具有修饰的fc区域和改变的与fc受体的结合的抗原结合分子的制作方法

专利名称：：具有修饰的fc区域和改变的与fc受体的结合的抗原结合分子的制作方法具有修饰的FC区域和改变的与FC受体的结合的抗原结合分子发明背景发明领域本发明涉及包含具有一个或多个氨基酸修饰的Fc区域的抗原结合分子，包括抗体，其中所述抗原结合分子作为所述修饰的结果而表现出与一个或多个Fc受体的改变的结合。本发明还涉及编码该抗原结合分子的多核苷酸和载体，及包含所述多核苷酸和载体的宿主细胞，以及制备本发明抗原结合分子的方法，及其在治疗多种疾病和病症，例如癌症中的用途。发明背景抗体利用作为最丰富的血清免疫球蛋白的IgG，在体液和细胞免疫系统间提供连接。当抗体的Fab区域识别抗原，Fc部分与由全部免疫感受态细胞差异表达的Fcy受体(FcyRs)结合。一旦受体通过多价抗原/抗体复合体交联，就触发靶细胞的脱粒、细胞裂解或噬菌作用，以及细胞因子编码基因的转录活化(Deo,Y.M.等，/mmw"o/.7^^卩今^免萄7《「":127-135(1997))。由该抗体的FC区域介导的效应子功能能分为两类(l)抗体与抗原结合后起作用的效应子功能(这些功能包括，例如，补体级联系统或Fc受体(FcR)携带细胞的参与)；和(2)独立于抗原结合起作用的效应子功能(这些功能赋予，例如，循环的维持和通过胞转作用跨细胞屏障转移的能力)。例如，补体的Cl组分与抗体的结合激活该补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理和裂解中很重要。该补体的激活还刺激炎症反应，及还可能与自体免疫超敏感性有关。进一步，抗体通过该Fc区域与细胞结合，其中抗体Fc区域上Fc受体结合位点与细胞上的Fc受体(FcR)结合。存在大量特异于不同抗体种类的Fc受体，包括IgG(Y受体)，IgE(e受体)，IgA(a受体)和IgM(P受体)。尽管本发明不限于任何具体的机制，抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发大量重要且多样的生物反应，包括抗体包被微粒的吞入和破坏，免疫复合体的清除，杀伤细胞引起的抗体包被耙细胞的裂解(己知为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)，炎症介质的释放，胎盘的转移和免疫球蛋白生产的控制。FcRs是通过它们对免疫球蛋白同种型的特异性来定义的；IgG抗体的Fc受体称作FcYR，IgE抗体的Fc受体称作FcsR，IgA抗体的Fc受体称作FcaR，等等。已鉴定了人FcyR的三种亚类FqRI(CD64),FcyRlI(CD32)和Fcy腿(CD16)。因为每个FcYR亚类由2或3个基因编码，且交错的RNA剪接导致多重转录产物，所以FcyR同种型存在着广泛的多样性。编码FcYRl亚类的3个基因(FcyRIA,FcyRIB和FqRIC)簇生在第一条染色体长臂的区域lq21.1中；编码FcYRlI同种型的基因(FcYRnA，FcYRllB和FcyRlIC)和编码FcyRIII的2个基因(FcyRIIIA和FcyRlIlB)都簇生在区域lq22中。这些不同的FcR亚型表达在不同的细胞类型(参见，例如Ravetch，J.V.和Kinet,J.Rj朋仏iev./mww"o/f^i^^"述牟i".9:457-492(1991))上。例如，人类中，仅在嗜中性粒细胞上发现FCYRIIIB，而在巨噬细胞，单核细胞，天然杀伤(NK)细胞，以及T细胞亚群中都发现了FcYRIIIA。显著地，FcyRIIIA是存在于NK细胞上唯一的FcR，而NK细胞是涉及ADCC的细胞种类之一。FcyRI，FqRlI和FcYRlII是免疫球蛋白超家族(IgSF)受体；FcYRI在其细胞外结构域中含有3个IgSF结构域，而FcYRlI和FcYRffl在它们的细胞外结构域中仅含有2个IgSF结构域。Fc受体的另一种类型是新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn结构上近似于主要组织相容性复合体(MHC)，且由非共价结合于P2微球蛋白的a链组成。近期发现了激活受体FcyRHIa进行体内消除肿瘤细胞的重要性。在滤泡性非霍奇金淋巴瘤患者中报道了FcyRlIIa基因型和对利妥昔单抗的临床和分子反应之间的相互关系，其中，所述利妥昔单抗是用于对抗血液病学恶性肿瘤的抗-CD20嵌合抗体(Cartron，G.等，5/oocOzfe^9卯(3力754-758(2002))。作者指出利妥昔单抗的功效在对"高亲和性"FcYRlIIa纯和的患者中高于在对"低亲和性"FcYR!IIa杂合的或纯合的患者中的功效，其中"高亲和性"FcyRlIIa的特征为在位置158处含有缬氨酸(FcYRina[Val-158]);而"低亲和性"Fc^RlIIa在该位置含有苯丙氨酸残基(FcyRina[Phe-158])。该不一致性似乎解释了由FcyRlIIa阳性免疫细胞所表现的对抗体显著不同的亲和性(Dall'Ozzo,S.等，Ca"cer&<蘑究/柳":4664-楊9(2004》。上述观察暗示FcYRIIIa在肿瘤细胞消除中至关重要的作用，并支持这样的观点，所述观点是对FcYRlIIa具有增加亲和性的单克隆抗体(mAbs)具有改善的生物学活性。提高对FcyRlIIa亲和性并从而提高单克隆抗体的效应子功能的一种途径是处理其碳水化合物部分(Umafla,P.等，A^f.Ab/ec/z.f/^^主^^^"术/77^:176-180(1999)，Shields,R丄.等，J！历o/.C/zem卩主激众学染,旬.277(30」:26733-26740(2002),Ferrara，C.等,所提交的)。在2个C结构域中Asn-297处Fc的N-糖基化对其与所有FcyRs的亲和性(Tao，M.H.&Morrison,S丄.，乂/mm""o《^资学染,吝乂./W(^」:2595陽2601(1989),Mimura,Y"等，7!历o/.C72emr主欽众学染,志」.276~9力45539-45547(2001)以及引起适当的效应子功會g(Wright，A.&Morrison,S丄.，《/Md〔度学_^,吉免诏^7朋(3」:1087-1096(1994),Sarmay,G.等，Mo/./mww"o/.(^i^"分f学」"(5」:633-639(1992))至关重要。它包含可变添加岩藻糖和外臂糖的保守五糖结构(Jefferis,R.等，/mm""o/.i^吖免疫学祭遂)/":59-76(1998))。mAbs的N-糖基化模式是通过利用引起天然存在碳水化合物的酶活性改造生产细胞系的糖基化途径进行操作的。由此得到的糖基化改造的(GE)抗体的特征为高比例的等分的非岩藻糖基化寡糖，对FcYRlIIa具有提高的亲和性以及增加的ADCC(Umana,P.等，A^.历o&c/7.f^然生激拔术J〃卩」:176画180(1999)，Ferrara，C.等，所提交的)。利用不能向N-连接的寡糖添加岩藻糖残基的生产细胞系发现了相似的结果(S隨ay，G.等，Mo/./mmw"o/^^"分子学,"":633-639(1992)。与IgGFc的情况相反，几乎没有获得有关FcYRHIa糖基化对受体活性影响的信息。非糖基化FcYREI在其与hIgGl的Fc片段的复合体中的晶体结构显示推测的可能连接在Asn-162处的FcryRlII的碳水化合物部分会指向Fc片段中的中空腔(Shields,R丄.等，所o/.OzemY仝笏化学染,旬277(30力26733-26740(2002))，而连接于IgG-Asn-297的刚性核心多糖也位于此处(Huber，R.等，Atowef^熬〕26"55S5;:415-420(1976))。这种安排提示了两种蛋白质的碳水化合物部分在复合体形成上的可能途径。为了剖析IgGl和可溶性人(sh)FcyRlIIa间在分子水平上的相互关系，对shFcyRlIIa变体与不同抗体糖变体的结合，通过表面等离振子共振(SPR)和在细胞系统中进行了评价。发明概述在一个实施方案中，本发明涉及含有Fc区域的糖基改造(glycoengineer)的抗原结合分子，其中所述Fc区域作为所述糖基改造的结果，具有改变的寡糖结构，并具有至少一个氨基酸修饰，且其中所述抗原结合分子，与缺乏所述修饰的抗原结合分子相比，表现出对人FcyRffl受体增加的结合。在一个优选的实施方案中，该糖基改造的抗原结合分子对人FcYRlI受体，如FqRlIa受体或FcyRlIb受体不表现出增加的结合。优选地，FcyRIII受体是糖基化的，从而使其在Asnl62处含有N-连接的寡糖。在一个实施方案中，该FcYRin受体是FcYRlIIa。在另一个实施方案中，FcyRIII受体是FcYRlIIb。在某些实施方案中，FcYRlIIa受体在位置158处含有缬氨酸残基。在其它的实施方案中，FcYRlIIa受体在位置158处含有苯丙氨酸残基。在一个优选的实施方案中，本发明糖基改造的抗原结合分子含有这样的修饰，该修饰与缺乏所述修饰的抗原结合分子相比，基本上不增加对非糖基化FcYRlII受体的结合。在一个实施方案中，本发明糖基改造的抗原结合分子包含在一个或多个氨基酸239，241,243，260，262，263，264，265,268，290，292，293,294,295,296,297,298,299,300，301，302，或303中的替换。在一些实施方案中，该糖基改造的抗原结合分子包含2个或更多个列于表2和4中的替换。在一些实施方案中，该糖基改造的抗原结合分子包含2个或更多个列于表5中的替换。本发明还涉及含有一个或多个替换的糖基改造的抗原结合分子，该替换是以与连接于FcyRIII受体的Asnl62处的碳水化合物相互作用的氨基酸残基替代天然存在的氨基酸残基。优选地，与连接于FcyRIII受体的Asnl62处的碳水化合物相互作用的氨基酸残基选自由下列各项组成的组Trp，His,Tyr,Glu,Arg,Asp,Phe,Asn,和Gln。在一个优选的实施方案中，该糖基改造的抗原结合分子含有选自由下列各项组成的组中的替换Ser239Asp,Ser239Glu,Ser239Trp，Phe243His，Phe243Glu,Thr260His,His268Asp,His268Glu。备选地或另外地，根据本发明的糖基改造的抗原结合分子可含有一个或多个列于表2或4中的替换。在一个优选的实施方案中，本发明的糖基改造的抗原结合分子与缺乏所述修饰的相同抗原结合分子相比，以至少增加了10%的亲和性，至少增加了20%的亲和性，至少增加了30%的亲和性，至少增加了40%的亲和性，至少增加了50%的亲和性，至少增加了60%的亲和性，至少增加了70%的亲和性，至少增加了80%的亲和性，至少增加了卯％的亲和性，或至少增加了100%的亲和性与FcYRIII受体结合。本发明的糖基改造的抗原结合分子优选地含有人IgGFc区域。在一个实施方案中，该抗原结合分子是含有Fc区域的抗体或抗体片段。在一个优选的实施方案中，该抗体或抗体片段是嵌合的或人源化的。在某些实施方案中，根据本发明的糖基改造的抗原结合分子表现出增加的效应子功能。优选地，该增加的效应子功能是增加的抗体依赖性细胞毒性或增加的补体依赖性细胞毒性。本发明的糖基改造的抗原结合分子中的改变的寡糖结构优选地包含与非糖基改造的抗原结合分子相比减少数量的岩藻糖残基。在一个优选的实施方案中，Fc区域中至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%或更多的寡糖是非岩藻糖基化的。本发明的糖基改造的抗原结合分子中的改变的寡糖结构，与非糖基改造的抗原结合分子相比，还可包含增多数量的等分的寡糖。该等分的寡糖可为杂合类型或复合类型。本发明还包括糖基改造的抗原结合分子，其中所述改变的寡糖结构，与非糖基改造的抗原结合分子相比，具有GlcNAc残基和岩藻糖残基比例的增加。在一个优选的实施方案中，本发明的糖基改造的抗原结合分子选择性地与抗原结合，该抗原选自由下列各项组成的组人CD20抗原，人EGFR抗原，人MCSP抗原，人MUC-1抗原，人CEA抗原，人HER2抗原，和人TAG-72抗原。本发明还涉及含有Fc区域的糖基改造的抗原结合分子，其中所述Fc区域作为所述糖基改造的结果，具有改变的寡糖结构，并具有至少一个氨基酸修饰，且其中所述抗原结合分子，与缺乏所述修饰的抗原结合分子相比，表现出对人FcYRffl受体增加的特异性。优选地，本发明糖基改造的抗原结合分子对人Fc，n受体，如人FcyRlIa受体或人FcyRlIb受体不表现出增加的特异性。优选地，FcyRIII受体是糖基化的(即，它在Asnl62处含有N-连接寡糖)。在一个实施方案中，该FcyRIII受体是FcyRlIIa。在一个备选实施方案中，FcyRIII受体是FcYREIb。在某些实施方案中，FcYRlIIa受体在位置158处含有缬氨酸残基。在其它实施方案中，FcYRlIIa受体在位置158处含有苯丙氨酸残基。在一个优选的实施方案中，抗原结合分子的氨基酸修饰，与缺乏该修饰的抗原结合分子相比，基本不增加对非糖基化FcYRlII受体的特异性。在一个特别优选的实施方案中，该修饰包含在一个或多个氨基酸位置239,241,243,260，262,263，264，265,268，290,292,293,294，295，296，297，298,299,300,301,302,或303中的氨基酸替换。在优选的实施方案中，该替换以与连接于FcYRlII受体的Asnl62处的碳水化合物相互作用的氨基酸残基替代天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，与连接于FcYRIII受体的Asnl62处的碳水化合物相互作用的氨基酸残基选自由下列各项组成的组Trp,His,Tyr，Glu，Arg,Asp,Phe,Asn，和Gln。在一个实施方案中，替换选自由下列各项组成的组Ser239Asp，Ser239Glu,Ser239Trp，Phe243His，Phe243Glu,Thr260His，His268Asp,His268Glu。根据本发明的糖基改造的抗原结合分子还可含有一个或多个列于表2或5中的替换。在一个优选的实施方案中，本发明包含糖基改造的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子，与缺乏所述修饰的相同抗原结合分子相比，以至少增加了10%的特异性，至少增加了20%的特异性，至少增加了30%的特异性，至少增加了40%的特异性，至少增加了50%的特异性，至少增加了60%的特异性，至少增加了70%的特异性，至少增加了80%的特异性，至少增加了90%的特异性，或至少增加了100%或更高的特异性与FcyRIII受体结合。优选地，本发明表现出增加特异性的糖基改造的抗原结合分子含有人IgGFc区域。在另一个优选实施方案中，该抗原结合分子是含有Fc区域的抗体或抗体片段。在一个特别优选的实施方案中，该抗体或抗体片段是嵌合的或人源化的。根据本发明的糖基改造的抗原结合分子优选地表现出增加的效应子功能例如，增加的抗体依赖性细胞毒性或增加的补体依赖性细胞毒性。该改变的寡糖结构与非糖基改造的抗原结合分子相比，可包含减少数量的岩藻糖残基。例如，本发明包含糖基改造的抗原结合分子，其中Fc区域中至少20%,至少30%,至少40%,至少50%，至少60%，至少70%,至少80%,至少卯％或更多的寡糖是非岩藻糖基化的。在另一个实施方案中，该改变的寡糖结构，与非糖基改造的抗原结合分子相比，可包含增加数量的等分的寡糖。该等分的寡糖可为杂合类型或复合类型。在一个实施方案中，该改变的寡糖结构，与非糖基改造的抗原结合分子相比，具有GlcNAc残基和岩藻糖残基比例的增加。在一个优选的实施方案中，根据本发明的糖基改造的抗原结合分子选择性地与抗原结合，该抗原选自由下列各项组成的组人CD20抗原，人EGFR抗原，人MCSP抗原，人MUC-1抗原，人CEA抗原，人HER2抗原，和人TAG-72抗原。本发明还涉及编码含有抗体Fc区域或抗体Fc区域片段的多肽的多核苷酸，其中所述Fc区域或其片段含有至少一个氨基酸修饰，且其中所述多肽，与缺乏所述修饰的相同多肽相比，表现出对人FcyRin受体增加的结合。本发明还涉及由该多核苷酸编码的多肽。该多肽可为抗体重链。该多肽还可为融合蛋白。