专利名称：Vegf－b/受体复合物及其应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及血管内皮生长因子-B(VEGF-B)和Flt-1受体的复合物，涉及使用这种复合物诱导或拮抗VEGF-B介导的细胞应答的方法，涉及用于鉴别VEGF-B和/或VEGF-B类似物的检测试剂盒，还涉及与VEGF-B/Flt-1复合物结合的分离的结合配对物如抗体。
血管内皮生长因子(VEGF或VEGF-A；有时也称作血管通透因子或VPF)是PDGF家族的一种促血管生成生长因子，它通过两种内皮受体酪氨酸激酶(RTK)即Flt-1(也称作VEGFR-1)(Shibuya等，癌基因，5519-524(1990)；de Vrie等，科学，255989-991(1992)]和Flk-1/KDR(也称作VEGFR-2)[Matthews等，美国科学院院刊889026-30(1991)；Terman等，生物化学生物物理研究通讯，1871579-86(1991)；Millauer等，细胞，72835-46(1993)]起作用。这些受体似乎在内皮细胞生长和分化的调节以及在成熟内皮功能的保持方面起关键性作用[Shalaby等，自然，37662-66(1995)；Fong等，自然，37666-70(1995)]。在血管系统的形成和保持以及生理性和病理性血管生成中需要VEGF和其高亲和性受体Flt-1和KDR/flk-1。
胎盘生长因子(PlGF)[Maglione等，美国科学院院刊，889267-71(1991)]是Flt-1 RTK的另一种配体[Park等，生物化学杂志，26925646-54(1994)]。它也是PDGF家族成员并且与VEGF结构上相关，但是它的生物学功能目前尚不完全清楚。
VEGF-B是一种内皮细胞的生长因子，它清楚地描述在Olofsson等的文章，“血管内皮生长因子B，一种新的内皮细胞生长因子”，美国科学院院刊，932576-81(1996)中。象VEGF和PlGF一样，VEGF-B是PDGF生长因子家族的一个成员，并与它们共享很大程度的结构相似性，如一组保守的半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基形成二硫键，参与该分子的同二聚化和异二聚化。但是，VEGF-B与VEGF仅有约40％-45％的序列相似性，与PlGF仅有约30％的序列相似性。现已发现VEGF-B与VEGF在多种组织中共表达，在心脏和骨骼肌组织中特别丰富。它促进内皮细胞的有丝分裂和增殖，并且似乎在内皮组织的生长和血管生成中起作用。VEGF-B在体外和体内均能增强低浓度的VEGF的促分裂原性活性。
本发明基于下述发现，即VEGF-B能够与Flt-1受体酪氨酸激酶的胞外功能域结合形成生物活性的复合物，所述的复合物介导有用的细胞应答和/或拮抗不希望的生物学活性。
本文中的VEGF-B的氨基酸序列请参照Eriksson等的PCT申请出版物WO96/26736中所述的人VEGF-B186的序列(Genbank数据库登录号U52819)。Flt-1的氨基酸或核苷酸序列请参照Shibuya等，癌基因，5519(1990)中所述的序列(EMBL数据库登录号X51602)。VEGF-B和/或VEGF-B类似物与Flt-1受体或其类似物的结合亲和性根据Lee等，美国科学院院刊931998(1996)中所述的程序进行测试。Olofsson等，美国科学院院刊932576-81(1991)描述了一种用于分析内皮细胞增殖的有用方法。
根据本发明的一个优选方面，本发明涉及一种用于鉴别具有与VEGF-B基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性的VEGF-B类似物的方法，所述的方法包括如下步骤(a)根据一种含有受体蛋白的样品，所述的受体蛋白选自(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链，或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并且由在严格条件下与Flt-1的核苷酸1-1293的核酸序列杂交的核酸所编码的多肽链；(b)将步骤(a)中的样品与候选的VEGF-B类似物接触；以及(c)检测候选的VEGF-B类似物与步骤(a)的受体蛋白之间的特异结合。
据信VEGF-B与细胞表面的受体结合涉及VEGF-B二聚体与所述的受体结合，从而导致该受体的二聚化及该受体的自磷酸化，随后形成细胞内信号传导并在合适的条件下产生细胞应答如血管发生。
含有受体蛋白的样品可以是例如在正常表达该受体的细胞的条件培养基中天然产生的可溶性Flt受体。经蛋白裂解而从细胞天然脱落的组织样品或组织液也可以用做受体样品。
通过本发明这一方面鉴别的VEGF-B类似物可以是小分子，例如蛋白质或肽或者非蛋白类化合物如DNA或RNA。类似物也可包括与毒素和药物或放射性同位素连接的VEGF-B或衍生物(包括但不限于VEGF-B单体或二聚体的片段)，它们可以靶向肿瘤内皮细胞上表达和正调节的Flt-1。通过类似于Kim等，自然，362(6243)841-44(1993或Aiello等，新英格兰医学杂志，331(22)1480-87(1994)中所述的技术，这类分子可用于拮抗或抑制不希望的VEGF-B诱导的细胞应答如肿瘤诱导的血管发生、银屑病或视网膜病。
分离VEGF-B/Flt-1复合物的一个程序涉及使用Flt-1受体和免疫球蛋白G(IgG)的融合蛋白，随后进行Sepharose A结合。替代使用Sepharose A的方法包括使用离子交换层析、凝胶过滤或亲和层析。含有受体/IgG融合蛋白的条件培养基可以与来自用编码VEGF-B配体或其类似物的DNA转染的细胞的条件培养基、来自天然表达该配体的条件培养基或含有候选的配体类似物的溶液相互作用。
根据本发明的另一个优选的方面，本发明涉及一种用于鉴别具有与VEGF-B基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性的VEGF-B类似物，所述方法包括下述步骤(a)提供一种含有能表达一种表面受体蛋白的细胞的样品，所述的表面受体蛋白具有结合VEGF-B的亲和性并选自如下一组(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；(b)将所述的细胞与候选VEGF-B类似物接触；以及(c)检测VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生。这种可检测的细胞应答的例子包括内皮细胞增殖、血管发生、受体的酪氨酸磷酸化作用以及细胞迁移。
