，缩短了分析时间。
文档编号G01N27/447GK102253103SQ201110104249
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者包建民, 张勃, 李优鑫 申请人:天津大学