本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及一种用于生产包含Fc区域的糖基改造的抗原结合分子的方法，其中所述Fc区域作为所述糖基改造的结果，具有改变的寡糖结构，并具有至少一个氨基酸修饰，且其中所述抗原结合分子，与缺乏所述修饰的抗原结合分子相比，表现出对人FcryRIII受体增加的结合。所述方法包括(i)在容许所述多核苷酸表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(ii)从该培养基中回收所述糖基改造的抗原结合分子。本发明还涉及一种用于生产包含Fc区域的糖基改造的抗原结合分子的方法，其中所述Fc区域作为所述糖基改造的结果，具有改变的寡糖结构，并具有至少一个氨基酸修饰，且其中所述抗原结合分子，与缺乏所述修饰的抗原结合分子相比，表现出对人FcYRlII受体增加的选择性。所述方法包括(i)在容许所述多核苷酸表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(ii)从该培养基中回收所述糖基改造的抗原结合分子。附图简述图1(a-c)糖基改造的(GE)和天然的抗体的寡糖特征(a)与人IgGl-Fc的Asn297相关联的碳水化合物部分。以粗体表示的糖限定五糖核心；其他糖残基的添加是可变的。等分的ei，4-连接的GlcNAc残基由GnT-III引入。(b)由天然和GE抗体释放的中性寡糖的MALDI-MS光谱。m/z值对应于与钠相关联的寡糖离子。为证实碳水化合物类型，用只水解杂合而非复合多糖的内切糖苷酶H处理抗体。(c)用于本研究的IgG糖变体的寡糖分布。Glyco-l指由GnT-m单独过表达生成的糖基改造的抗体变体。Glyco-2指由GnT-III和重组ManII共表达生成的糖基改造的抗体变体。图2(a-b)shFcYRlIIa[Val-158]或shFcyRina[Phe-158]与固定化IgGl糖变体的结合。结合状态(associationphase)由曲线上方的实线表示。(a)分别是shFcYRHIa[Val-158]和shFcYRlIIa[Phe-158]的结合事件传感图的叠加(overlay)。为了比较GE抗体在相似反应范围中的结合事件，将在浓度为800nM或6.4时的由天然抗体获得的传感图叠加。所有传感图都标准化为固定化水平。(b)shFc丫Rina[Val-158]或shFcYRlIIa[Phe-158]与Glyco-2结合的动力学分析。拟合曲线和残留误差(下方)由非线性曲线拟合获得。图3(a-c)IgG糖变体与hFcyRlIIa[Val-158/Gln-162]的结合。所有传感图都标准化为固定化水平。(a)shFcYRHIa[Val-158/Gln-162]的结合事件传感图的叠加。结合状态由曲线上方的实线表示。(b)shFcyyRlIIa[Val画158/Gln-162]或shFc丫Rina[Val-158]结合于WT或Glyco-2的结合事件传感图的叠加。(c)IgG与hFcYRlIIa[Val-158/Gln-162]和hFcYRlIIa[Vall58]表达的或未转染的Jurkat细胞的全细胞结合。FcYRlIIa的结合以任意单位给出。图4(a-b)糖基化的FqRlII与IgG的Fc片段间假定的相互作用。(a)FcYRlII在与天然IgG(PDBcodele4k)的Fc片段的复合体中的晶体结构显示于插图中。长方形表示上方所示的剪切部分。将Fc片段的2条链和未糖基化FcYRlII描绘为具有所示Asnl62和岩藻糖残基的表面。将连接于Fc的多糖表示为球形和棒形。与Fc片段链的碳水化合物连接的岩藻糖残基是造成假定的与FcYRlII碳水化合物的相互作用的空间位阻的原因。(b)糖基化的FcYRlII和GE-IgG(非岩藻糖基化的)Fc片段间相互作用的模型。由于该岩藻糖残基不出现在GE-IgG中，连接在受体的Asnl62的碳水化合物能与GE-IgG充分地相互作用。该图是利用程序PYMOL(www.deknoscientific.com)帝!j成的。发明详述术语如本领域中普遍使用的方式使用于本文中，除非另外定义如下。縮写Ig，免疫球蛋白；ADCC，抗体依赖性细胞毒性；CDC，补体依赖性细胞毒性；PBMC，外周血单核细胞；GE，糖基改造的；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺；Man,甘露糖；Gal，半乳糖；Fuc，岩藻糖；NeuAc，N-乙酰神经氨酸；GnT-III，N-乙酰葡糖胺转移酶III;k^，结合率常数；k^，解离率常数。用于本文时，术语贫錄意欲包括完整抗体分子，以及具有Fc区域并保留结合特异性及至少一种效应子功能，例如，ADCC的抗体片段，和包括功能上等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域并保留结合特异性及至少一种效应子功能的融合蛋白，所述完整抗体分子包括单克隆抗体，多克隆抗体和多特异性(例如，二特异性)的抗体。还包括嵌合的和人源化的抗体，以及骆驼化(camelized)和灵长类化(primatized)抗体。用于本文时，术语Fc^"凝意欲指人IgG重链的C-末端区域。尽管IgG重链的Fc区域的边界可以轻微变化，人IgG重链的Fc区域通常定义为从位于Cys226的氨基酸残基延伸到羧基末端的一段序列。用于本文时，术语等份f,iS^^歪^游Fc^"^^游^^凝意欲包括免疫球蛋白的Fc区域的天然存在的等位基因变体以及具有改变的变体，所述改变产生替换，添加，或缺失，但是基本不会减少免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性的细胞的细胞毒性)的能力。例如，在免疫球蛋白的Fc区域的N-末端或C末端可以缺失一个或多个氨基酸，而基本不丧失生物学功能。可以按照本领域已知的一般规则来选择这些变体从而对活性具有最小的影响。(见，例如Bowie，J.U.等Sdoice^斗学)247:1306"10(19卯)。用于本文时，术语教^^"/^合分f或在其最广泛的意义上指特异性结合于抗原决定子的分子。优选地，该ABM是抗体；然而，本发明还包括单链抗体，单链Fv分子，Fab片段，双抗体，三联抗体，四联抗体，等等。当利用淳#丝碧^或W/^^錄弄丝游/^^来形容本发明的抗原结合分子时是指该结合对于抗原是选择性的并且可以与不需要的或非特异性相互作用区别开。用于本文时，术语"融合"和"嵌合"，当关于多肽如ABM使用时，指这样的多肽，所述多肽包括来自两个或更多异源多肽的氨基酸序列，诸如来自不同物种的抗体的部分。例如，对于嵌合ABMs而言，非抗原结合成分可以来自广泛种类的物种，包括灵长类动物诸如黑猩猩和人。最优选嵌合ABM的恒定区与天然人抗体的恒定区基本相同；最优选嵌合抗体的可变区与重组抗体的可变区基本相同，所述抗体具有鼠可变区的氨基酸序列。人源化的抗体是融合或嵌合抗体的特别优选的形式。用于本文时，具有例如活丝"的多肽指这样的多肽，所述多肽能够催化以卩-1-4连接将N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加到N-连接的寡糖中的三甘露糖基核心的P-连接的甘露糖苷上。这包括融合多肽，所述多肽显示类似于但不必须相同于P(l,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的酶活性。按照国际生化和分子生物学命名委员会(NC-IUBMB)，其也被称为p-l,4-甘露糖基-糖蛋白4-e-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC2.4丄144)，且通过存在或不存在剂量依赖性的特殊生物测定来测量。在其中确实存在剂量依赖性的情形中，其不需要与GnT-III的剂量依赖性相同，但是与GnT-III活性相比，基本类似于在给定活性中的剂量依赖(即，相对于GnT-III，候选多肽将显示更大的活性或不超过约25倍更少，并且优选地，不超过约10倍更少的活性，并且最优选地，不超过约三倍更少的活性)。用于本文时，术语"变体(或类似物)"指通过使用，例如重组DNA技术产生的氨基酸插入，缺失，和替换而与本发明特别陈述的多肽区别开的多肽。本发明的ABMs的变体包括嵌合的，灵长类化或人源化的抗原结合分子，其中氨基酸残基的一个或数个通过以这样的方式替换，添加和/或缺失进行修饰，所述方式基本上不影响抗原结合亲和性或抗体效应子功能。可以通过将特定多肽的序列与同源肽的序列进行比较并使在高同源性的区域(保守区域)中所作的氨基酸序列变化的数量最少化，或通过用共有序列来替代氨基酸来发现确定哪个氨基酸残基可以被替换，添加，或缺失而不会破坏目标活性的指导。或者，编码这些相同或类似多肽的重组变体可以通过使用在遗传密码中的"丰余性"来合成或选择。各种密码子替换，诸如产生各种限制性位点的沉默改变可以被引入从而优化克隆到质粒或病毒载体中，或在特定原核或真核系统中的表达。在多核苷酸序列中的突变可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的结构域中从而修饰多肽的任何部分的特性，从而改变特性诸如配体结合亲和性，链间亲和性，或降解/更新率。优选地，氨基酸"替换"是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换一个氨基酸的结果，即保守性氨基酸替换。"保守性"氨基酸替换可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。"插入"或"缺失"优选地在约l到约20个氨基酸的范围内，更优选在约1_约IO个氨基酸范围内。容许的变化可以使用重组DNA技术系统性在多肽分子中迸行氨基酸插入，缺失或替换，和通过测定得到的重组变体的活性，来实验性地进行确定。用于本文时，术语"人源化"用于指来自非人抗原结合分子的抗原结合分子(ABM)，例如，鼠抗体，其保持或基本保持母体分子的抗原结合特性，但是在人中具有更少的免疫原性。这可以通过多种方法来实现，所述方法包括(a)仅将非人互补决定区(CDRs)移植到人构架和恒定区上，保留或不保留关键的构架残基(例如，对于保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能是重要的那些)，或(b)移植整个非人的可变结构域，但是通过表面残基的替换用人样片段来"遮蔽"它们。这些方法公开于Jones等，油/""^t)32/:6069,522-525(1986);Morrison等，7V^/.5W"f^r;^#学腐会f必81:6851-6855(1984);Morrion和Oi，A/v.//ww"o/"(免疫学进展)44:65-92(1988);Verhoeyen等，Science,(科学)239:1534-1536(1988);Padlan,Mo/ec./mww".,(免疫分子学)28:489-498(1991);Padlan,Mo/ec./mmw""(免疫分子学)31(3):169-217(1994)，将它们全部并入本文作为参考。在抗体的每一个重链和轻链可变结构域中通常存在3个CDRs(CDR1,CDR2禾PCDR3)，它们侧邻四个构架亚区域(即，FR1,FR2，FR3，和FR4):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗体的讨论可以，见于特别是美国专利号6,632,927,和公开的美国申请号2003/0175269中，将它们两者全文并入本文作为参考。类似地，用于本文时，术语"灵长类化"用于指来自非灵长类动物抗原结合分子的抗原结合分子，例如，鼠抗体，其保留或基本保留母体分子的抗原结合性质，但是在灵长类动物中具有更少的免疫原性。在本领域使用和/或接受的术语存在两个或多个定义的情形中，用于本文时的术语的定义倾向于包括所有的这些含义，除非明确地以相反的意思指出。具体的实例是使用术语"互补决定区"("CDR")来描述在重链和轻链多肽的可变区中发现的非连续抗原结合位点。这一特定区域已经在Kabat等，美国健康与人类服务部(U.S.Dept.ofHealthandHumanServices),"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"(免疫性靶标的蛋白质的序歹U)(1983)和Chothia等，/Mo/.说o/.(分子生物学杂志)196:901-917(1987)中进行了描述，将它们并入本文作为参考，其中当针对彼此比较时，所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，将任一定义用于指抗体或其变体的CDR的应用倾向于在本文所限定和使用的术语的范围内。涵盖如上面引用的参考文献的每个所定义的CDRS的适合的氨基酸残基在下面的表1中提出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。假定己知抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定的CDR。表lCDR定义KabatChothiaAbMVHCDR131-3526-3226-35VHCDR250-6552-5850-58VHCDR395-10295-10295-102VLCDR124-34VLCDR250-56VLCDR389-97i表l中的所有的CDR定义的编号是按照Kabat等(见下)的编号方式进行的。Kabat等还定义了用于可变结构域序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域普通技术人员可以明确地将这种"Kabat编号"系统用于任何可变结构域序列，而不依赖于超出序列本身之上的任何实验数据。用于本文时，"Kabat编号"指由Kabat等，美国健康与人类服务部"SequenceofProteinsofImmunologicalInterest(免疫性靶标的蛋白质的序列)"(1983)提出的编号系统(将其全文并入本文作为参考)。任何序列表的序列(S卩，SEQIDNO:l到SEQIDNO:2)不是按照Kabat编号系统进行编号的。不过，如上所述，本领域技术人员完全能够基于其中所给出的序列编号来确定序列列表中任何可变区序列的Kabat编号方案。至于具有与本发明的参比核苷酸序列至少，例如95%"相同的"，或存在95%"同一性"的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指多核苷酸的核苷酸序列与参比序列相同，除了多核苷酸序列可以包括参比核苷酸序列的每100个核苷酸中多到5个的点突变。换言之，为了获得具有与参比核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，在参比序列中多到5%的核苷酸可以缺失或被另一个核苷酸所替换，或在参比序列中多到总核苷酸数目5%的核苷酸可以插入参比序列中。作为实践的问题，可以使用已知的计算机程序来常规确定是否任何特定的核酸分子或多肽与本发明的核苷酸序列或多肽序列至少80%,85%,90%，95%，96%,97%,98%或99%的相同。确定在查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳全面匹配的优选方法，也被称为全域序列比对，可以使用基于Bmtlag等，Comp.^;p.5zVwc/.f生激游学潔奪厥录J6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中，查询序列和目标序列都是DNA序列。RNA序列可以通过将U's转化为T's进行比较。所述全域序列比对的结果以百分比同一性表示。用在DNA序列的FASTDB比对中计算百分比同一性的优选参数是矩阵=单式，k-字长二4，不匹配罚分=1，合并罚分(JoiningPenalty)=30，随机组长-0，截断值评分=1，空隙罚分=5，空隙大小罚分=0.05，窗口大小=500或目标核苷酸序列的长度，无论哪一个更短。如果目标序列比査询序列更短是因为5'或3'缺失，而不是因为内部缺失，必须对结果进行手工校正。