表达细胞表面受体蛋白的细胞可以是天然表达该受体的细胞，或者可以是用受体转染而表达该受体的细胞。可将来自培养这种细胞的条件培养基通过Sepharose A柱或基质以固定化受体，或者在ELISA试验中，受体可以固定化在纤维素皿上或吸收在塑料上。然后将含有来自表达配体的细胞的条件培养基的第二种溶液通过这种固定化的受体。如果需要，配体可放射性标记从而便于通过放射性分析技术测定所结合的配体的量。这种分析可用于筛选Flt-1受体过量表达的病症，即通过检测与对照相比所结合的放射性增加而筛选。这一方法学也可用于筛选竞争性VEGF-B类似物的存在，即通过检测与对照相比所结合的放射性降低而筛选，这种降低表示试验中所用的放射性标记的VEGF-B配体与未经标记的潜在类似物之间有竞争。
或者，前述分析可反过来固定化VEGF-B配体或候选的类似物并将固定化的配体与来自表达受体的细胞的条件培养基接触。
根据本发明的另一方面，本发明涉及用于鉴别样品中VEGF-B或VEGF-B类似物的试剂盒，所述的试剂盒包括(a)一种适于接受样品并含有选自如下一组的受体蛋白的容器(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；和(b)用于检测VEGF-B或候选VEGF-B类似物与所述容器中所含的受体蛋白之间的相互作用的装置，其中VEGF-B或候选VEGF-B类似物属于所述容器中的样品的一部分。所述的检测装置可以包括例如用于检测VEGF-B或VEGF-B类似物与所述的受体蛋白的特异性结合作用的装置或用于检测VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生的装置。
本发明的另一方面涉及一种分离的配体—受体复合物，包括两种分子，一种分子是配体并包括VEGF-B的至少1-115位氨基酸或其受体结合类似物，第二种分子是受体并选自如下一组(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链。优选地，配体是VEGF-B，受体是也具有结合VEGF-A和PlGF亲和性的Flt-1受体。
配体或复合物的分离和纯化可以通过常规的程序完成，例如根据标准参考文献如Harlow等，抗体实验手册，冷泉港实验室出版社(1988)和/或Marshak等，蛋白质纯化和鉴定的策略，冷泉港实验室出版社(1996)中所述的技术用单克隆抗体进行免疫亲和纯化。针对各个配体或复合物的合适的抗体可以通过常规技术产生。
可使用无细胞的复合物在体内或体外与VEGF-B竞争结合细胞表面受体或防止在配体结合后结合细胞的受体的二聚化。这种无细胞复合物包括至少一种受体分子，例如可溶的FLT(sFLT)，以及一个VEGF-B二聚体分子，VEGF-B类似物二聚体分子或混合的VEGF-B/VEGF-B类似物二聚体分子，以便二聚体的一个分子可以与复合物中的受体分子结合，二聚体的另一个分子具有游离的结合位点以与细胞表面受体结合。
本发明的再一方面提供了一种分离的结合配对物，其对一种配体—受体复合物上的一个表位具有结合亲和性，所述的复合物包括与下述细胞表面受体的配体结合功能域具有特异性结合作用的VEGF-B蛋白或其类似物，所述的细胞表面受体为(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其
VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；其中所述的结合配对物对未复合的VEGF-B或VEGF-B类似物几乎没有结合亲和性。优选地，结合配对物对未复合的所述细胞表面受体蛋白或其受体类似物也几乎没有结合亲和性。结合配对物可以是与这种生长因子/受体复合物反应或识别这种生长因子/受体复合物的抗体。可使用多克隆抗体或单克隆抗体，但优选单克隆抗体。这种抗体可用标准技术制备，并筛除那些与受体或配体单独结合的抗体。
本发明的另一方面涉及根据上述方法获得的VEGF-B类似物在如下方面中的应用，所述的方面为(i)拮抗VEGF-B与细胞表面受体的结合，或(ii)拮抗VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生。优选的VEGF-B类似物包括一种抗体，所述的抗体具有与(i)具有结合VEGF-B亲和性的一种细胞表面受体的配体结合功能域，或(ii)VEGF-B的受体结合功能域或其受体结合类似物的结合的特异性。
希望的是，具有结合VEGF-B亲和性的细胞表面受体的配体结合功能域显示与Flt-1的1-347位残基至少30％、优选至少35％的氨基酸相同性，特别优选地与其相应。希望的是，VEGF-B类似物的受体结合功能域显示与VEGF-B的1-115位氨基酸残基至少50％、优选至少65％的序列相同性，特别优选地与其相应。
本发明的再一方面涉及选自如下一组的受体蛋白(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；在拮抗(a)VEGF-B与细胞表面受体的结合，或(b)VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生的方法中的应用。
所述的多肽链与细胞表面受体竞争VEGF-B并束缚可用的VEGF-B，从而防止其与细胞表面受体有效地相互作用以及诱导VEGF-B介导的细胞应答。合适的肽链可以是如Kendall等，美国科学院院刊9010705-709(1993)中所述的受体的可溶形式(sFLT)。
另外，本发明的一个方面是提供一种用于拮抗VEGF-B与细胞表面受体结合的方法，所述的方法包括提供一种蛋白，所述的蛋白具有结合Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列或其VEGF-B受体结合序列变体的特异性，并且所述的蛋白与VEGF-B的残基1-115具有至少50％、优选至少65％氨基酸序列相同性，从而当将该蛋白提供给表达所述细胞表面受体的细胞时，其能与所述受体特异地相互作用，从而基本上抑制VEGF-B与所述受体的结合。该蛋白可以是根据上述方法获得的VEGF-B类似物。
根据本发明的再一方面，提供了包括这种生长因子/受体复合物的药物制剂。
本发明的又一方面还提供了一种治疗以Flt-1细胞表面受体的过量表达为特征的疾病状态的方法，所述的方法包括给予患有这种疾病的患者受体结合有效量的VEGF-B或根据上述方法获得的VEGF-B类似物。
当受体蛋白包括非Flt-1残基1-347但仍显示结合VEGF-B的亲和性的多肽链时，其应具备与Flt-1残基1-347至少30％、有利地至少35％、优选地至少65％、特别优选地至少90％、最特别优选至少95％的氨基酸相同性。有用的VEGF-B类似物应显示与VEGF-B至少50％、优选地至少65％、特别优选地至少90％、最特别优选地至少95％的序列相同性。
附图的简要描述本发明以下将参照举例性实验进一步描述，其结果示于附图中，其中
图1是Flt-1免疫沉淀物的抗PTyr探查的Western印迹，Flt-1免疫沉淀物来自表达Flt-1的NIH3T3细胞，所述细胞用来自分别用人VEGF和VEGF-B的表达载体转染的293 EBNA细胞的条件培养基刺激。
图2(a)和(b)分别是SDS-PAGE电泳凝胶的长曝光和短曝光照片，示出35S-甲硫氨酸标记的鼠VEGF-B186与Flt-1-IgFc融合蛋白的结合。