这是因为当计算百分比同一性时，该FASTDB程序并不说明目标序列的5'和3'截短。对于相对于査询序列，在5'或3'末端被截短的目标序列，通过将不匹配/比对的在目标序列的5'和3'的查询序列的碱基的数量计算为查询序列的总碱基百分比来对百分比同一性进行校正。通过FASTDB序列排列的结果来确定是否核苷酸匹配/比对。接着，将该百分比从使用指定参数通过上述FASTDB程序进行计算的百分比同一性中减去来达到最终的百分比同一性评分。这种校正评分用于本发明的目的。如通过FASTDB比对展示，仅有不与査询序列匹配/比对的，在目标序列的5'和3'碱基外侧的碱基出于手工调整百分比同一性评分的目的进行计算。例如，将90个碱基的目标序列与100个碱基的査询序列进行比对来确定百分比同一性。该缺失发生在目标序列的5'末端，并且因此，FASTDB比对没有显示在5'末端首先的10个碱基的匹配/比对。这10个未配对碱基代表序列的10%(未匹配的在5'和3'末端碱基的数量/与查询序列的碱基总数)，因此将10%从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去。如果剩余的90个碱基完全匹配，最终的百分比同一性将是90%。在另一个实例中，将90个碱基的目标序列与100个碱基的査询序列进行比较。这次，缺失是内部缺失从而使在目标序列的5'或3'上不存在与查询序列不匹配/比对的碱基。在该情形中，通过FASTDB计算的百分比同一性没有进行手工校正。再一次，只对在不与查询序列匹配/比对的目标序列的5'和3'末端的碱基进行手工校正。出于本发明的目的，没有进行其它的手工校正。至于具有与本发明的査询氨基酸序列具有至少，例如95%"相同"的氨基酸序列的多肽，意指目标多肽的氨基酸序列与查询序列相同，除了目标多肽序列可以在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括多到5个氨基酸改变。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽，在目标序列中多到5%的氨基酸残基可以被插入，缺失，或被另一个氨基酸替换。参比序列的这些改变可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位点，或在那些末端位点之间的任何地方，其单独散在参比序列的残基中或在参比序列的一个或多个连续组中。作为实践的问题，可以使用已知的计算机程序来常规确定是否任何特定的多肽与参比多肽至少80%，85%,90%，95%，96%,97%，98%或99%的相同。确定在查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳全面匹配的优选方法，也被称为全域序列比对，可以使用基于Brutlag等，Comp.j;^.f主欽矜学编蓉厥录J6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中，査询序列和目标序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全域序列比对的结果以百分比同一性表示。用在FASTDB氨基酸比对中的优选参数是矩阵-PAM0，k字长=2,不匹配罚分=1，合并罚分(JoiningPenalty)=20，随机组长=0，截断值评分=1，窗口大小=序列长度，空隙罚分-5，空隙大小罚分=0.05，窗口大小=500或目标氨基酸序列的长度，无论哪一个更短。如果目标序列比查询序列更短是因为N端或C端缺失，而不是因为内部缺失，必须对结果进行手工校正。这是因为当计算全域百分比同一性时，该FASTDB程序并不说明目标序列的N端和C端截短。对于相对于查询序列，在N端和C端被截短的目标序列，通过将与相应的目标残基不匹配/比对的在目标序列的N端和C端的査询序列的残基的数量计算为查询序列的总碱基百分比来对百分比同一性进行校正。通过FASTDB序列比对的结果来确定是否残基是匹配/比对的。接着，将该百分比从使用指定参数通过上述FASTDB程序进行计算的百分比同一性中减去来达到最终的百分比同一性评分。这种最终百分比同一性评分用于本发明的目的。出于手工调整百分比同一性评分的目的，仅考虑不与查询序列匹配/比对的，在目标序列的N端和C端的残基。即，仅是在目标序列的最远N和C端残基外侧的查询残基位点。例如，将90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的査询序列进行比对来确定百分比同一性。该缺失发生在目标序列的N端，并且因此，FASTDB比对没有显示在N端前10个残基的匹配/比对。这10个未配对残基代表序列的10X(未匹配的在N端和C端残基的数量/查询序列的残基总数)，因此将10%从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去。如果剩余的90个残基完全匹配，最终的百分比同一性将是90%。在另一个实例中，将90个残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比较。这次，缺失是内部缺失从而使在目标序列的N端或C端上不存在与查询序列不匹配/比对的残基。在该情形中，通过FASTDB计算的百分比同一性没有进行手工校正。再一次，如通过FASTDB比对所显示的，只对在不与查询序列匹配/比对的目标序列的N端和C端末端外侧的残基位点进行手工校正。出于本发明的目的，没有进行其它的手工校正。用于本文时，,严潜杀斧7^^^交于本发明的核酸序列的核酸指在这样的条件下进行杂交的多核苷酸，所述条件为在包括以下各项的溶液中于42'C进行过夜温育50%的甲酰胺，5xSSC(750mMNaCl,75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5xDenhardt's溶液，10%硫酸葡聚糖，和20pg/ml的变性、已剪切的鲑精DNA，随后于约65。C在0.1xSSC中洗涤滤器。用于本文时，术语葛^r基沐定泣^^繊旨负责将多肽锚定在高尔基复合体的位置中的高尔基体定居多肽的氨基酸序列。通常，定位结构域包括酶的氨基末端"尾"。用于本文时，术语^"应f劝,封旨可归因于抗体的Fc区域(天然序列Fc区域或氨基酸序列变体FC区域)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括，但不限于，Fc受体结合亲和性，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合体介导的抗原呈递细胞的抗原吸收，细胞表面受体的下调等。用于本文时，认为术语改遣，改造欽迸疗改造，蘑基改遣，籍基改造游，遂疗^^改造^//#:基众改^:包括天然存在或重组多肽，如抗原结合分子(ABM)或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基化改造包括细胞的糖基化作用的代谢改造，所述代谢改造包括对寡糖合成途径进行遗传操作从而获得改变的在细胞中表达的糖蛋白的糖基化。此外，糖基化改造包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化改造是糖基转移酶活性的改变。在特定的实施方案中，改造导致葡糖胺转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性的变化。用于本文时，术语德^主一智^^包括任何种类的细胞系统，能够对该细胞系统进行改造从而产生本发明的多肽和抗原结合分子。在一个实施方案中，对宿主细胞进行改造从而容许产生具有修饰的糖形的抗原结合分子。在一个优选的实施方案中，抗原结合分子是抗体，抗体片段，或融合蛋白。在某些实施方案中，对宿主细胞进一步操作从而使其表达增加水平的一种或多种具有GnT-III活性的多肽。在其它实施方案中，对宿主细胞进行改造从而具有消除的，减弱的或抑制的核心od,6-岩藻糖基转移酶活性。术语"核心cd,6-岩藻糖基转移酶活性"涵盖核心cd，6-岩藻糖基转移酶基因的表达以及核心cd，6-岩藻糖基转移酶与其底物的相互作用。宿主细胞包括培养的细胞，例如，哺乳动物培养细胞，诸如CHO细胞,BHK细胞,NSO细胞，SP2/0细胞，Y0骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞，和植物细胞，仅举几个例子，但是还包括被包含在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。用于本文时，术语;^^^^/Fc^"繊旨与自然界中普遍发现的Fc区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。示范的天然序列人Fc区域包括天然序列人IgGlFc区域(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区域；天然序列人IgG3Fc区域；和天然序列人IgG4Fc区域及其天然存在变体。意欲且不难从多种网站(例如，NCBI's网站)获得其他序列。术语Fc受#和用于描述与Fc区域功能等价体的Fc区域(例如，抗体或抗体片段的Fc区域)结合的受体。在本发明一些实施方案中特别意欲Fc受体的部分。在优选实施方案中，FcR是天然序列人FcR。在其他优选实施方案中，FcR是与IgG抗体结合的受体(Y受体)且包括FcyRl，FcyRII,和FcyRin亚类的受体，该亚类包括这些受体的等位变体和交错剪接形式。FcyRII受体包括FcYRIIa("激活受体")和FcYRnb("抑制受体")，它们具有相似的氨基酸序列，而它们的区别主要在其细胞质结构域中。激活受体FcYRlIa在其细胞质结构域中含有以免疫受体酪氨酸为基础的激活基序(ITAM)。抑制受体FcYRlIb在其细胞质结构域中含有以免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序(ITIM)。该术语还包括新生儿受体，FcRn，该受体负责母性IgG向胎儿的传输。本发明涵盖的一个Fc受体的实例是低亲和性免疫球蛋白YFc区域受体m-A前体(IgGFc受体III-2)(Fc-YRIII画a)(Fc-YRlIIa)(FcRlIIa)(Fc-YRIII)(FcRlII)(抗原CD16陽A)(FcR-lO)。[gi:119876]，其序列如下所示RTEDLPKAWFLEPQWYRYLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFSNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDFELRCHSWKNTAJLHKVTYLQNGKGRKYFHHSISDFYEPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSBTVNITTTQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFS"VKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK用于本文时，具有^^^^游FcR结合亲和性或效应子功能的多肽变体是与母体多肽或含有天然序列Fc区域的多肽相比，具有提高(即，增加)或降低(即，减少)的FcR结合活性和/或效应子功能的多肽变体。显示了与FcR;f》/7一替^的多肽变体以优于其母体多肽的亲和性与至少一种FcR结合。显示了与FcR^^##碧合的多肽变体以弱于其母体多肽的亲和性与至少一种FcR结合。这种显示了与FcR减弱结合的变体与FcR几乎不具有结合或结合测量不到，例如，与母体多肽相比，0-207。与FcR结合。与母体多肽相比，以增加的亲和性与FcR结合的多肽变体，是当多肽变体和母体多肽在结合测定中数量基本相同，且所有其他条件一致时，以高于母体抗体的结合亲和性与上述已确定的FcR中的任意一种或多种结合的多肽变体。例如，在确定FcR结合亲和性时，例如，在以FACS为基础的测定或SPR分析(Biacore)中,具有提高的FcR结合亲和性的多肽变体,与母体多肽相比，可表现出FcR结合亲和性从约1.10倍-约100倍(更典型地，约1.2倍-约50倍)的提高(即，增加)。用于本文时，竟—^^參f斜旨给定氨基酸序列中氨基酸序列的改变。示范的修饰包括，但不限于，氨基酸的替换、插入和/或缺失。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是替换(例如，在母体多肽的Fc区域中)。在特定位置的氨基酸修饰(例如，在Fc区域中)指特定残基的替换或缺失，或在与特定残基相邻处插入至少一个氨基酸残基。该插入可在该特定残基的N-末端或C-末端。术语"结合亲和性"指与每个Fc受体-Fc结合相互作用有关的平衡解离常数(以浓度单位表示)。结合亲合性直接涉及动力学解离率(offrate)(通常以时间的倒数为单位报道，例如秒.Sup.-l)除以动力学结合率(onrate)(通常以每单位时间浓度单位报道，例如摩尔/秒)的比率。通常不可能明确地指出平衡解离常数的变化是否是由于解离率、结合率或两者的不同引起的，除非实验确定这些参数中的每一个(例如，通过BIACORE(参见www,biacore.com)或SAPIDYNE测量)。用于本文时，术语Fc-分导游一智應毒丝包括抗体依赖性细胞毒性和由包含人Fc-区域的可溶性Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。这是一种导致"人免疫效应细胞"裂解"抗体耙向细胞"的免疫机制，其中人免疫^^^智_^是在它们的表面上显示Fc受体的白细胞群，通过所述Fc受体它们结合于抗体或Fc-融合蛋白的Fc-区域并且执行效应子功能。这样的群可以包括，但不限于，外周血单核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞。."抗体靶向细胞"是由本发明的ABMs(例如，抗体或Fc融合蛋白)结合的细胞。一般，抗体或Fc融合蛋白通过Fc区的蛋白部分N末端结合耙细胞。用于本文时，将术语^^》/7游尸c-,导^t智應游一银應奉丝定义为通过上述定义的Fc-介导的细胞的细胞毒性的机制，在围绕靶细胞的培养基中，以给定浓度的抗体，或给定浓度的Fc-融合蛋白，在给定时间内裂解的"抗体-靶向细胞"的数量的增加，和/或将其定义为通过Fc介导的细胞的细胞毒性的机制，在给定的时间内，获得给定数量的"抗体耙向细胞"的裂解所需要的在围绕耙细胞的培养基中抗体浓度，或Fc-融合蛋白的浓度的减少。Fc-介导的细胞的细胞毒性的增加涉及由相同的抗体，或Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性，所述抗体或Fc-融合蛋白使用本领域那些技术人员已知的相同的标准产生，纯化，配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生，若非不是由通过本文所述的方法进行了糖改造从而表达糖基转移酶GnT-ni的宿主细胞产生。所谓具有增加的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的抗体，意指如本文所定义的术语的抗体，所述抗体如通过本领域那些普通技术人员已知的任何适合方法所确定的具有增加的ADCC。一种被接受的体外ADCC测定如下1)该测定使用己知表达靶抗原的靶细胞，所述靶抗原由抗体的抗原结合区域所识别；2)该测定使用分离自随机选择的健康供体的血液的人外周血单核细胞(PBMCs)，来作为效应细胞；3)该测定按照下列方法进行i)使用标准的密度离心方法来分离PBMCs并将其以5x106细胞/ml悬浮在RPMI细胞培养基中；ii)通过标准的组织培养方法培养靶细胞，在生存力大于90%的指数生长阶段来收集细胞，在RPMI细胞培养基中将其进行洗涤，用100微居的"Cr将其进行标记，并用细胞培养基将其洗涤两次，并以105细胞/ml的密度将其重悬于细胞培养基中；iii)将100微升的上述最终耙细胞混悬液转移到96孔微量滴定板的每孔中；iv)将抗体从4000ng/ml至lj0.04ng/ml在细胞培养基中进行系列稀释，并将50微升的得到的抗体溶液加入96孔微量滴定板中的靶细胞，以三次重复测试各个抗体浓度，所述抗体浓度覆盖整个的上述范围的抗体浓度；v)对于最大释放(MR)对照，在包含标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的2%(V/V)的非离子去污剂(Nonidet,Sigma,StLouis)的水溶液，替换抗体溶液(上述的第iv点)；vi)对于自发释放(SR)对照而言，在包含标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的RPMI细胞培养基，替换抗体溶液(上述的第iv点);vii)接着将96孔微量滴定板以50xg离心1分钟并在4'C温育1小时；viii)将50微升的PBMC混悬液(上述第i点)加入每个孔中从而产生25:1的效应物靶细胞比率，并将板置于温箱中于37。C在5。/0CCb气氛下达4小时。ix)从每个孔中收集无细胞的上清液，并使用Y射线计数器来量化实验释放的放射性(ER);x)按照式(ER-MR)/(MR-SR)x100来计算每个抗体浓度的特定裂解的百分比，其中ER是对于该抗体浓度量化的平均放射性(见上述第k点)，MR是对于MR对照而言(见上面的第v点)量化的平均放射性(见上面的第ix点)，并且SR是对于SR对照而言(见上面的第vi点)量化的平均放射性(见上面的第bc点)；4)将"增加的ADCC"定义为在上述测试的抗体浓度范围内观察的特定裂解的最大百分比的增加，和/或在上面测试的抗体浓度范围内观察到的获得特定裂解的最大百分比的一半所需要的抗体的浓度的减少。在ADCC中的增加涉及这样的ADCC，其是在上述测定中测量的，由相同抗体介导的ADCC，所述抗体使用本领域那些技术人员已知的相同的标准产生，纯化，配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生，若非不是由被改造从而过表达GnT—III的宿主细胞所产生。变体Fc区域本发明提供包括具有修饰的Fc区域的抗原结合分子的多肽，编码该多肽的核酸序列(例如，载体)，生产具有修饰的Fc区域的多肽的方法，及其在治疗多种疾病和病症中应用的方法。优选地，本发明的修饰的Fc区域通过至少一个氨基酸修饰区别于非修饰母体Fc区域。该"母体"、"起始"或"非修饰"多肽优选地包括抗体Fc区域的至少一部分，并可利用本领域中存在的生产包含Fc区域或其部分的多肽的技术进行制备。在优选的实施方案中，该母体多肽是抗体。然而，该母体多肽可为包含Fc区域的至少一部分的任意其他多肽(例如，抗原结合分子)。在某些实施方案中，可产生修饰的FC区域(例如，根据本文公开的方法)，并能将其融合到选择的异源多肽上，如抗体可变的结构域或受体或配体的结合结构域。在优选的实施方案中，本发明的多肽包括完整抗体，该完整抗体包括含有修饰的Fc区域的轻链和重链。在优选的实施方案中，该母体多肽包括FC区域或其功能部分。通常该母体多肽的Fc区域将包括天然序列Fc区域，且优选地包括人天然序列Fc区域。然而，该母体多肽的Fc区域可具有一个或多个来自天然序列Fc区域中的预先存在的氨基酸序列的改变或修饰。例如，该Fc区域的Clq结合活性可能曾经改变过，或该Fc区域的FcrR结合亲和性可能曾经改变过。在进一步的实施方案中，母体多肽Fc区域是概念上的(例如，智力思考或在计算机或在纸上的直观表现)，并且尽管其不实际存在，抗体工程技术人员可依据所要求的修饰的Fc区域氨基酸序列决定并生产这样的多肽，所述多肽包含该序列或编码所要求的修饰的Fc区域氨基酸序列的DNA。然而，在优选的实施方案中，可获得编码母体多肽的Fc区域的核酸(例如，商业上)，且改变该核酸序列，从而产生编码修饰的Fc区域的变体核酸序列。可通过本领域中已知方法，利用目前对特定序列详述的指导制备编码包含修饰的Fc区域的多肽的多核苷酸。这些方法包括，但不限于，通过位点定向(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和对编码该多肽的早期制备的核酸的盒式诱变进行制备。位点定向诱变是制备替换变体的优选方法。该技术在本领域中众所周知(参见，例如Carter等M/c/e/d/^yi^「凝麼研豫"4431-4443(1985)和Kunkela/.，尸亂胸/.爿cad5W.园凍^^^W学^7^S2:488(1987)，将二者都并入本文作为参考)。简要地，在进行DNA位点定向诱变中，该起始DNA是通过首先将编码所要求突变的寡核苷酸杂交到该起始DNA的一条单链上来改变的。杂交后，利用该杂交的寡核苷酸作为引物和该起始DNA的单链作为模板，使用DNA聚合酶合成完整的第二条链。从而，将编码所要求突变的寡核苷酸掺入得到的双链DNA中。PCR诱变也适合用于制备该非修饰起始多肽的氨基酸序列变体(参见，例如，Vallette等，M/c.仏4贫糜研^577:723-733(1989),特此^^在本文作为参考)。简要地，当少獻嫩DNA作为趟^imPCR中使用时，与模板DNA相应区域序列稍有不同的引物能用于产生相当大量的特定DNA片段，该片段仅在引物不同于模板的位置与模板序列不同。另一种制备变体的方法，盒式诱变，基于由Wells等，Ge"ef"基^)3么315-323(1985)所描述的技术，特此将其并入作为参考。该起始物质是包含待修饰的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。鉴定了待突变的起始DNA中的密码子。在鉴定的突变位点的每一侧必然存在一个独特的限制性核酸内切酶位点。如果没有这样的限制性位点存在，可利用上述寡核苷酸介导的诱变方法将它们引入该起始多肽DNA中合适位置来生产它们。在这些位点切割该质粒DNA,使其线性化。利用标准程序合成编码限制性位点之间的DNA序列但包含所要求突变的双链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的两条链是利用标准技术分别合成后再杂交在一起的。该双链寡核苷酸被称为盒。将该盒设计为具有与线性化质粒的末端相容的5'和3'末端，这使其能够直接与质粒连接。该质粒现在包含所述突变DNA序列。备选地，或另外地，能够确定所要求的编码多肽变体的氨基酸序列，且能够合成性产生编码该氨基酸序列变体的核酸序列。可对母体多肽的氨基酸序列进行修饰以产生变体Fc区域，所述变体Fc区域具有体外和/或体内的改变的Fc受体结合亲和性或活性和/或一种或多种改变的效应子功能，如体外和/或体内的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。还可对该母体多肽氨基酸序列进行修饰以产生具有改变的补体结合性质和/或循环半衰期的修饰的Fc区域。可通过选择替换来实现对Fc区域的生物特性的基本的修饰，其中的替换在对维持下列各项的作用上显著不同(a)该替换区域内多肽主链结构，例如，作为片状或螺旋状构象，(b)靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。将天然存在的残基基于共同的侧链特性进行分类(1)疏水性的正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile;(2)中性亲水性的cys，ser，thr;(3)酸性的asp，glu;(4)碱性的asn，gln，his,lys，arg;(5)影响链取向的残基gly,pro;和(6)芳香族的trp,tyr,phe。非保守替换需要这些种类中一类中的一个成员与另一类中的一个成员的交换。保守替换需要这些种类中一类中的一个成员与同一类中的另一个成员间的交换。能够改造Fc区域以产生具有对一个或多个FcRs的改变的结合亲和性的变体。可以，例如，修饰该Fc区域的一个或多个氨基酸残基，从而改变(例如，增加或减少)其与FcR的结合。在优选的实施方案中，该修饰包括本文所确定的一个或多个Fc区域残基(参见，例如表2)。通常，会在本文确定影响FcR的结合的一个或多个Fc区域残基处进行氨基酸替换，从而产生这样的Fc区域变体。在优选的实施方案中，不超过一到约十个Fc区域残基会发生缺失或替换。本文中包含一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的Fc区域将优选地保持至少大约80%，和优选地至少大约90%,和最优选地至少大约95%的母体Fc区域序列或天然序列人Fc区域。还可制备氨基酸插入修饰的Fc区域，该变体具有改变的效应子功能。例如，可在邻近一个或多个本文所确定影响FcR结合的Fc区域位置处引入至少一个氨基酸残基(例如，一到两个氨基酸残基，且通常不超过10个残基)。邻近指在本文所确定的Fc区域残基的一到两个氨基酸残基内。这样的Fc区域变体可表现出增加的或减低的FcR结合和/或效应子功能。为了产生这样的插入变体，可评估多肽的共晶体结构，从而合理地设计表现，例如提高的FcR结合能力的，修饰的Fc区域，所述多肽包含FcR结合区域(例如，目标FcR的细胞外结构域)和将氨基酸残基插入其中的Fc区域(参见，例如，Sondermann等M6:267(2000);Deisenhofer，伤oc/2em&^f主欽众学;^0(P力2361-2370(1981);和Burmeister等，Atow^^熬〕3"2:379-383,(1994)，将其全部并入本文作为参考)。通过在母体Fc区域中引入适合的氨基酸序列修饰，能够产生变体Fc区域，该Fc区域(a)在人效应细胞存在下，或多或少有效地介导一种或多种效应子功能，和/或(b)与母体多肽相比，以更好的亲和性与F(7受体(FcyR)或Fc新生儿受体(FcRn)结合。这些修饰的Fc区域通常会包含Fc区域中的至少一个氨基酸修饰。在优选的实施方案中，母体多肽Fc区域是人Fc区域，例如，天然人IgGl(A和非A同种异型)，IgG2，IgG3,或IgG4Fc区域，包括所有已知的或已发现的同种异型。这些区域具有如在SEQIDNOS:1-2中显示的序列。在某些实施方案中，该母体多肽Fc区域是非人Fc区域。非人Fc区域包括来源于非人种类，如但不限于，马、猪、牛、鼠、犬、猫、非人灵长类和鸟类受试者的Fc区域，例如，天然非人IgGFe区域，包括所有的已知或发现的亚类和同种异型。在某些实施方案中，为了产生具有提高的效应子功能(例如，ADCC)的修饰的Fc区域，母体多肽优选地具有预先存在的ADCC活性(例如，母体多肽包含人IgGl或人IgG3Fc区域)。在一些实施方案中，具有提高的ADCC的修饰的Fc区域比具有天然序列IgGl或IgG3Fc区域的抗体实质上更有效地介导ADCC。在优选的实施方案中，将一个或多个氨基酸修饰引入到母体Fc区域的CH2结构域，从而产生具有改变的Fcy受体(FcyR)结合亲和性或活性的修饰的IgGFc区域。在某些实施方案中，引入到母体Fc区域的CH2结构域中的一个或多个氨基酸修饰发生在如表2所示的那些位置。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>His268Asn,His268L叫His268Ala,扭s268Gly,His268CysHis268MetjHis268Val，His268Phe,His268Tyr，His268Lys,His268Pro，His268Ser,扭s268Thr，Lys290Lys290Trp,Lys290Arg，Lys290Asn,Lys290Leu,Lys290Ala，Lys290Gly,Lys290CysLys2卯Glu,Lys290Asp，Lys2卯MetjLys2卯Phe,Lys290ffis，Lys2卯Ser,Lys290Ile,Lys2卯Gln,Lys2卯Val，Lys290Tyr,Lys290Pro，Lys290Thr,Arg292Arg292Trp,Arg292Asn，Arg292Leu,Arg292Ala,Arg292Gly,Arg292CysArg292迈s,▲，n,aArg292Met，Arg292PhejArg292His,Arg292Ser,Arg292Glu，Arg292Gln，Arg292Val，Arg292Tyr,Arg292Pro，Arg292Thr,Glu293Glu293Trp,Ghi293Arg，Glu293Asn,Glu293Leu，Ghi293Ala,GIu293Gly，Glu293CysGla293His,Ghi293Asp，GIu293MetjGlu293Phe，Glu293His,Glu293Ser，GIu293DejGlu293Gln,Glu293Val，Glu293Tyr,Glu293Pro，GIu293Thr,Glu294Glu294Trp,Glu294Arg,Gln294Asn，Glu294Leu,Glu294AIa,Glu294Gly，Gk294CysGhi294ffis,GIu294Asp，Gltt294Me4Glu294PhejGlu294His,Glu294Ser，Glu294He，GIu294Gln，Glu294Val，GIu294Tyr,Glu294Pro，Glu294Thr,Gln295Gln295Trp，Gln295He，Gln295Asn,Gln295Leu,Gln295Ala，Gln295Gly,Gln295CysGln295His，Gta295Arg，Gln295Met^Gln295PhejGln295His，Gln295Ser,Gln295GIu，Gln295Asp，Gln295Val，Gln295Ty^，Gln295Pro，Gln295Thr,Tyr296Tyr296Trp,Tyr296De,Tyr296Gln，Tyr296Val，Tyr296Ala，Tyr296Gly,Tyr296CysTyr296His,TjT296Arg，T^t296Ash，T^r296Leu，Tyr296His，Tyr296Ser,Tyr296Glu,T^r296Asp，Tyr296MetjTyr296Phe,Tyr296Pro，Tyr296Thr，Asn297Asn297Trp，Asn297His,Asn297Glu，<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在某些实施方案中，引入到母体FC区域的CH2结构域中的一个或多个氨基酸修饰包括将现存残基替换为选自由下列各项组成的组的残基:Trp,His,Tyr，Glu，Arg,Asp,Phe,Asn,禾QGln。在某些实施方案中，将多于一个氨基酸修饰引入母体Fc区域的CH2结构域，从而通过组合列于表2中任意的单独修饰生成具有改变的FcYR结合亲和性或活性的修饰的IgGFc区域，从而使在一个位置的修饰能与位于不同位置的一个或多个另外的修饰组合，以产生2个或更多的母体Fc区域的修饰。在优选的实施方案中，将会对不超过一到约十个的Fc区域残基进行修饰。本文中包含一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的Fc区域将优选地保持至少大约80%，和优选地至少大约90%，和最优选地至少大约95%的母体Fc区域序列或人Fc区域的天然序列。在某些实施方案中，引入到母体Fc区域的CH2结构域中的一个或多个氨基酸修饰导致修饰的Fc区域与FcYRlIIa显著减弱的结合，例如，列于表3中的那些修饰。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在优选的实施方案中，引入到母体Fc区域的CH2结构域中的一个或多个氨基酸修饰导致这样的修饰的IgGFc区域，其对FcyRlIIa具有仅略微降低的、不变的或增加的亲和性，例如，那些列于表4中的修饰。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在某些实施方案中，将多于一个氨基酸修饰引入母体Fc区域的CH2结构域，从而通过组合列于表4中任意单独的修饰而生成具有改变的FcYR结合亲和性或活性的修饰的IgGFc区域，从而使在一个位置的修饰能与位于不同位置的一个或多个另外的修饰组合，以产生列于表5中的母体Fc区域的2个或更多、3个或更多或4个的修饰的任一种。