图3是VEGF-B165、VEGF-B167、VEGF-B186和VEGF-C与可溶性VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3结合的SDS-PAGE分析。
图4是使用NIH3T3 Flt-1细胞用mVEGF-B186从VEGFR-1/Flt-1顶替[125I]-hVEGF-B165的曲线。
图5是用mVEGF-B164在NIH-VEGFR-1/Flt-1上的竞争曲线。
图6示出用过量VEGF165从可溶性VEGFR-1顶替VEGF-B167和VEGF-B186。
图7是示出VEGF-B186的蛋白裂解过程的SDS-PAGE分析。
图8是示出VEGF-B186的纤溶酶消化的SDS-PAGE分析。
图9是示出用于突变分析的VEGF-B167的突变过程及受体结合表位突变体与可溶性VEGFR-1的结合的示意图。
图10a-图10c示出VEGF-B的半胱氨酸突变的SDS-PAGE分析。
图11示出在10μg/ml肝素存在下标记的VEGF-B167突变体的SDS-PAGE分析。
图12示出来自在50ng/ml hVEGF-B186存在下保温的牛微血管内皮(BME)细胞的RNA的Northern印迹分析。
图13a和13b示出从在hVEGF-B186存在下保温的BME细胞制备的细胞提取物的信号识别蛋白体的受体分析(zymographicanalysis)和反向信号识别蛋白体的受体分析。
一般方法细胞培养物和材料Sf-9细胞在补加0.1％多聚f-68用于悬浮培养的Sf-900 II SFM(Gibco BRL，Life Technologies)中保持。
High Five细胞(Invitrogen)在Ex-cell 400培养基(JHR BiosciencesUK)中保持。
293-EBNA，COS-7，293-T和NIH3T3-Flt-1细胞(Sawano等，细胞生长及分化7，213-21(1996))在补加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s最小基本培养基(DMEM)中培养。NIH3T3 Flt-1在用200μg/ml新霉素的持续筛选下保持。
牛肾上腺皮质衍生的微血管内皮(BME)细胞在1.5％明胶包被的组织培养瓶上培养于补加15％供体小牛血清的MEMα修饰培养基(Gibco AG，Basel，瑞士)中。
PAE-KDR细胞(Waltenberger等，生物化学杂志26926988-95(1994))在加有10％FCS的Ham′s F12培养基中培养。
受体Ig-融合体及表达载体的构建a)pIg-VEGFR-1编码与人IgG1 Fc融合的VEGFR-1前5个类Ig功能域的表达质粒pIg-VEGFR-1通过将来自pLTR Flt1的HindIII片段(编码VEGFR-1的1-549位氨基酸)连接进pIgplus载体(Ingenius)而构建。在克隆前用XhoI和XbaI消化pIgplus载体，平末端化并重新连接以校正用于融合蛋白生产的读框。
b)spIg-VEGFR-2为构建spIg-VEGFR-2，用人胎肺cDNA文库(Clontech)作为模板，经聚合酶链反应(PCR)扩增编码VEGFR-2前4个类Ig功能域的cDNA。使用的引物为5′-atggtacccccaggctcagcatacaaaaagac-3′(SEQ ID NO.1)和5′-gcgtctagagggtgggacatacacaaccag-3′(SEQ ID NO.2)，扩增的片段用Kpn-1和Xba-1裂解并克隆到信号pIg载体(Ingenius)的相应位点中。
c)mVEGF-B186pFASTBAC1用EcoRI裂解mVEGF-B186cDNA(Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996))并亚克隆进pFASTBAC1(Gibco BRL，LifeTechnologies)。用mVEGF-B186pSG5作为模板，经PCR将(His)6标记(和一个肠激酶位点)引入缺乏信号序列的N-末端，使用的引物为5′-atcgagatcttcatcaccatcaccatcacggagatgacgatgacaaacctgtgtcccagttt-3′(SEQ ID NO3)和5′-caagggcggggcttagagatctagct-3′(SEQ ID NO4)(两个引物都含有Bgl II位点)。扩增的片段用Bgl II裂解并克隆进pAcGP67A(Pharmingen，U.S.A.)的GP-67的信号序列同一读框内的BamHI位点。
d)hVEGF-B186pPIC-9使用正向引物5′-ggaattccccgcccaggcccctgtc-3′(SEQ ID NO5)和反向引物5′-ggaattcaatgatgatgatgatgatgagccccgcccttggc-3′(SEQ ID NO6)经PCR扩增hVEGF-B186。将含有C-末端(His)6标记的扩增的产物克隆进pPIC-9(Invitrogen)的EcoRI位点，与α交配因子信号序列同一读框。
所有序列的真实性经测序证实。
蛋白质表达和纯化为进行使用Sf9和High Five细胞的杆状病毒生产，将mVEGF-B重组噬斑纯化并扩增(Summersdeng，Tex.Agric.Exp.Stn.Bull.15551-57(1988))，用Ni-NTA超流动树脂(Qiagen)纯化相应表达的蛋白质以及巴斯德毕赤氏酵母(菌株GS115)表达的hVEGF-B186。
为进行定量免疫印迹，将来自感染的昆虫细胞的培养基与作为标准样品的1-30ng纯化的m(His)6VEGF-B186一起在还原性12％SDS-PAGE上电泳并用抗m(His)6VEGF-B186的亲和纯化的抗体进行印迹。
转染，免疫沉淀及可溶性受体结合使用磷酸钙沉淀法用hVEGF165pSG5，mVEGF167pSG5，mVEGFkEx1-5pSG5，mVEGF186pSG5，VEGFR-1 pIg和VEGFR-2 pIg转染293-T细胞或COS-7细胞。VEGFR-3 EC-Ig pREP7(得自Katri Pajusola博士)和hVEGF-CΔNΔC(His)6pREP7(Joukov等，EMBOJ.163898-911(1997))在293-EBNA细胞中类似地表达。在用100μCi/ml Promix TM L-35 S(Amersham)转染48小时后将表达生长因子的细胞代谢标记5-6小时(除非另有说明)，并收集培养基。当指出时将肝素(10或50μg/ml)加入到标记的培养基中。用2μg/mlVEGF抗体MAB 293(R&D Systems)免疫耗竭代谢标记的培养基(除了来自VEGF感染的培养基)中内源性表达的VEGF及异二聚体。对于可溶性受体，感染后48小时用含0.1％BSA的DMEM更换该培养基并再保温12小时。将受体-Ig融合体(在某些情况下其量在用Colloidal.Comassie(Novex，San Diego)染色的10％SDS-PAGE上定量)和来自空白转染的细胞的等体积的培养基吸收到蛋白质-A-Sepharose上。代谢标记的生长因子与受体Ig融合体在+4℃保温3小时，用冰冷的结合缓冲液(PBS 0.5％BSA，0.02％Tween 20和1mM PMSF)洗3次，用含1mM PMSF的PBS洗2次。