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>在优选的实施方案中，引入到母体Fc区域的CH2结构域中的多于一个的氨基酸修饰涉及列于表5中的与Thr260His的任意的组合。可对本发明具有修饰的Fc区域的多肽进行一个或多个另外的修饰，这依赖于对该多肽所要求的或所意欲的用途。这些修饰可涉及，例如，氨基酸序列的进一步改变(氨基酸残基的替换、插入和/或缺失)，与异源多肽的融合和/或共价修饰。这些进一步的修饰可在如上公开的导致Fc受体结合和/或效应子功能改变的氨基酸修饰之前、同时或之后进行。备选地或另外地，氨基酸修饰与一个或多个改变Fc区域的Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性功能的另外的氨基酸修饰的组合是有用的。在这点上特别引起兴趣的起始多肽是与Clq结合且显示补体依赖性细胞毒性(CDC)的多肽。本文描述的氨基酸替换可用于改变该起始多肽结合Clq的能力和/或修饰其补体依赖性细胞毒性功能(例如，降低和优选地消除这些效应子功能)。然而，本文意欲这样的多肽，该多肽包含在一个或多个已述位置的替换且具有提高的Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)功能。例如，该起始多肽可能不能与Clq结合和/或介导CDC，且可根据本文所教导的内容对其进行修饰，从而使其获得这些另外的效应子功能。此外，可对具有预先存在的Clq结合活性，任选地还具有介导CDC能力的多肽进行修饰，从而增强这两种活性之一或全部。描述了改变Clq禾口/或修饰其补体依赖性细胞毒性功能的氨基酸修饰，例如，在WO00/42072中，特此将其并入本文作为参考。如上所公开，能够设计具有改变的效应子功能的Fc区域或其部分，例如，通过修饰Clq结合和/或FcR结合，以及由此改变CDC活性和/或ADCC活性。例如，能够产生具有提高的Clq结合和提高的FcyRin结合的修饰的Fc区域(例如，既具有提高的ADCC活性又具有提高的CDC活性)。或者，当要求降低或消除效应子功能时，可改造具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性的修饰的Fc区域。在其他实施方案中，可仅增加这些活性中的一种，并任选地也降低其他活性，例如，为产生具有提高的ADCC活性但降低的CDC活性的修饰的Fc区域且反之亦然。另一类型的氨基酸替换用于改变多肽的糖基化模式。这可以，例如，通过缺失一个或多个该多肽中存在的碳水化合物部分，和/或增加一个或多个该多肽中不存在的糖基化位点，来完成。多肽的糖基化典型地是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的连接。肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。因而，多肽中这些肽序列任意之一的存在造成潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺(N-aceylgalactosamine)、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，所述羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。在一些实施方案中，本发明提供这样的组合物，所述组合物包含具有Fc区域的母体多肽的修饰，其中该修饰的Fc区域包括至少一个表面残基氨基酸修饰(参见，例如，Deisenhofer,所oc/zem&^y(^^欽众学)20(9):2361-70(1981),和WO00/42072，特此将其二者都并入本文作为参考)。在其他实施方案中，本发明提供这样的组合物，其中所述组合物包含具有Fc区域的母体多肽的修饰，其中该修饰的Fc区域包括至少一个非表面残基氨基酸修饰。在其它的实施方案中，本发明包括具有Fc区域的母体多肽的变体，其中所述变体包括至少一个表面氨基酸修饰和至少一个非表面氨基酸修饰。对具有修饰的Fc区域的多肽的测定法本发明进一步提供筛选本发明中具有修饰的Fc区域的多肽的多种测定法。筛选测定法可用于发现或确定有用的修饰的Fc区域。例如，可筛选具有修饰的Fc区域的多肽，以发现具有增加的FcR结合或诸如ADCC或CDC活性的效应子功能(例如，增加的或降低的ADCC或CDC活性)的变体。此外，还可筛选具有非表面残基中的氨基酸修饰的修饰的多肽(例如，可筛选具有至少一个表面氨基酸修饰和一个非表面氨基酸修饰的修饰的Fc区域)。此外，如下文所描述的，本发明的测定法可用于发现或确定在受试者中具有有益治疗活性的修饰的Fc区域(例如，如有抗体或免疫黏附素反应性疾病症状的人)。不同的测定法类型可用于评估具有修饰的Fc区域的多肽与母体多肽相比的任何变化(参见，WO00/42072中提供的筛选测定法，将其并入本文作为参考)。进一步示范测定法如下所述。在优选的实施方案中，本发明具有修饰的Fc区域的多肽是抗原结合分子，所述抗原结合分子与非变体(母体)多肽相比基本保持结合抗原的能力(通过非修饰抗原结合区域或修饰抗原结合区域)(例如，结合能力优选地为不低于非变体多肽结合能力的约20倍或约5倍)。例如，可利用如荧光激活细胞分选术(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的技术来确定多肽变体与抗原的结合能力。为获得关于该结合事件更为详细的信息，可利用SPR进行生物相互作用分析。可进行Fc受体(FcR)结合测定，以评估本发明的具有修饰的Fc区域的多肽。例如，Fc受体，如FcyRl,FcYRlIa，FcyRlIb,FcyyRlII，FcRn等的结合能够通过滴定修饰的多肽并利用抗体测量结合的修饰的多肽变体来测量，其中该抗体在标准ELISA形式中与该多肽变体特异性结合。例如，包含本发明的修饰的Fc区域的抗原结合分子可在标准ELISA测定中进行筛选，从而确定与FcR的结合。可用抗原包被固体(solid)表面。洗去过量的抗原，且封闭表面。修饰的多肽(抗体)特异于该抗原，且因此与该抗原包被的表面结合。然后，可加入缀合于标记(例如生物素)的FcR，并洗涤表面。在随后的步骤中加入特异于FcR上标记的分子(例如，与酶缀合的抗生物素蛋白)。此后可加入底物以确定FcR与具有修饰的Fc区域的多肽结合的数量。能将该测定的结果与缺乏该修饰的母体多肽与相同FcR结合的能力作比较。在优选的实施方案中，所述FcR选自对IgG的FcYRnA，FcYRllB，和FcYRlIlA，这是由于这些受体(例如，重组地表达)可成功地进行筛选本发明的修饰的Fc区域。事实上，该具有这些优选的受体的结合测定法出乎意料地容许了对有用的修饰的Fc区域的鉴定。以这种方式鉴定有用的修饰多肽(例如，具有更好的FcR结合或效应子功能如ADCC或CDC)是没有预料到的。在其他优选的实施方案中，将进行ELISA(例如，用对IgG的FcyRIIA，FcyRllB，和FcYRlIlA)来筛选变体的组分包装在试剂盒中(例如，有使用说明书)。对这些测定法有用的效应细胞包括，但不限于，天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和其他外周血单核细胞(PBMC)。备选地，或另外地，具有本发明修饰的Fc区域的多肽的ADCC活性可在体内进行评估，例如，在动物模型中，如在Clynes等iW^S(T7&i^5:652-656(1998)中所公开的，将其并入本文作为参考)。可以评估修饰的多肽与Clq结合及介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。例如，为确定Clq的结合，可以进行Clq结合ELISA。一个示范的Clq结合测定如下。用本发明的修饰多肽或母体多肽(对照)在包被缓冲液中，4。C过夜包被测定皿。接着可以进行所述皿的清洗和封闭。清洗后，可将人CIq的等分试样加入到每个孔中，并在室温下温育2小时。再一次清洗后，可将100pl绵羊抗补体Clq过氧化物酶-缀合抗体加入到每个孔中，并在室温温育l小时。可再用清洗缓冲液清洗该皿，并可将100pl的含有OPD(邻苯二胺二盐酸盐(Sigma))的底物缓冲液加入到每个孔中。可容许通过黄颜色的出现而观察到的氧化反应进行优化的时间(2-60分钟)，并通过添加100^的4.5NH2S04结束该氧化反应。接着，可在492nm处读其吸光度，且将405nm处的背景吸光度从该值中减去。还可筛选本发明的修饰的Fc区域用于补体活化。为了评估补体的活化，可进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等，J/仿ww"o/.M"/zoAf^i^;^法^^萄，202:163(1996)，将其并入本文作为参考)。例如，可用缓冲液稀释不同浓度的本发明的修饰的多肽和人补体。可将表达与多肽变体结合的抗原的细胞稀释到密度为lxl(^个细胞/毫升。可将多肽变体、稀释的人补体和表达该抗原的细胞的混合物加入到平底组织培养96孔板中，并容许在37"C和5W的C02下温育2小时，以促进补体介导的细胞裂解。可再将的alamar蓝(AccumedInternational)加入到每个孔中，并在37'C过夜温育。可利用在530nm处激发，590nm处发射的96孔荧光计测量其吸光度。结果可用相对荧光单位(RFU)表示。样品浓度可通过标准曲线来计算，且能报告目标多肽变体与非变体多肽相比的百分比活性。在优选的实施方案中，修饰的多肽与母体多肽相比，对人Clq具有较高的结合亲和性。这样的变体可表现出，例如，与母体多肽相比，大约2倍或更多，且优选地大约5倍或更多的提高了人Clq的结合(例如，在对于这两种分子的IC50值)。例如，人Clq结合，与母体多肽相比，可提高约2倍到约500倍，且优选地从约2倍或从约5倍到约1000倍。在其他优选的实施方案中，发现变体与具有非修饰IgGlFc区域的对照(母体的)抗体相比，表现出2倍、25倍、50倍、100倍或1000倍的Clq结合的降低。在甚至更优选的实施方案中，修饰的Fc区域多肽不与Clq结合(例如，10吗/ml的修饰多肽与10吗/ml对照抗体相比，表现出约100倍或更多的Clq结合的降低)。在某些实施方案中，本发明的修饰的多肽不激活补体。例如，修饰的多肽在该测定中表现出与具有非修饰IgGlFc区域的对照抗体相比约0-10。/。的CDC活性。优选地，该变体在上述CDC测定中似乎不具有任何CDC活性(例如，上述背景)。在其他实施方案中，发现本发明的修饰多肽具有与母体多肽相比增强了的CDC(例如，当比较IC50值时，表现出约2倍到约100倍(或更高)的体外或体内CDC活性的提高)。还可对具有本发明的修饰的Fc区域的多肽进行体内筛选。可使用任意类型的体内测定法。下文提供了一种测定法类型的一个具体实例。该示范性测定容许了临床前体内评价修饰的Fc区域。可将待测试的修饰的多肽结合到已知具有一些活性的特定抗体的Fc区域中。例如，可将修饰通过诱变结合到抗CD20IgG的Fc区域中。这容许母体IgG和Fc变体IgG直接与RITUXAN(已知促进肿瘤衰退)比较。临床前评价可在2个阶段进行(药物动力学和药效相)。I期药物动力学研究的目标是确定在Fc变体IgG和具有已知体内活性的抗体(例如，RITUXAN)之间是否存在清除率的差别。清除率的差别可导致血清中IgG稳态水平的差别。象这样，如果检测到稳态浓度的差别，则应该对这些进行标准化从而使精确的比较能够得以进行。II期药效学研究的目标是确定Fc突变，在这个情形中，对肿瘤生长的影响。先前的用RITUXAN进行的研究使用了完全抑制肿瘤生长的单一剂量。因为其不容许测量定量差别，应该使用剂量范围。具有本发明的修饰的Fc区域、非修饰的(例如，野生型)母体Fc的多肽和RITUXAN的I期药物动力学比较可以以下面的方式进行。首先，可向每个动物静脉内注射40吗，并在0,0.25,0.5，1，24，48，168,和336小时定量测量IgG的血浆水平。可以拟合这些数据，例如，利用使用零滞后二室药物动力学模型的药物动力学程序(WinNonLin)，从而获得清除率。清除率可用于用以下等式定义稳态血浆水平C-剂量/(清除率xT)，其中T是给药之间的间隔，C是稳态的血浆水平。药物动力学实验可在不具有肿瘤的小鼠中，以例如每个时间点最少5只小鼠的量，来进行。动物模型可以下面的方式在下一阶段中使用。可将106Raji细胞皮下植入CB17-SCID小鼠的右胁。植入后，可立即开始进行静脉推注(bohis)具有修饰的Fc区域的多肽、具有母体(例如，野生型)Fc的多肽、和RITUXAN，并持续直至肿瘤尺寸在直径上大约2cm。可在每周一、周三和周五通过利用测径器测量肿瘤的长度、宽度和深度来确定肿瘤体积(肿瘤体积=WxLxD)。肿瘤体积对应于时间的图将给出用于药物动力学计算的肿瘤生长率。每组应该最少使用约IO只动物。具有本发明的修饰的Fc区域、母体的(例如，野生型)Fc的多肽和RITUXAN的II期药效学比较可以以下面的方式进行。根据公开的数据，每周10吗/g的RITUXAN完全抑制体内肿瘤生长(Clynes等，2000April;6(4):443-6，2000,将其并入本文作为参考)。因此，可对每周10吗/g,5吗/g,1吗/g,0.5吗/g，和0吗/g的剂量范围进行检测。可通过稳态血浆水平与效力之间的关系绘图确定抑制50%的肿瘤生长率时的稳态血浆水平。可通过上述方法计算稳态血浆水平。如果必要，T可对于每个修饰的Fc区域的多肽和Fc野生型，根据它们的药物动力学特性进行相应的调整，从而获得能与RITUXAN相比较的稳态血浆水平。修饰多肽的统计学改进的药效学值与母体多肽(例如，Fc野生型)和RITUXAN相比较，通常会显示修饰多肽赋予提高的体内活性。在进一步的实施方案中，筛选本发明的修饰的Fc区域，从而鉴定在至少2个种类中对治疗用途有用的变体。这样的变体在本文中称为"双物种改进的变体"，且对鉴定在人类中作为治疗剂的变体特别有用，并且还证明(或可能证明)在动物模型中的功效。在这点上，本发明提供鉴定很可能被批准进行人类临床检测的变体的方法，因为动物模型数据将很可能支持对政府调控机构(例如，美国食品及药物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration(美国食品和药品管理局))进行的任意人类检测应用。在某些实施方案中，对双物种改进的修饰多肽进行的鉴定是通过首先利用人效应细胞进行ADCC测定以发现改进的修饰多肽，然后再利用小鼠、大鼠或非人灵长类动物效应细胞进行第二次ADCC测定从而鉴定该改进的修饰多肽的亚组进行的，所述改进的修饰多肽是双物种改进的修饰多肽。在一些实施方案中，本发明提供鉴定双物种改进的修饰多肽的方法，所述方法包括a)提供i)靶细胞，ii)包含母体多肽的候选修饰多肽的组合物，所述母体多肽具有Fc区域的至少一部分，其中所述候选修饰多肽在Fc区域中包含至少一个氨基酸修饰，且其中所述候选修饰多肽在第一物种(例如，人)的效应细胞存在下比母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性，和iii)第二物种(例如小鼠、大鼠或非人灵长类)效应细胞，和b)在一定条件下温育所述组合物和所述靶细胞，从而使所述候选修饰多肽与所述靶细胞结合，从而产生候选修饰多肽结合的靶细胞，c)将第二物种效应细胞与所述的候选修饰多肽结合的靶细胞进行混合，和d)测量由所述候选修饰多肽介导的靶细胞细胞毒性。在某些实施方案中，该方法进一步包括步骤e)确定所述候选修饰多肽是否在第二物种的效应细胞存在下比母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性。在一些实施方案中，该方法进一步包括步骤f)鉴定候选修饰多肽作为双物种改进的修饰多肽，该双物种改进的修饰多肽在第二物种的效应细胞存在下比母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性。在优选的实施方案中，接着在一个或多个动物测定中体内筛选鉴定的双物种修饰多肽。在某些实施方案中，双物种改进的修饰多肽是通过利用人组分(例如人细胞、人Fc受体等)进行上述任意的测定法来鉴定具有修饰的Fc区域的改进的多肽，然后再用非人动物组分(例如小鼠细胞、小鼠Fc受体等)进行相同的测定(或不同的测定)进行鉴定的。