抗体产生根据标准程序用纯化的m(His)6VEGF-B186免疫兔子并收集得到的抗血清。如Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996)中所述产生抗mVEGF-B N-末端肽的抗血清。将该抗血清对共价结合至CNBr活化的Sepharose CL-4B(Pharmacia)的m(His)6VEGF-B186亲和纯化。
实施例1程序表达人Flt-1受体蛋白的NIH3T3细胞培养物首先在于DMEM中的0.5％胎牛血清(FCS)中饥饿24小时，然后在来自己分别用pREP7-hVEGF-A或pREP7-hVEGF-B167转染的293 EBNA细胞培养物的条件培养基中于37℃刺激该细胞5分钟。来自用pREP7单独转染的293 EBNA细胞的条件培养基用作阴性对照(空白)。所有条件培养基均含1μg/ml肝素。刺激后，在冰冷的含0.1mM原钒酸钠的PBS中洗细胞并在含2mM原钒酸钠、1mg/ml抑蛋白酶肽和1mM PMSF的RIPA缓冲液中裂解。将裂解物超声波化，离心澄清并与抗flt-1抗体SC316(Santa Cruz)在冰上保温2小时。得到的免疫复合物用蛋白质A-琼脂糖珠沉淀收集。用裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物3次，在6％SDS PAGE上电泳分离并转移至硝基纤维素滤膜上。用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗磷酸酪氨酸抗体RC2OH(TransductionLabs)探查滤膜并用ECL(Amersham)检测免疫反应性。该抗磷酸酪氨酸抗体能识别Flt-1上的磷酸化的酪氨酸并使得能观察到Flt-1受体的自磷酸化。
结果如图1所示，该图是从表达Flt-1的NIH3T3细胞免疫沉淀的Flt-1的抗PTyr探查的Western印迹，该NIH3T3细胞用来自VEGF载体、空载体或人VEGF-B167pREP7载体转染的293 EBNA细胞的补加肝素的条件培养基进行刺激，对于VEGF-A和VEGF-B均观察到较弱但仍是阳性的酪氨酸磷酸化条带，表明这些配体均能引起Flt-1的自磷酸化。相反，在该图中部的空白(-)泳道没有自磷酸化作用。
这一数据显示人VEGF-B与Flt-1受体结合并诱导其自磷酸化，表明Flt-1也是人VEGF-B167的受体。
实施例2程序受体IgG融合蛋白将编码Flt-1的前3个免疫球蛋白(Ig)环的cDNA剪接进人IgG重链的Fc区并克隆进载体pREP7(Invitrogen)，产生质粒pREP7 Flt-1-IgFc。以类似的方式构建pREP7 KDR-IgFc。本实验中所用的Flt-1-Ig Fc和KDR-Ig Fc cDNA是称为pBJFltKT3的质粒构建物的RT-PCR产物。使用磷酸钙方法，用得到的质粒转染293 EBNA细胞，转染后48小时收集产生的条件培养基。
35S-标记的mVEGF-B186的受体IgG沉淀编码鼠VEGF-B186的质粒pSJ5(Stratagene)(pSJ5 VEGF-B186)经电穿孔转染进COS细胞，并用35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸标记细胞10小时。35S-标记的hVEGF-A16S用作受体结合的阳性对照并在用pREP7 VEGF-A转染并如上标记的293 EBNA细胞中产生。在4℃、持续搅拌下将约1ml的含Flt-1-IgFc或KDR-IgFc的条件培养基与40μl 50％蛋白质A琼脂糖浆液保温1小时。来自空白转染的细胞的条件培养基用作阴性对照。离心收集蛋白质A琼脂糖珠，在室温、轻搅拌下与1ml含有35S-标记的mVEGF-B186或VEGF(-A)的条件培养基在结合缓冲液(PBS，0.5％BSA，0.02％Tween 20，1μg/ml肝素)中保温3小时。离心收集蛋白质A琼脂糖珠，并在冰冷的结合缓冲液中洗2次，在20mM tris pH7.5中洗1次，在SDS样品缓冲液中煮沸并在10％PAGE上电泳。
结果结果示于图2(a)和(b)，其分别是SDS-PAGE凝胶的长曝光照片和短曝光照片。在该图中，泳道1示出免疫沉淀的鼠VEGF-B186；泳道2示出Flt-1-Ig，mVEGF-B186；泳道3示出Flt-1-Ig，空白；泳道4示出空白，mVEGF-B186；泳道5示出KDR-Ig，mVEGF-B186；泳道6示出KDR-Ig，空白。为确定VEGF-B186是否是Flt-1的配体，将含有该因子的cDNA的质粒与编码VEGF(-A)的质粒一起或者表达载体单独转染进哺乳动物细胞，并用35S氨基酸标记蛋白质。用结合至蛋白质A琼脂糖珠的Flt-1-IgFc或KDR-IgFc沉淀这些细胞的条件培养基，用Flt-1-IgFc从VEGF-B186条件培养基中沉淀出一32kDa条带(在图2(a)中由位于上面的箭头指示)。这一与免疫沉淀的VEGF-B186共迁移的条带在模拟转染的细胞的Flt-1-IgFc沉淀物及由蛋白质A琼脂糖沉淀的VEGF-B186沉淀物中没有出现。用KDR-IgFc也发现了少量这种32kDa条带沉淀物。
该数据清楚示出鼠VEGF-B186与人Flt-1受体间形成复合物。
如图2(a)和2(b)所示，Flt-1-IgFc和KDR-IgFc还沉淀分子量低一些的物质，但是这些条带也见于模拟转染的细胞的条件培养基中，其被认为代表由COS细胞产生的内源性因子，可能是VEGF(-A)。在这些条带中，由括号中的箭头所指示的条带也可能部分代表与VEGF-B相关的物质。
实施例3测试VEGF-B与VEGFR-1，VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合为确定VEGF-B是否是VEGFR-1，VEGFR-2或VEGFR-3的配体，用表达VEGF165、mVEGF-B167、mVEGF-B186或VEGF-C的表达质粒转染293T细胞，并且在50μg/ml肝素存在下代谢标记蛋白VEGF165和mVEGF-B167，收集培养基。
除VEGF转染之外的所有条件培养基均预清除内源性VEGF和VEGF/VEGF-B异二聚体，然后用特异性抗体免疫沉淀各个蛋白或者将其与结合在蛋白质A-琼脂糖(PAS)上的含有Flt-1的前5个类Ig功能域的可溶性受体Ig融合蛋白结合。在还原条件下用SDS-PAGE分析沉淀的配体。对于每种配体沉淀约使用50ng可溶性受体。如图3所示，两种VEGF-B同种型均特异结合VEGFR-1，而不结合VEGFR-2或VEGFR-3。VEGFR-2和VEGFR-3的功能性分别通过与VEGF和VEGF-C的结合试验证实。这一试验表明VEGF-B特异结合VEGFR-1/Flt-1，使得其被鉴别为继VEGF和PlGF之后的第三个VEGFR-1的配体。