在这点上，能够将在基于人的测定法和基于第二物种测定法中根据给出的标准表现优秀的修饰多肽的亚组鉴定出来。鉴定具有本发明修饰的Fc区域的双物种改进的多肽的示范方法如下。首先，对编码IgGFc区域的至少一部分的核酸序列进行修饰，以使所表达的氨基酸序列有至少一个氨基酸改变，从而产生修饰的Fc区域。再在测定板上通过抗原捕获该表达的IgG变体。其次，利用ELISA筛选所捕获的变体以用于可溶性人FcyyRlII的结合。如果该变体显示提高的或可比的(与非突变母体Fc区域相比较)FcYRIII结合，则利用ELISA筛选该变体以用于与人FcYRin的结合。然后可计算该变体的相对特异性比率。再次，利用人PBMCs或亚组(NK细胞或巨噬细胞，例如)对该变体进行ADCC测定。如果发现增强的ADCC活性，则利用小鼠或大鼠PBMCs在第二ADCC测定中筛选该变体。备选地，或另外地，能用该变体进行与克隆的啮齿动物受体或细胞系的结合的测定。最后，如果发现该变体在第二个测定中被改进，使其成为双改进变体，则在小鼠或大鼠中体内筛选该变体。包含本发明的修饰的Fc区域的示范多肽本发明的变体Fc区域可为较大分子，优选地抗原结合分子(ABMs)的一部分。该较大分子可为，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、免疫黏附素等。这样，明显存在着对本发明的修饰的Fc区域的广泛应用。对于本发明中所讨论的所有情形，免疫球蛋白重链的编号是根据EU索弓l进行的(Kabat等,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫性革巴标的蛋白质序列)，第5版，美国公众健康服务机构(UnitedStatesPublicHealthService),国家健康研究所(NationalInstitutesofHealth),贝塞斯达)。"如Kabat中的EU索引"指人IgGlEU抗体的残基编号。可对包含本发明的修饰的Fc区域的抗原结合分子的多种特性进行优化。可进行优化的特性包括，但不限于，增强或减弱的对FcYR的亲和性。在一个优选的实施方案中，对本发明的修饰的Fc区域进行优化，从而获得对人激活FcyR，优选地FcRl，FcYRlIa，FcyRlIc,Fc^RlIIa,禾口Fc丫RJIIb，最优选地，FcYRlIIa增强的亲和性。在另一个优选的实施方案中，对该修饰的Fc区域进行优化，从而获得对人抑制受体FcYRlIb减弱的亲和性。本发明的ABMs提供具有在人类中增强的治疗特性的抗体和Fc融合体，所述治疗特性例如增强的效应子功能和更强的抗癌能力。在另一个实施方案中，对本发明的修饰的Fc区域进行优化，以获得对人FcyR降低或消除的亲和性，所述FcyR包括但不限于Fc丫RI,FcyRHa，FqRIIb,或FcYRlIc。预期本发明的这些ABMs提供在人类中具有增强治疗特性的抗体和Fc融合体，所述治疗特性例如降低的效应子功能和降低的毒性。优选的实施方案包括Fc与人FcYR结合的优化；然而，在另一个实施方案中，本发明的Fc变体具有对来源于非人生物体的FcYRs增强或降低的亲和性，所述非人生物体包括但不限于小鼠、大鼠、兔和猴。对其与非人FcyR的结合进行了优化的Fc变体可在实验研究中发现用途。例如，小鼠模型可用于多种疾病，使其能够对给定药物候选物进行诸如功效、毒性和药物动力学特性的测试。如本领域所已知，能将癌细胞移植或注射到小鼠中以模拟人类癌症，即一种称为异种移植的方法。包含修饰的Fc区域的抗体或Fc融合体的测试可提供关于该抗体或Fc融合体的功效及其作用机制等的有价值信息，其中所述修饰的Fc区域是经过对一个或多个小鼠FcyRs进行了优化的。本发明的修饰的Fc区域可来源于母体Fc多肽，且该母体Fc多肽自身来自于广泛的来源。该母体Fc多肽基本上可由一个或多个来源于任何生物体的Fc基因编码，其中生物体包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、骆驼、无峰驼(llama)、单峰驼(dromedaries)、猴，优选地为哺乳动物，最优选地为人和小鼠。在一个优选的实施方案中，该母体Fc多肽包括抗体，称为母体抗体。该母体抗体可完全为人类的抗体，该母体抗体例如利用转基因小鼠(Bruggemann等，1997,CwrC|pz>所otec/z"o/f现/f主激^^"观iJ&455-458)或人抗体库与选择方法(Griffiths等，1998,CWr(9p^所o加/mo/f观/f主激犮术观^V久102-108)相结合获得的。该母体抗体无需天然存在。例如，该母体抗体可为改造的抗体，包括但不限于嵌合抗体和人源化抗体(Clark，2000，/mm柳o/7b^yf今^^菊":397-402)。该母体抗体可为抗体的改造变体，所述抗体基本上由一个或多个天然抗体基因编码。在一个实施方案中，如本领域所已知，该母体抗体已经进行了亲和性成熟。或者，抗体经一些其他方法修饰，例如，如2003年3月3日提交的美国系列号10/339,788中所述。本发明的修饰的Fc区域可基本上由属于任意抗体种类的免疫球蛋白基因编码。在一个优选的实施方案中，本发明的修饰的Fc区域在包含属于抗体的IgG类序列的抗体或Fc融合体中发现用途，其中抗体IgG类包括IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4。在另一个实施方案中，本发明的修饰的Fc区域在包含属于抗体的IgA(包括亚类IgAl和lgA2)、IgD、IgE、IgG或IgM类的序列的抗体或Fc融合体中发现用途。本发明的修饰的Fc区域可包含超过一条蛋白质链。即，本发明可在作为单体或寡聚体，包括同型或异型寡聚体的抗体或Fc融合体中发现用途。本发明的修饰的Fc区域可与其他Fc修饰组合，所述其他Fc修饰包括但不限于，改变效应子功能或与一个或多个Fc配体相互作用的修饰。这种组合可在本发明的ABMs中提供附加的、协同的或新型的特性。在一个实施方案中，本发明的修饰的Fc区域可与其他已知Fc修饰组合(Duncan等，1988,A^WMf^然〕B2:563-564;Lund等，1991,JV/wmmo/(免疫学杂志)147:2657-2662;Lund等，1992,Mo//ww""o《竟i^分f学J":53-59;Alegre等，1994,rrara//a"to"w^移^)57:1537-1543;Hutchins等，1995，ProcA^/A:^/5WL^^夷濕，^W学^7^":11980-11984;Jefferis等，1995,/mww"o/Z^/44:111-117;Lund等，1995,J9:115-119;Jefferis等，1996,/www"o/丄e々5(101-104;Lund等，1996,//mw""o/f^资学染乂^7/57:4963-4969;Armour等，1999，五w,//wmwzo/「欽^//_^资学染,旬":2613-2624;Idusogie等，2000,J7附mw"o/^^瘦学^V萄/":4178-4184;Reddy等，2000,J/www"o/(^!ig"学J^萄7":1925-1933;Xu等，2000,Ce〃/mmimo《潘^^免i^学J^0:16-26;Idusogie等，2001,/wmww/f^ig"学染,旬嵌2571-2575;Shields等，2001，/飾/C/2ew广主激众学染,去」276:6591-6604;Jefferis等，2002,7mm朋o/丄e/ZS2:57國65;Presta等，2002,历oc/zemSocTram30:487-490;Hinton等，2004,J所o/C72ewf主欽众学^^萄，:6213-6216)(美国专利号5，624，821;5,885,573;6,194,551;PCTWO00/42072;PCTWO99/58572;2004/0002587Al)。因而，在以产生具有优化特性的新型ABMs(例如，抗体或Fc融合体)为目的下，意欲本发明的修饰的Fc区域与其他Fc修饰以及未发现的Fc修饰的组合。实际上，任何抗原可被包含本发明修饰的Fc区域的ABMs所靶向，所述抗原包括但不限于以下列出的蛋白质、亚基、结构域、基序和属于以下蛋白质列表中的表位CD2;CD3，CD3E，CD4，CDll，CDlla,CD14,CD16,CD18,CD19,CD20，CD22,CD23，CD25,CD28,CD29,CD30,CD32,CD33(p67蛋白)，CD38，CD40，CD40L,CD52,CD54,CD56,CD80,CD147，GD3，IL-l,IL-1R，IL-2,IL-2R,IL-4，IL-5,IL-6,IL-6R,IL-8,IL-12,IL-15，IL-18,IL-23,干扰素a,干扰素(3,干扰素y;TNF-a,TNF卩2，TNFc,TNF(ry，TNF-RI,TNF-RII，FasL,CD27L,CD30L,4-1BBL,TRAIL,RANKL,TWEAK,APRIL,BAFF，LIGHT,VEGI,OX40L,TRAIL受体-1,Al腺苷受体，淋巴毒素卩受体，TACI，BAFF-R，EPO;LFA-3,ICAM-1，ICAM-3，EpCAM,整联蛋白al,整联蛋白(32，整联蛋白oc4/(37，整联蛋白a2,整联蛋白a3,整联蛋白a4,整联蛋白a5,整联蛋白a6,整联蛋白av,aVp3整联蛋白，FGFR-3，角质形成细胞生长因子，VLA-l,VLA-4，L-选择蛋白，抗-Id,E-选择蛋白，HLA，HLA-DR,CTLA-4,T细胞受体，B7-l，B7-2，VNR整联蛋白，TGFpl,TGFp2,嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)l，BLyS(B-淋巴细胞剌激物)，补体C5,IgE,因子VII，CD64,CBL,NCA90,EGFR(ErbB-l),Her2/neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3),Her4(ErbB-4)，组织因子，VEGF,VEGFR，内皮縮血管肽受体，VLA-4，半抗原NP-cap或NIP-cap，T细胞受体o/(3，E-选择蛋白，异羟基洋地黄毒苷原，胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和睾丸PLAP样碱性磷酸酶，运铁蛋白受体，癌胚抗原(CEA)，CEACAM5,HMFGPEM,黏蛋白MUC1,MUC18,肝素酶(Heparanase)I,人心肌球蛋白，肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72),肿瘤相关抗原CA125,前列腺特异性膜抗原(PSMA)，高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)，癌症相关抗原，GcoproteinIIMIIa(GPIIMIIa)，表达LewisY相关的碳水化合物的肿瘤相关抗原，人巨细胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白，HIVgpl20,HCMV,呼吸道合胞病毒RSVF,RSVFFgp,VNR整联蛋白，IL-8，细胞角蛋白肿瘤相关抗原，HepBgpl20,CMV,gpllbllla，HIVIIIBgpl20V3环，呼吸道合胞病毒(RSV)Fgp,单纯疱疹病毒(HSV)gD糖蛋白，HSVgB糖蛋白，HCMVgB包膜糖蛋白,和梭菌perfringens毒素。本领域中的普通技术人员将理解上述靶标列表不仅指特异性蛋白和生物分子，还指包括它们的一种或多种生物化学途径。例如，涉及CTLA-4作为靶抗原意指组成T细胞共剌激途径的配体和受体，包括CTLA-4,B7-1,B7-2,CD28，和任何其他未发现的与这些蛋白质结合的配体或受体，也是耙标。因而，本文所使用的靶标不仅指特异性生物分子，还指与所述靶标相互作用的这组蛋白质以及所述靶标所属的生物化学途径中的成员。本领域中技术人员将进一步理解上述任意靶抗原、与其结合的配体或受体、或它们相应生物化学途径中的其他成员可与本发明的FC变体可操作地进行连接，从而产生Fc融合体。因而例如，通过可操作地连接Fc变体和EGF、TGFa，或任何已知或未知的且与EGFR结合的其他配体，能够构建耙向EGFR的Fc融合体。因此，本发明的修饰的Fc区域能可操作地与EGFR连接，从而产生与EGF、TGFa，或任何已知或未知的且与EGFR结合的其他配体结合的Fc融合体。因而，实际上，任何多肽，无论配体、受体或一些其他的蛋白质或蛋白质结构域，包括但不限于上述的靶标和组成其相应生物化学途径的蛋白质，可与本发明的Fc变体可操作地连接，以发展Fc融合体。大量在临床试验或开发中被批准使用的抗体和Fc融合体可从本发明的修饰的Fc区域获得益处。所述抗体和Fc融合体在本文中称为"临床产品和候选物"。因而在一个优选的实施方案中，本发明的Fc变体可在一系列临床产品和候选物中发现用途。例如，大量靶向CD20的抗体可从本发明的修饰的Fc区域获得益处。例如，本发明的修饰的Fc区域可在以下各项中发现用途基本相似于利妥昔单抗(Rituxan,IDEC/Genentech/Roche)(参见例如美国专利号5,736,137)的抗体，经批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体；目前由Genmab开发的抗-CD20，HuMax-CD20;在美国专利号5，500，362中所描述的抗CD20抗体；AME-I33(AppliedMolecularEvolution);hA20(Immunomedics,Inc.);和HumaLYM(Intracel)。大量革巴向表皮生长因子受体家族成员的抗体可从本发明的Fc变体获得益处，其中所述表皮生长因子受体家族成员包括EGFR(ErbB-l),Her2/neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3)，Her4(ErbB-4)。例如，本发明的Fc变体可在以下各项中发现用途基本类似于曲妥单抗(Herceptin,Genentech)(参见例如美国专利号5,677,171)的抗体，经批准用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；目前由Genentech开发的pertuzumab(rhuMab-2C4,Omnitarg.TM.);在美国专利号4,753,894中所描述的抗-Her2抗体；西妥昔单抗(Erbitux,Imclone)(美国专利号4，943，533;PCTWO96/40210)，用于多种癌症在临床试验中的嵌合抗-EGFR抗体；目前由Abgenix/Immunex/Amgen开发的ABX-EGF(美国专利号6,235,883);目前由Genmab开发的HuMax-EGFr(美国系列号10/172,317);425,EMD55900，EMD62000，和EMD72000(MerckKGaA)(美国专利号5,558,864;Murthy等1987，ArchBiochemBiophys.252(2):549-60;Rodeck等，1987,JCellBiochem.(细胞生物化学杂志)35(4):315-20;Kettleborough等，1991，ProteinEng.(蛋白质工程)4(7):773-83);ICR62(癌症研究中心)(PCTWO95/20045;Modjtahedi等，1993，J.CellBiophys.(细胞生物物理杂志)1993，22(1-3):129-46;Modjtahedi等，1993，BrJCancer.1993,67(2):247-53;Modjtahedi等，1996,BrJCancer,73(2):228-35;Modjtahedi等，2003，InUCancer(国际癌症杂志)，105(2):273-80);TheraCIMhR3(YMBiosciences,CanadaandCentrodeImmunologiaMolecular,古巴(美国专禾U号5,891,996;6，506，883;Mateo等，1997,Immunotechnology(免疫技术)，3(1):71-81);mAb-806(Ludwig癌症研究所(LudwigInstitueforCancerResearch),MemorialSloan-Kettering)(Jungbluth等2003，ProcNatlAcadSciUSA.100(2):639-44);KSB-102(KSBiomedix);MR1匿1(IVAX，国家癌症研究所(NationalCancerInstitute))(PCTWO0162931A2);和SCI00(Scancell)(PCTWO01/88138)。