用特异性抗体及VEGFR-1从mVEGF-B186条件培养基中沉淀出32kD和16kD的两个条带，该32kD条带相应于mVEGF-B186的糖基化分泌形式(Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996))。该16kD形式显然是蛋白质裂解加工的产物，其将在以下部分详细描述。
实施例4VEGF-B/VEGFR-1结合的进一步检验用NIH3T3细胞检验VEGF-B与细胞表面表达的VEGFR-1的能力。与用可溶性受体获得的数据一致，来自mVEGF-B186感染的而不是模拟感染的High Five细胞的条件培养基与125I-VEGF竞争结合NIH3T3-Flt1，如图4所示。使用定量免疫印迹测算mVEGF-B186的半数最大抑制浓度为3ng/ml，而重组mVEGF164以1.5ng/ml的半数最大抑制浓度与碘化hVEGF165竞争(图4和图5)。这一作用是特异于VEGFR-1的，因为用PAE-KDR细胞没有观察到竞争作用。因此很明显的是，尽管mVEGF-B186与VEGF121一样缺少见于VEGF165中的C-末端碱性残基，但是其仍与NIH3T3-Flt1细胞上的VEGFR-1结合。还发现VEGF-B同样能很好地结合含有VEGFR-1的3个N-末端类似Ig功能域(残基1-347)的VEGFR-1Ig融合体以及含有5个类似Ig功能域的VEGFR-1Ig融合体。
由于凝聚及蛋白质稳定性问题，纯化的His标记的VEGF-B(人和小鼠(His)6VEGF-B186，以及覆盖人和小鼠(His)6VEGF-B的外显子1-5的C-末端缺失突变体)仅在高浓度与碘化的VEGF竞争结合VEGFR-1。
实施例5VEGF竞争研究
如结合试验中所述标记和预清除在转染的293-T细胞中表达的mVEGF-B167和mVEGF-B186，唯一的区别是对于mVEGF-B167在标记的培养基中使用10μg/ml肝素。当指出时，向结合反应物中加入2μg重组hVEGF165作为非标记的竞争剂。将等体积的代谢标记的因子与可溶性VEGFR-1结合或用亲和纯化的N-末端肽VEGF-B抗体免疫沉淀2小时，用冰冷的10mM Tris-HCl pH8.0，1％TritonX-100，25mM EDTA，1mM PMSF洗两次，用含有1mM PMSF的PBS洗两次。用15％SDS-PAGE分析沉淀物。如图6所示，这两种同种型以及mVEGF-B167与VEGFR-1的结合由过量的rhVEGF导致消失，由此表明VEGF-B与VEGFR-1的结合可被过量的VEGF竞争。这一试验结果证实相互作用的特异性以及提示VEGF和VEGF-B在受体上的相互作用位点是重叠的、部分重叠的或至少是紧密相邻的。
实施例6对与细胞表面受体的结合的竞争为进行该竞争试验，用表达天然mVEGF-B186的重组病毒(mVEGF-B186pFASTBAC1)和模拟病毒感染High Five细胞，感染48小时后收集培养基并立即应用或于-70℃冷冻。
使用Iodo-Gen试剂(Pierce)用125I标记重组mVEGF164(得自Herbert Weich博士)或h VEGF165(R&D体系或Peprotech)，并在PD-10柱(Pharmacia)上凝胶过滤纯化。mVEGF和hVEGF的比活分别是2.2×105cpm/ng和1.0×105cpm/ng。为进行结合分析，将PAE-KDR和NIH3T3-Flt1细胞种在用0.2％明胶包被的24孔板中，生长至铺满，用冰冷的结合缓冲液(对于PAE-KDR为Ham’s F12，0.5mg/ml BSA，10mM Hepes pH7.4，对于NIH3T3-Flt1为DMEM，0.5mg/ml BSA，10mM Hepes pH7.4)洗两次，在含有递增量的未标记VEGF或来自VEGF-B感染或模拟感染的昆虫细胞的培养基的结合缓冲液中与0.5ng/ml[125I]-VEGF保温，同时进行3份重复试验。在+4℃保温2小时后，用冰冷的结合缓冲液洗细胞三次，用含有0.5mg/mlBSA的PBS洗两次，并在0.5M NaOH中裂解细胞。用γ计数器测定溶解的放射性。图4示出使用NIH 3T3 Flt-1细胞用mVEGF-B186从VEGFR-1/Flt1置换[125I]-hVEGF165，图5示出mVEGF164在NIH-VEGFR-1/Flt-1上的竞争。
在一类似的试验中，发现mVEGF-B186不与[125I]-VEGF竞争PAE-KDR细胞上的VEGFR-2。
使用纯化的重组(His)6VEGF-B186的竞争分析表明仅有一小部分该蛋白是生物学活性的，因为天然的(自身的信号序列)未纯化的VEGF-B186更有效地与碘化的VEGF竞争VEGFR-1结合。
实施例7VEGF-B186的蛋白裂解加工在COS细胞中表达的mVEGF-B186被O-连键糖基化，这种糖基化将表观分子量从胞内型的25kDa增至分泌型的32kDa。如上所述，当mVEGF-B186在293-T细胞中表达时，除了32kDa型外还出现了更快的迁移型16kDa条带。当标记COS细胞较长时间时，在来自该细胞的条件培养基中也观察到该条带。进行下述试验以比较在293-T细胞中表达的由mVEGF-B186和mVEGF-B167形成的二聚体和C-末端截短型mVEGF-BkEx1-5的迁移以及它们结合sVEGFR-1的能力。含有C-末端Kemptide基序的mVEGF-B外显子1-5突变体(Mohanraj等，蛋白质表达及纯化，8175-82(1996))，mVEGF-BkEx1-5pSG5由聚合酶链反应(PCR)产生。
在293-T细胞中表达VEGF-BkEx1-5、VEGF-B167和VEGF-B186。代谢标记该细胞，在10μg/ml肝素存在下标记模拟转染的和VEGF-B167转染的细胞。将收集的培养基预清除VEGF和异二聚体并用亲和纯化的N-末端VEGF-B肽抗体免疫沉淀或与VEGFR-1结合。在非还原条件下用SDS-PAGE分析结合的配体，结果如图7所示。
可以看出mVEGF-B186以三种不通的二聚体多肽迁移，最短的形式为34kDa，中间的形式为48kDa，全长型为60kDa。34kDa条带的迁移稍快于mVEGF-BkEx1-5，提示潜在的裂解位点更接近C-末端，可能位于所翻译的外显子6A的起始处(Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996))。
上述试验清楚表明较长的mVEGF-B186同种型被蛋白裂解加工，产生含有用于结合VEGFR-1的受体结合表位的较短形式。mVEGF-B186的这种蛋白裂解加工的功能方面尚未完全清楚。由于该mVEGF-B186同种型稳定地从细胞中分泌，所以蛋白裂解加工似乎不是调节该蛋白的释放或可利用性的一个方式。
如图7所示，免疫沉淀形式和受体结合形式之间的VEGF-B信号的相对密度的比较表明信号强度似乎与二聚体中的加工的亚基的水平相关，由此提示加工导致对受体的亲和性增加。据信48kDa条带由加工的单体(16kDa)和全长单体(32kDa)形成的二聚体组成。34kDa条带由各16kDa的两个加工的单体形成的二聚体组成。明显的是包含由VEGF-B加工产生的16kDa类似物的这两种二聚体均比由两个全长32kDa单体形成的≈60kDa二聚体更好地结合VEGFR-1受体。
实施例8纤溶酶裂解进行下述试验以确定在COS细胞中表达的全长形式的VEGF-B186是否可以通过加入纤溶酶而裂解，并且这种裂解是否会影响VEGFR-1结合。这可能是在血管生成过程中的基底膜降解位点的生理学机制。
用mVEGF-B186转染COS-7细胞，代谢标记75分钟，将收集的培养基预清除VEGF和异二聚体。然后将培养基在37℃与0.1U/ml纤溶酶(Boehringer Mannheim)保温0、5、15、30和60分钟。加入1mM PMSF和0.1酪蛋白单位抑酶肽终止反应。用亲和纯化的N-肽VEGF-B抗体免疫沉淀培养基并也与VEGFR-1 Ig结合。沉淀的蛋白在还原条件下用SDS-PAGE分析，结果如图8所示。
与全长形式的量递减相一致的是出现了一个15kDa片段，而后是12kDa的二级片段。因此纤溶酶裂解确实发生了，但是显然没有给出与上述VEGF-B186的内源性蛋白裂解加工相同的片段。但无论如何，这一N-末端片段完全能与sVEGFR-1相互作用，提示在受体结合表位包含在对蛋白酶如纤溶酶有抗性的N-末端片段这一点上，VEGF-B类似于VEGF。
实施例9受体表位的突变分析对VEGF的VEGFR-2表位的晶体结构测定和定位分析指出一些热点氨基酸残基，对于配体—受体相互作用最重要的残基是Ile-46，Ile-83，Glu-64，Phe-17，Gln-79，Pro-85，Ile-43和Lys-84(Muller等，美国科学院院刊947192-7(1997))。这些残基参与VEGFR-1结合的程度尚不太清楚。通过带电荷氨基酸至丙氨酸的扫描诱变(Keyt等，生物化学杂志2715638-5646(1996))，提示VEGF中的VEGFR-1结合表位涉及一段酸性残基(Asp-63，Glu-64和Glu-67)，这些氨基酸残基在VEGF-B中是保守的(Asp-63，Asp-64和Glu-67)，在PlGF中保守程度较低。
为了分析在VEGF和VEGF-B之间保守的并参与VEGF/VEGFR-1结合的这些酸性氨基酸残基是否也是VEGF-B/VEGFR-1结合的关键因素，将Asp63，Asp64和Glu67突变成丙氨酸。这一突变策略示于图9，该图示意性示出野生型VEGF-B和不同的突变体。
VEGF-B167的潜在的受体表位突变体在转染的293-T细胞中表达并在50μg/ml肝素存在下代谢标记。为了研究VEGF-B同二聚体，用VEGF抗体(MAB 293，R&D Systems)免疫耗竭内源性VEGF和由VEGF和过量表达的VEGF-B形成的VEGF异二聚体。VEGF-B突变体或者用亲和纯化的N-末端肽抗体免疫沉淀或者与可溶性VEGFR-1 Ig结合。在还原条件下用SDS-PAGE分析沉淀物，结果明显示出前两个酸性氨基酸残基的突变和全部3个氨基酸残基的突变均不破坏VEGF-B与VEGFR-1的结合。因此基于全部3个带电荷的氨基酸残基至丙氨酸的突变或者仅前两个带电荷的氨基酸残基至丙氨酸的突变的这一数据表明保守的酸性残基不是VEGF-B与VEGFR-1结合的关键因素。
实施例10VEGF-B167中的保守的半胱氨酸的突变分析为检测保守的半胱氨酸对VEGF-B二聚体的形成的贡献以及测试基于反平行共价VEGF二聚体模型的结构预测，将半胱氨酸-51(Cys2)和半胱氨酸-60(Cys 4)突变成丝氨酸残基。在mVEGF-B167pSG5中的半胱氨酸至丝氨酸的突变体是通过采用辅助噬菌体M13KO7(Viera等，酶学方法1533-11(1987))和dut- ung- E.coli菌株RZ1032(Kunkel等，酶学方法154367-382(1987))经基于M13的体外单链诱变而产生的。进行了两种突变，即单突变体(C2S和C4S)以及双突变体(C2S，C4S)。突变策略见图9。
突变的和野生型VEGF-B167在293-T细胞中单独表达或以共转染形式以不同组合表达，并代谢标记，将培养基预清除VEGF和异二聚体。结果示于图10a-c。培养基用亲和纯化的N-末端VEGF-B抗体免疫沉淀并在非还原条件(图10a)或还原条件(图10b)下分析，或者将培养基与可溶性VEGFR-1 Ig结合(图10c)。如图10b所示，所有突变体均以大致相同的量表达。
现已发现VEGF-B167被裂解，在两种剪接变体中很有可能C-末端区相同，其由外显子1-5编码并含有半胱氨酸结和受体结合表位。野生型VEGF-B167在非还原条件下迁移成42kDa和46kDa两条带，但是仅有46kDa形式能与VEGFR-1结合(参见图2A和图3C)。据信42kDa形式相当于由异常二硫键结合在一起的二聚体，因为在不含发现于VEGF-B167的C-末端部分的附加的8个半胱氨酸的VEGF-B186或VEGF-BkEx1-5中未见这些双联体。单突变体C4S产生单体。还观察到一些迁移为42kDa条带的二聚体，其不能与受体结合。令人惊奇的是C2S突变体虽然部分作为单体产生，但是其仍能形成与受体结合的二聚体。单突变体的共转染(C2S+C4S)导致46kDa条带的量增加，恢复受体结合能力，提示可通过在未突变的半胱氨酸之间形成类似VEGF的二硫键而互补受损的二聚化作用(Potgens等，生物化学杂志26932879-85(1994))。单突变体与双突变体的共转染不能互补。
一些VEGF-B167突变体如上所述表达，并在10μg/ml肝素存在下代谢标记细胞。收集的培养基与VEGFR-1 Ig保温，并将结合的配体在非还原条件下进行SDS-PAGE，结果如图11所示。可以看出C4S突变体和双突变体C2SC4S显示残留的受体结合活性，其可以解释为可溶性受体与单体的相互作用。
因此，对VEGF-B二聚体形成起作用的保守的半胱氨酸的突变分析表明VEGF和PDGF有结构保守性。