在另一个实施方案中，本发明的修饰的Fc区域可在阿仑单抗(Campath⑧，Millenium),—种目前被批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的人源化单克隆抗体中发现用途。该修饰的Fc区域可在与其他临床产品和候选物基本相似的多种抗体或Fc融合体中发现用途，这些抗体或Fc融合体包括但不限于莫罗单抗-CD3(OrthocloneOKT3)，由OrthoBiotech/Johnson&Johnson开发的抗-CD3抗体；替伊莫单抗(Zevalin⑧)，由IDEC/ScheringAG开发的抗CD20抗体；吉姆单抗奥佐米星(Mylotarg⑧)，由Cdltech/Wyeth开发的抗-CD33(p67蛋白)抗体；alefacept(Amevive),由Biogen开发的抗LFA-3的Fc融合体；由Centocor/Lilly开发的阿昔单抗(ReoPro⑧)；由Novartis开发的巴利昔单抗(Simulect.);由Medlmmune开发的帕利珠单抗(Synagis⑧)；英夫利昔单抗(Remicade(D),由Centocor开发的抗-TNFa抗体；阿达木单抗(Humim⑧)，由Abbott开发的抗-TNFa抗体；Humicade,由Celltech开发的抗-TNFa抗体；依那西普(Enbre媳)，由Immunex/Amgen开发的抗-TNFaFc融合体；ABX-CBL，由Abgenix开发的抗-CD147抗体；ABX-IL8，由Abgenix开发的抗-IL8抗体；ABX-MA1，由Abgenix开发的抗-MUC18抗体；Pemtumomab(R1549,.sup.卯Y-muHMFGl),由Antisoma开发的抗MUC1;Therex(R1550)，由Antisoma开发的抗-MUCl抗体；由Antisoma开发的AngioMab(AS1405);由Antisoma开发的HuBC-l;由Antisoma开鍋Ihioplatin(AS1407);Antegren斷另P^^单抗)，由Bbgen开发的抗画a_4-P陽l(VLA-4)和a-4-3-7抗体；VLA-1mAb，由Biogen开发的抗-VLA-l整联蛋白受体；LTBRmAb，由Biogen开发的抗-淋巴毒素P受体(LTBR)抗体；CAT-152，由剑桥抗体技术公司(CambridgeAntibodyTechnology)开发的抗-TGF.2抗体；J695，即由剑桥抗体技术公司和Abbott开发的抗IL-12抗体；CAT-192,由剑桥抗体技术公司和Genzyme开发的抗-TGF.P.l抗体；CAT-213，由剑桥抗体技术公司开发的抗Eotaxinl抗体；LymphoStat-B.TM.，由剑桥抗体技术公司和人类基因组科学有限公司(HumanGenomeSciences,Inc.)开发的抗-Blys抗体；TRAIL-RlmAb，由剑桥抗体技术公司和人类基因组科学有限公司开发的抗TRAIL-R1抗体；Avastin(贝伐单抗，rhuMAb-VEGF)，由Genentech开发的抗-VEGF抗体；由Genentech开发的抗-HER受体家族抗体；抗组织因子(ATF)，由Genentech开发的抗组织因子抗体，Xolair(Omalizumab)，由Genentech开发的抗-IgE抗体；Raptiva(Efalizumab)，由Genentech和Xoma开发的抗-CDlla抗体；由Genentech和Millenium药物公司(Pharmaceuticals)开发的MLN-02抗体(原来的LDP-02);HuMaxCD4，由Genmab开发的抗-CD4抗体；HuMax-IL15，由Genmab和Amgen开发的抗-IL15抗体；由Genmab和Medarex开发的HuMax-Inflam;HuMax-癌症，由Genmab禾口Medarex禾口OxfordGcoSciences开发的抗肝素酶I抗体；由Genmab和Amgen开发的HuMax-淋巴瘤；由Genmab开发的HuMax-TAC;由IDEC药物公司开发的IDEC-131，和抗CD40L抗体；IDEC-151(克立昔单抗)，由IDEC药物公司开发的抗-CD4抗体；IDEC-114，由IDEC药物公司开发的抗-CD80抗体；IDEC-152，由IDEC药物公司开发的抗-CD23;由IDEC药物公司开发的抗-巨噬细胞移动因子(MIF)抗体；BEC2，由Imclone开发的抗-特应抗体；IMC-lCll，由Imclone开发的抗-KDR抗体；DCIOI，由Imclone开发的抗flk-1抗体；由Imclone开发的抗VE钙黏着蛋白抗体；CEA-Cide(labetuzumab)，由Immunomedics开发的抗癌胚抗原(CEA)抗体；LymphoCide⑧(依帕珠单抗)，由Immunomedics开发的抗CD22抗体；由Immunomedics开发的AFP-Cide;由Immunomedics开发的MyelomaCide;由Immunomedics开发的LkoCide;由Immunomedics开发的ProstaCide;MDX國010，由Medarex开发的抗-CTLA4抗体；MDX-060,由Medarex开发的抗-CD30抗体；由Medarex开发的MDX-070;由Medarex开发的MDX-018;Osidem(IDM-l),禾口由Medarex禾口Immuno-DesignedMolecules(免疫设计分子公司)开发的抗-Her2抗体；HuMaxCD4，由Medarex和Genmab开发的抗-CD4抗体；HuMax-IL15，由Medarex禾HGenmab开发的抗-IL15抗体；CNTO148，由Medarex和Centocor/J&J开发的抗-TNFa抗体；CNTO1275，由Centocor/J&J开发的抗细胞因子抗体；MOR101和MOR102，由MorphoSys开发的抗胞间黏附分子-(ICAM-l)(CD54)1抗体；MOR201，由MorphoSys开发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体；Nuvion⑧(visilizumab)，由蛋白质设计实验室(ProteinDesignLabs)开发的抗-CD3抗体；HuZAF,由蛋白质设计实验室开发的抗Y干扰素抗体；由蛋白质设计实验室开发的抗quadrature.5.quadrature.1整联蛋白；由蛋白质设计实验室开发的抗-IL-12;ING-1，由Xoma开发的抗-Ep-CAM抗体；和MLNOl，由Xoma开发的抗-P2整联蛋白抗体。修饰的Fc区域对上述抗体和Fc融合体临床产品和候选物的应用并不意味着受其精确组成的限制。本发明的修饰的Fc区域可结合到上述临床候选物和产品中，或结合到基本与它们相似的抗体和Fc融合体中。本发明的修饰的Fc区域可结合到人源化的、亲和性成熟的、改造的或以一些其他方法修饰的上述临床候选物和产品的形式中。此外，无须使用上述临床产品和候选物的完整多肽来构建结合本发明的修饰的Fc区域的新抗体或Fc融合体；例如，可以仅使用临床产品或候选抗体的可变区域，基本相似的可变区域，或可变区域的人源化的、亲和性成熟的、改造的或修饰的形式。在另一个实施方案中，本发明的修饰的Fc区域可在这样的抗体或Fc融合体中发现用途，所述抗体或Fc融合体结合于与上述临床产品和候选物之一相同的表位、抗原、配体或受体。本发明的修饰的Fc区域可在广泛的抗体和Fc融合产品中发现应用。在一个实施方案中，本发明的ABM是治疗剂、诊断剂或研究试剂，优选地为治疗剂。能通过本发明的ABM治疗或改善的疾病和病症包括，但不限于，自体免疫疾病、免疫学疾病、传染性疾病、炎性疾病、神经学疾病和肿瘤学和肿瘤疾病包括癌症。本文中的"癌症"和"癌性的"是指或描述典型特征为不受控制的细胞生长的哺乳动物中的生理学状态。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑脊膜瘤、腺瘤、黑素瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更特殊的实例包括鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)，肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部腺瘤和肺部鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃(gastric或stomach)癌包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾(kidney或renal)癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，睾丸癌，食道癌，胆管肿瘤，以及头部和颈部癌症。而且，本发明的Fc变体可用于治疗以下病症，所述病症包括但不限于充血性心力衰竭(CHF)、脉管炎、玫瑰痤疮(rosecea)、痤疮、湿疹、心肌炎和其他心肌病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞、和骨髓基质；骨损失；佩吉特病、破骨细胞瘤；多发性骨髓瘤；乳腺癌；废弃性骨质减少；营养不良、牙周疾病、戈谢病、郎格汉斯细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库欣综合征、单骨生成纤维性发育异常、多骨生成纤维性发育异常、牙周再生和骨折；结节病；多发性骨髓瘤；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理和体液恶性高钙血症，关节强硬性脊椎炎和其他脊椎关节病；移植排斥，病毒感染，血液瘤形成和瘤样病症，例如，霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、扩散大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多毛细胞白血病和淋巴细胞增殖性白血病)，淋巴细胞前体细胞肿瘤，包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤，胸腺瘤，成熟T和NK细胞肿瘤，包括外周T细胞白血病，成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大颗粒淋巴细胞白血病，郎格汉斯细胞组织细胞增多症，骨髓瘤形成如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML，无分化的AML，急性前髓细胞白血病，急性脊髓单核细胞白血病，和急性单核细胞白血病，脊髓发育不良综合征，和慢性脊髓增生病症，包括慢性骨髓性白血病，中央神经系统肿瘤，例如脑肿瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、室鼓膜瘤和成视网膜细胞瘤)，实体瘤(鼻咽癌、基细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫、阴道或子宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌，和脉管系统肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)，骨质疏松症，肝炎，HIV，AIDS，脊椎关节炎，类风湿性关节炎，炎性肠疾病(IBD)，脓毒症和败血病性休克，局限性回肠炎，牛皮癣，scWeraderma，移植物抗宿主病(GVHD)，同种异体胰岛移植排斥，血液恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤(MM)，骨髓发育不良综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)，肿瘤有关的炎症，外周神经损伤或脱骨髓鞘病。在一个实施方案中，将包含本发明修饰的Fc区域的ABM施用于患有涉及蛋白质不适当表达的疾病的患者。在本发明的范围内，这指包括特征为异常蛋白质的疾病和病症，所述异常蛋白质是由例如蛋白质存在量的改变，突变蛋白质的存在，或二者兼具的原因引起的。过多可由于任何原因，包括但不限于分子水平上的过表达，作用位点处的延长或积累的出现，或与正常水平相比增加的蛋白质活性。该定义所包括的是特征为蛋白质减少的疾病和病症。该减少可由于任何原因，包括但不限于分子水平减少的表达，作用位点处缩短或减少的出现，蛋白质突变形式，或与正常水平相比降低的蛋白质活性。这种蛋白质的过多或减少可相对于蛋白质正常的表达、出现或活性进行测量，且所述测量可在本发明ABMs的开发和/或临床测试中起重要作用。改造方法本发明提供可用于产生Fc变体的改造方法。妨碍先前的在Fc改造上的尝试的主要障碍是仅可能对修饰进行随机尝试，这是部分地由于改造策略和方法的低效率，和抗体生产和筛选的低通量性质引起的。本发明描述了克服这些缺点的改造方法。意欲多种设计策略、计算筛选方法、库产生方法和试验生产和筛选方法。这些策略、手段、技术和方法可单独地或在多种联合中应用，以改造优化的Fc变体。设计策略提供了一种改造Fc变体的设计策略，其中Fc和一些Fc配体间的相互作用通过在Fc和所述Fc配体间界面处改造氨基酸修饰进行改变。本文中Fc配体可包括但不限于FcyRs,Clq,FcRn，蛋白质A或G等。通过探索在影响结合界面的Fc位置上的能量有利性替换，能将变体改造为具有新界面构象，其中一些可提高与Fc配体的结合，其中一些可减弱Fc配体结合，且其中一些可具有其他有利特性。这样的新界面构象能由下列因素所产生，例如，与形成该界面的Fc配体残基的直接相互作用，或由氨基酸修饰所导致的间接作用如侧链或主链构象的干扰。可将可变位置选择为被认为在决定该界面构象中起重要作用的任意位置。例如，可变位置可作为在与Fc配体直接接触的任何残基的一定距离内的残基组进行选择，所述距离例如5埃，优选地1-10埃。提供了另外一种产生Fc变体的设计策略，其中优化了N297处的Fc碳水化合物构象。如本文中使用的优化是指包括N297碳水化合物构象和组成的变化，该变化导致所要求的特性，例如对FcYR增加或减弱的亲和性。这一策略是由该碳水化合物结构和构象显著地影响Fc/FcyR和Fc/Clq的结合(Umafia等，1999，7VW历o&c/2"o/匸^然主^^^术J77:176-180;Davies等,2001,5/o/ec/2"o/历oe"g("主欽拔术主激工程,74:288-294;Mimum等，2001,JAo/C7z^n(T主激众学染,志J27(5:45539-45547.;Radaev等'2001,276J历o/f主激化学染,吉久16478-16483;Shields等，2002,/说'o/C7^m(T主激众学J^^V277:26733-26740;Shinkawa等，2003,J5z'o/C7zem^仝瀲众学/夯^^27&3466-3473)的观察所支持的。通过探索在与碳水化合物相互作用的位置处的能量有利性替换，能对广泛多样的变体进行改造使其具有新碳水化合物构象，其中一些可提高与一个或多个Fc配体的结合，其中一些可减弱与一个或多个Fc配体的结合。虽然邻近Fc/碳水化合物界面的大多数突变看起来改变碳水化合物构象，一些突变已显示出改变其糖基化组成(Lund等，1996,//www"o/C^疫学染,东)"7:4963腳4969;Jefferis等，2002,/附wz/"o/丄Mf凍i^"学if诏^么57-65)。