实施例11对VEGF-B的生物学应答使用基于牛VEGFR-1序列的特异性引物的RT-PCR分析示出VEGFR-1 mRNA由牛肾上腺皮质衍生的微血管内皮(BME)和牛主动脉内皮(BAE)细胞表达。为确定VEGF-B对内皮细胞的生物学应答，将含有5μg/泳道细胞总RNA的影印膜与[32P]标记的cRNA探针杂交，该细胞总RNA从在50ng/ml hVEGF-B186存在下保温的铺满的BME细胞单层中制备。BME细胞(Furie等，细胞生物学杂志981033-41(1984))在1.5％明胶包被的组织培养瓶中于补加15％供体小牛血清的MEMα修饰培养基(Gibco AG，Basel，瑞士)中培养。将细胞因子加入到BME细胞的铺满单层中，在此之前24小时已将新鲜制备的完全培养基加入到细胞中。使用Trizol试剂(LifeTechnologies AG，Basel，瑞士)在0、1、3、9、24和48小时后制备总细胞RNA。如Pepper等，细胞生物学杂志111743-55(1990)所述进行滤膜的Northern印迹分析、UV-交联和亚甲蓝染色、体外转录、杂交和杂交后洗涤。如Pepper等，细胞生物学杂志111743-55(1990)；Pepper等，细胞生物学杂志122673-84(1993)所述从牛u-PA cDNA(Kratzschmar等，基因125177-83(1993))、人t-PAcDNA(Fisher等，生物化学杂志26011223-30(1985))和牛PAI-1cDNA(Pepper等，细胞生物学杂志111743-55(1990))制备32P-标记的cRNA探针。结果示于图12。上样RNA的完整性和均一性通过在移印和交联后用亚甲蓝染色滤膜而确定(图的下半部分)，示出了28S和18S核糖体RNA。
Northern印迹分析表明VEGF-B186(50ng/ml)增加了BME细胞中尿激酶型纤溶酶原活化剂(u-PA)mRNA和纤溶酶原活化剂抑制剂1(PAI-1)mRNA的稳定状态水平。也就是说该试验显示内皮细胞通过诱导PAI-1 mRNA和u-PA mRNA来应答VEGF-B。因此VEGF-B与其在内皮细胞上的受体的结合刺激了u-PA和PAI-1的活性，u-PA和PAI-1是胞外基质降解及细胞粘附和迁移的重要调节物。
实施例12信号识别蛋白体的受体分析及反向信号识别蛋白体的受体分析将在浓度为0、1、3、10、30和100ng/ml hVEGF-B186存在下保温的从BME细胞制备的细胞抽提物、浓度为30ng/ml的VEGF或浓度为30ng/ml的重组人bFGF(得自P.Sarmientos博士的155个氨基酸形式)如下所述进行信号识别蛋白体的受体分析及反向信号识别蛋白体的受体分析。在35mm明胶包被的组织培养皿中的BME细胞的铺满单层用无血清培养基洗两次并加入含在含胰Kunitz胰蛋白酶抑制剂(200KIU/ml)的无血清培养基中的细胞因子。保温15小时后，制备细胞抽提物并如Vassalli等，实验医学杂志1591653-68(1984)和Pepper等，细胞生物学杂志111743-55(1990)所述进行信号识别蛋白体的受体分析及反向信号识别蛋白体的受体分析。结果示于图13a-b，表明重组hVEGF-B186增加了BME细胞中的u-PA和PAI-1活性。图13a示出对BME细胞抽提物的信号识别蛋白体的受体分析，图13b示出反向信号识别蛋白体的受体分析。可以看出VEGF-B186诱导了剂量依赖型的BME细胞中的u-PA和PAI-1活性的增加。用作对照的VEGF明显没有诱导PAI-1活性，表明PAI-1快速与VEGF诱导的tPA形成复合物。这一复合物通过对VEGF处理的细胞的培养物上清进行信号识别蛋白体的受体分析而观察到。与VEGF不同(Pepper等，生物物理研究通讯189824-31(1992))，VEGF-B186不增加t-PA活性。试验表明内皮细胞应答VEGF-B是通过增加u-PA和PAI-1的合成以及增加所得蛋白的活性来进行。然而，PAI-1诱导的动力学比u-PA的动力学要快而短时，前者在1小时内诱导并在3小时观察到最大效应，而后者在9小时后诱导并且延长至48小时。这一点与用bFGF和VEGF观察到的现象一致(Pepper等，细胞生物学杂志111743-55(1990)；Pepper等，生物化学生物物理研究通讯181902-906(1991)；Mandriota等，生物化学杂志2709709-16(1995))。
实施例11和12示出重组hVEGF-B186增加BME细胞中的u-PA和PAI-1的稳定状态水平，在类似的试验中，VEGF-B186还诱导BAE细胞中的PAI-1 mRNA而不诱导u-PA mRNA。
实用性Flt-1酪氨酸激酶受体和VEGF-B和/或VEGF-B类似物之间形成受体可以用于治疗以Flt-1受体过量表达为特征的疾病，其是通过向患有这种疾病的患者给予结合Flt-1受体或拮抗受体有效量的VEGF-B或VEGF-B类似物来完成。这种以Flt-1受体过量表达为特征的疾病的一个例子是血管内皮瘤。Flt-1受体还在各种肿瘤中过量表达(Warren等，临床研究杂志95(4)1789-97(1995)；Hatva等，美国病理学杂志146(2)368-78(1995))。VEGFR-1和VEGF-B或VEGF-B类似物之间形成复合物还可用于治疗以Flt-1受体的表达不足为特征的状态，这种状态可包括正常成人内皮或者需要增加血管形成的状态。在给定情况中给药量取决于患者的特征以及疾病的性质并可以由本领域技术人员根据常规实验确定。
VEGF-B或VEGF-B类似物可以合适地经静脉内给药或者通过类似于目前VEGF或FGF的定位输送系统的定位输送系统给药。这种系统的例子包括使用质粒形式的DNA(Isner等，柳叶刀348370(1996))或使用重组腺病毒(Giordano等，自然医学2534-39(1996))。VEGF-B也可通过类似于应用于VEGF的技术以蛋白质形式提供(Bauters等，美国生理学协会，H1263-271(1994)；Asahara等，循环912793(1995))或通过使用缺陷型疱疹病毒(Mesri等，循环研究76161(1995))。小分子VEGF-B类似物可以口服给药。也可使用其它的标准送药模式如皮下或腹膜内注射。
VEGF-B蛋白/Flt-1受体复合物也可用于生产抗体，该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。通常，可使用常规的抗体生产技术产生抗VEGF-B/Flt-1复合物的抗体。例如，通过免疫接种由重组DNA表达获得的融合蛋白可以产生特异性的单克隆抗体。抗VEGF-B/受体复合物的嵌合抗体和人源化抗体也包含在本发明范围内。具体地，标记的单克隆抗体可以用于筛选以Flt-1受体的过量表达或表达不足为特征的疾病状态。这种疾病状态的例子包括血管和淋巴管的内皮细胞肿瘤如血管内皮瘤。
在本发明的诊断/预后装置的一个优选实施方案中，抗体、生长因子或受体被标记，并且三者其中之一是底物结合性的，从而可通过确定抗体和生长因子/受体复合物结合后附着于底物的标记的量来确定抗体复合物的相互作用。在一特别优选的实施方案中，该诊断/预后装置可以常规的ELISA试剂盒形式提供。
上述描述和实施例仅是举例说明本发明而不是限制本发明。由于本领域技术人员可以对所述实施方案作出不偏离本发明的实质的修改，因此本发明应被理解为包括所有落入所附权利要求范围内的变异及其等价物。