提供产生Fc变体的另一种设计策略，其中优化了Cy2和CY3结构域间的角度。如本文中使用的优化意为描述CY2-CY3结构域角度中的构象变化，该变化导致所要求特性，例如对FcyR增加或减弱的亲和性。该角度是Fc/FcyR亲和性的重要决定因素(Radaev等，2001，■/万z'o/C/7e附f生欽众学/杂,志J276:16478-16483)，且大量在Fc/FcYR界面远端的突变可能通过对其迸行调整来影响结合(Shields等，/历o/CA，ff欽必学^^V276:6591-6604(2001))。通过探索看起来在决定结构域间彼此的CY2-CY3角度和柔性中起关键作用的能量有利性替换，能将广泛多样的变体设计为具有新角度和柔性水平，可将其中一些进行优化以获得所要求的Fc特性。提供产生Fc变体的另一种设计策略，其中重新改造了Fc，以消除其对糖基化的结构和功能依赖性。该设计策略涉及在缺乏N297碳水化合物的条件下，Fc结构、稳定性、溶解性和/或Fc功能(例如Fc对一个或多个Fc配体的亲和性)的优化。在一种方法中，在缺乏糖基化条件下，改造向溶剂暴露的位置，以使得它们稳定，在结构上与Fc结构一致，且无聚集趋势。CY2是抗体中仅有的不成对Ig结构域。因而，N297碳水化合物掩盖该暴露的疏水性膜片，从而保持Fc的稳定性和结构的完整性，并维持CY2结构域免于越过中心轴聚集，其中所述膜片通常是进行与其它Ig结构域的蛋白质-蛋白质相互作用的界面。优化非糖基化的(aglycosylated)Fc的方法可包括但不限于设计通过掺入极性和/或带电荷的向内面向Cy2-Oy2二聚体轴的残基来增强非糖基化(aglycosylated)Fc稳定性和/或溶解性的氨基酸修饰，和设计直接增强该非糖基化(aglycosylated)Fc/FcYR界面或非糖基化(aglycosylated)Fc与一些其他Fc配体的界面的氨基酸修饰。提供改造Fc变体的另一种设计策略，其中优化了CY2结构域的构象。如本文中使用的优化意为描述CY2结构域角度的构象改变，该变化导致所要求特性，例如对FqR增强或减弱的亲和性。通过探索影响Q/2构象的CY2位置上能量有利性替换，能将广泛多样的变体改造为具有新CY2构象，其中一些可实现该设计目的。这样的新CY2构象可以是，例如，由所述变体为代表的备选的主链构象的结果。可将可变位置选择为被认为在决定C丫2结构、稳定性、溶解性、柔性、功能等中起重要作用的任意位置。例如，可重新改造Cy2疏水性核心残基，即与溶剂部分地或完全地隔离的Cy2残基。或者，可考虑非核心残基，或确信对决定主链结构、稳定性或柔性很重要的残基。提供Fc优化的另一种设计策略，其中通过修饰来改变与FcyR、补体或一些其它Fc配体的结合，所述修饰调节Fc和所述Fc配体间的静电相互作用。可将这样的修饰认为是Fc的整体静电特征的优化，且包括用带电氨基酸替换中性氨基酸，用中性氨基酸替换带电氨基酸，或用带相反电荷(即，电荷反向)的氨基酸替换带电氨基酸。这样的修饰可用于影响Fc和一个或多个Fc配体，例如FcyyRs间结合亲和性的改变。在一个优选的实施方案中，利用多种计算静电势的公知方法之一选择静电替换可影响结合的位置。在最简单的实施方案中，将库仑定律用于产生作为蛋白质中该位置的函数的静电势。另外的实施方案包括使用德拜-休克尔标度(scaling)来说明离子强度的影响，和更复杂的实施方案，如泊松-玻尔兹曼计算。这样的静电计算可突出位置并建议特异性氨基酸修饰，以实现设计目的。在一些情形中，可预期这些替换可变地影响着与不同Fc配体的结合，例如对激活FcYRs的增强的结合，而对抑制FcYRs减弱的结合亲和性。已经描述了嵌合小鼠/人抗体，参见，例如，Morrison,S.L.等，/WJ51〃:6851-6854(1984);欧洲专利公开号173494;Boulianna,G.L,等,淑舰@然;>3":642(1984);Neubeiger,M.S.等，A^"r"^然J3":268(1985);欧洲专利公开号125023;Tan等,丄/mmw"o/.f竞疫学染,吉J)"5:8564(1985);Sun，L.K等，/fy6nV/oma<"_^^)^J5(1):517(1986);Sahagan等，//wmw"o/.f免疫学染志J"7:1066-1074(1986).通常参见，Muron,A^wef^然J3":597(1984);Dickson,G匿"c五"g/"em,"giV面f遗传工荐新刷5(3)(1985);Marx,5We"ce"9:455(1985);禾BMorrison,5We"cef搏学J，:1202-1207(1985).在一个特别优选的实施方案中，本发明的嵌合ABM是人源化抗体。人源化非人抗体的方法为本领域已知。例如，能根据下列方法制备本发明的人源化ABMs，所述方法包括Winter的美国专利号5,225,539;Queen等的美国专利号6,180,370;Adair等的美国专利号6,632,927;Foote的美国专利申请公开号2003/0039649;Sato等的美国专利申请公开号2004/0044187;或Leung等的美国专利申请公开号2005/0033028的方法，特此将其每个全部内容并入本文作为参考。优选地，人源化抗体具有一个或多个由非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为"引进"残基，它们典型地由"引进"可变结构域获得。人源化能够基本上按照Winter及其同事的方法(Jones等，A^wrW^然;"，W/:522-525(1986);Riechmann等，7V^wrefy^然J，^2:323-327(1988);Verhoeyen等，Sc/e"ce(W学J，，:1534-1536(1988))，通过用高变区序列替换人抗体相应序列完成。因此，这样的"人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中明显少于完整人可变结构域已为来自于非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体典型地为人抗体，且其中一些高变区残基和可能地一些FR残基由源于啮齿动物抗体中类似位点的残基所替换。目标人源化的抗体通常会包含人免疫球蛋白的恒定区，如IgGl。对用于制备人源化抗体的人可变结构域，轻链和重链二者的选择，对减少抗原性非常重要。根据所谓的"最佳匹配"方法，针对完整的已知人可变结构域序列库对啮齿动物抗体可变结构域序列进行筛选。接着接受与啮齿动物序列最相近的人序列作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等，乂/mmw"o/.C^瘦学染,吉J，"7:2296(1993);Chothia等，J!Mo/.Ao/.f分子主激学z杂,若入(1987))。另一种选择人构架序列的方法是将完整啮齿动物构架的每个单独亚区的序列(例如，FR1,FR2,FR3，和FR4)或这些单独亚区的一些组合(例如，FR1和FR2)与对应于该构架亚区的已知人可变区序列库(例如，由Kabat编号决定的)进行比较，并对每个亚区或组合选择最接近于啮齿动物序列的人序列(Leimg美国专利申请公开号2003/0040606A1,2003年2月27日公开)(将其全部内容并入本文作为参考)。另一种方法使用源自轻或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架区域(Carter等，Prac.U.爿cadC7&^夷厲嵐家辨学^^，卵:4285(1992);Presta等，J/wwzmo/.fi瘦学^^吉j757:2623(1993))(特此将其每个的全部内容并入本文作为参考)。抗体经人源化保持对所述抗原高亲和性和其他有利生物特性也很重要。为实现该目的，根据一种优选的方法，通过利用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列和多种概念上人源化的产物的方法制备人源化抗体。利用本领域技术人员所熟悉的计算机程序(例如，InsightII，accelrysinc(从前的MSI)，或在由Schwede等，NucleicAcidsRes.(核酸研究)2003(13):3381-3385所描述的http:〃swissmodel.expasv.org/)能够生成三维免疫球蛋白模型。这些模型的检验容许了对该残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用进行分析，即，对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基的分析。以这种方法，能够从受体和引进序列中选择和组合FR残基，以获得所要求的抗体特征，如对靶抗原维持的亲和性。通常，该高变区残基直接地和最主要地涉及影响抗原结合。在一个实施方案中，本发明的ABMs包含修饰的人Fc区域。在一个具体的实施方案中，人恒定区是IgGl，如在SEQIDNOsl和2中所显示，并显示如下人IgGl恒定区核苷酸序列(SEQIDNO:l)AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGIt)CTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA人IgGl恒定区氨基酸序列(SEQIDNO:2)tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvs丽sgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvnhkps:ntkvdkkaepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevk^nwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpkepqvytlppskdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesng卿nnykttppvldsdgsfflyskefvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk然而，该天然人Fc区域的变体和同种型也涵盖于本发明中。例如，适合用于本发明的变体Fc区域能够根据以下文献所教导的方法产生，这些文献包括Presta的美国专利号6,737,056(具有由于一个或多个氨基酸修饰所改变的效应子功能的Fc区域变体)；或美国专利申请号60/439,498;60/456,041;60/514,549;或WO2004/063351(具有由于氨基酸修饰增加结合亲和性的变体Fc区域)；或美国专利号10/672,280或WO2004/099249(由于氨基酸修饰改变了对FcyR的结合的Fc变体)，并将其每个的全部内容并入本文作为参考。在另一个实施方案中，将本发明的抗原结合分子改造为具有增强的结合亲和性，这是根据，例如，Balint等在美国专利申请公开号2004/0132066中所公开的方法进行的，特此将其全部内容并入本文作为参考。在一个实施方案中，将本发明的抗原结合分子缀合于另外的部分，如放射性标记或毒素。该缀合的ABMs能通过本领域众所周知的大量方法产生。多种放射性核素适用于本发明，且认为本领域的技术人员具有容易地在多种情形下确定哪种放射性核素是最适合的能力。例如，131碘是熟知的用于靶向免疫疗法的放射性核素。然而，131碘的临床有效性可被若干因素所限制，包括8天物理半衰期；血液中和肿瘤位点处碘化抗体的脱卤作用；和对肿瘤中局部剂量沉积可以是非最适性的发射特征(例如，大Y成分)。随着优秀螯合剂的出现，将金属螯合基团连接到蛋白质上的机会增加了利用其他放射性核素如m铟和9()钇的机会。9()钇为用于放射免疫疗法应用提供若干益处9()钇的64小时半衰期足够长，从而容许肿瘤的抗体积累，且不同于例如"碘，W钇是在其衰变中不伴随Y照射的，在组织中具有ioo-iooo个细胞直径范围的高能量纯e放射体。此外，贯穿辐射的最少量容许给门诊病人施用M钇标记的抗体。另外，细胞杀伤对标记抗体的内化没有要求，且电离辐射的局部发射应该对缺乏该靶抗原的相邻肿瘤细胞是致死因子。关于放射性标记抗体，以其进行的疗法还能利用单独疗法治疗或利用多重治疗发生。由于该放射性核素成分，优选在治疗前，"收获"外周干细胞("PSC")或骨髓("BM")用于经历了由放射所导致的潜在致命骨髓毒性的患者。利用标准技术收获BM和/或PSC，并且接着进行清洗和冷冻用于可能的再输注。另外，最优选地，在治疗前，对患者进行利用诊断标记抗体(例如，111铟)的诊断剂量学研究，其目的是确保治疗性标记抗体(例如，使用9()钇)不会在任何正常器官或组织中非必要地"浓縮"。在一个优选的实施方案中，本发明涉及包含编码本发明多肽序列的分离的多核苷酸。本发明进一步涉及包含至少80%，85%,90%，95%，96%,97%,98%或99%相同于本发明核苷酸序列的序列的分离的核酸。在另一个实施方案中，本发明涉及这样的分离的核酸，该核酸包含编码这样的多肽的序列，所述多肽具有与本发明氨基酸序列至少80%,85%,90%，95%,96%,97%，98%或99%相同的氨基酸序列。本发明还涵盖这样的分离的核酸，该核酸包含编码本发明多肽的序列，所述多肽具有一个或多个保守氨基酸替换。在另一个实施方案中，本发明涉及表达载体和/或宿主细胞，其包括一个或多个本发明的分离的多核苷酸。一般而言，任何类型的培养的细胞系可以用于表达本发明的ABM。在一个优选的实施方案中，将HEK293-EBNA细胞，CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，其它哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞，或植物细胞用作背景细胞系以产生本发明的被改造的宿主细胞。本发明的ABMs的治疗功效可以通过将它们在这样的宿主细胞中产生来得以增加，所述宿主细胞还表达编码具有糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该多肽选自由下列各项组成的组具有卩(1,4)-丛乙酰葡糖胺转移酶111活性的多肽；具有a-甘露糖苷酶n活性的多肽；和具有p-(l，4)-半乳糖基转移酶活性的多肽。在一个实施方案中，该宿主细胞表达具有(3(l,4HV-乙酰葡糖胺转移酶m活性的多肽。在另一个实施方案中，该宿主细胞表达具有p(i,4)-7V-乙酰葡糖胺转移酶m活性的多肽和具有a-甘露糖苷酶n活性的多肽。在再一个实施方案中，该宿主细胞表达具有P(1,4)#乙酰葡糖胺转移酶11席性的多肽，具有a-甘露糖苷酶II活性的多肽和具有P-(l,4)-半乳糖基转移酶活性的多肽。该多肽将以足够修饰ABM的Fc区域中寡糖量来表达。备选地，可改造该宿主细胞以获得糖基转移酶，如a(1-6)岩藻糖基转移酶，减少的表达。在优选的实施方案中，具有GnT-III活性的多肽是包括高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。在另一个优选的实施方案中，在一定宿主细胞中表达本发明的ABMs导致了具有增加的Fc受体结合亲和性和增加的效应子功能的ABMs，所述宿主细胞表达编码具有GnT-ni活性的多肽的多核苷酸。因此，在一个实施方案中，本发明涉及这样的宿主细胞，所述宿主细胞包括(a)包括编码具有GnT-III活性的多肽的序列的分离的核酸；和(b)编码本发明的ABM的分离的多核苷酸，所述ABM诸如嵌合的，灵长类化或人源化的抗体。在优选的实施方案中，具有GnT—ni活性的多肽是包括GnT—III的催化结构域的融合多肽，并且该高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II的定位结构域。产生这样的融合多肽的方法和使用它们产生具有增加的效应子功能的抗体的方法公开于美国临时专利申请号60/495,142和美国专利申请发明者克劳迪娅·费拉拉科勒,巴勃罗·乌马纳,彼得·布伦克尔,彼得·松德尔曼,费奥纳·斯图尔特申请人:格黎卡特生物技术股份公司