参考文献-Ferrara，N.&Davis-Smyth，T.(1997)内分泌综述18，4-25.-Risau，W.(1997)自然386，671-4-Folkman，J.(1995)自然医学1，27-31.-Barleon，B.，Sozzani，S.，Zhou，D.，Weich，H.A.，Mantovani，A.&Marme，D.(1996)血液87，3336-43.-Clauss，M.，Weich，H.，Breier，G.，Knies，U.，Rockl，W.，Waltenberger，J.& Risau，W.(1996)生物化学杂志.271，17629-34.-Fong，G.H.，Rossant，J.，Gertsenstein，M.& Breitman，M.L.(1995)自然376，66-70.-Shalaby，F.，Rossant，J.，Yamaguchi，T.P.，Gertsenstein，M.，Wu，X.F.，Breitman，M.L.& Schuh，A.C.(1995)自然376，62-66.-Shalaby，F.，Ho，J.，Stanford，W.L.，Fischer，K.D.，Schuh，A.C.，Schwartz，L.，Bernstein，A.& Rossant，J.(1997)细胞89，981-90.-Carmeliet，P.，Ferreira，V.，Breier，G.，Pollefeyt，S.，Kieckens，L.，Gertsenstein，M.，Fahrig，M.，Vandenhoeck，A.，Harpal，K.，Ebenhardt，C.，Declercq，C.，Pawling，J.，Moons，L.，Collen，D.，Risau，W.& Nagy，A.(1996)自然380，435-439.-Ferrara，N.，Carver-Moore，K.，Chen，H.，Dowd，M.，Lu，L.，O’Shea，K.S.，Powell-Braxton，L.，Hilan，K.J.& Moore，M.W.(1996)自然380，438-442.-Pepper，M.S.，Ferrara，N.，Orci，L.& Montesano，R.(1991)生物化学生物物理研究通讯181，902-906.-Chapman，H.A.(1997)细胞生物学当前观点9，714-724.-Bacharach，E.，Itin，A.& Keshet，E.(1992)美国科学院院刊89，10686-10690.-Maglione，D.，Guerriero，V.，Viglietto，G.，Delli-Bovi，P.& Persico，M.G.(1991)美国科学院院刊88，9267-9271.-Olofsson，B.，Pajusola，K.，Kaipainen，A.，Von Euler，G.，Joukov，V.，Saksela，O.，Orpana，A.，Pettersson，R.F.，Alitalo，K.& Eriksson，U.(1996)美国科学院院刊93，2576-2581.-Grimmond，S.，Lagercrantz，J.，Drinkwater，C.，Silins，G.，Townson，S.，Pollock，P.，Gotley，D.，Carson，E.，Rakar，S.，Nordenskjold，M.，Ward，L.，Hayward，N.& Weber，G.(1996)基因组研究6，124-131-Joukov，V.，Pajusola，K.，Kaipainen，A.，Chilov，D.，Lahtinen，I.，Kukk，E.，Saksela，O.，Kalkkinen，N.& Alitalo，K.(1996)EMBO J.15，290-298.-Lee，J.，Gray，A.，Yuan，J.，Louth，S.-M.，Avraham，H.& Wood，W.(1996)美国科学院院刊93，1988-1992.-Orlandini，M.，Marconcini，L.，Ferruzzi，R.& Oliviero，S.(1996)美国科学院院刊93，11675-11680.-Yamada，Y.，Nezu，J.，Shimane，M.& Hirata，Y.(1997)基因组42，483-8.-Park，J.E.，Chen，H.H.，Winer，J.，Houck，K.A.& Ferrara，N.(1994)生物化学杂志269，25646-25654.-Olofsson，B.，Pajusola，K.，von Euler，G.，Chilov，D.，Alitalo，K.&Eriksson，U.(1996)生物化学杂志271，19310-19317.-Keyt，B.A.，Nguyen，H.V.，Berleau，L.T.，Duarte，C.M.，Park，J.，Chen，H.& Ferrara，N.(1996)生物化学杂志271，5638-5646.-Potgens，A.J.，Lubsen，N.H.，van Altena，M.C.，Vermeulen，R.，Bakker，A.，Schoenmakers，J.G.，Ruiter，D.J.& de Waal，R.M.(1994)生物化学杂志269，32879-85.-Muller，Y.A.，Li，B.，Christinger，H.W.，Wells，J.A.，Cunningham，B.C.& de Vos，A.M.(1997)美国科学院院刊94，7192-7.-Sawano，A.，Takahashi，T.，Yamaguchi，S.，Aonuma，M.& Shibuya，M.(1996)细胞生长及分化7，213-21.-Furie，M.B.，Cramer，E.B.，Naprstek，B.L.& Silverstein，S.C.(1984)细胞生物学.98，1033-41.-Mohanraj，D.，Wahlsten，J.L.& Ramakrishnan，S.(1996)蛋白质表达及纯化8，175-82.-Viera，J.& Messing，J.(1987)单链质粒DNA的产生，酶学方法153，3-11.-Kunkel，T.A.，Roberts，J.D.& Zakour，R.A.(1987)无需表型筛选的快速有效的定点诱变，酶学方法154，367-382.-Summers，M.D.& Smith，G.E.(1988)杆状病毒载体及昆虫细胞培养程序方法手册，Tex.Agric.Exp.Sm，Bull.1555，1-57.-Joukov，V.，Sorsa，T.，Kumar，V.，Jeltsch，M.，Claesson-Welsh，L.，Cao，Y.，Saksela，O.，Kalkkinen，N.& Alitalo，K.(1997)EMBO J.16，3898-911.-Vassalli，J.D.，Dayer，J.M.，Wohlwend，A.& Belin，D.(1984)实验医学杂志159，1653-68.-Pepper，M.S.，Belin，D.，Montesano，R.，Orci，L.& Vassalli，J.D.(1990)细胞生物学杂志111，743-55-Kratzschmar，J.，Haendler，B.，Kojima，S.，Rifkin，D.B.& Schleuning，W.D.(1993)基因125，177-83.-Fisher，R.，Waller，E.K.，Grossi，G.，Thompson，D.，Tizard，R.&Schleuning，W.D.(1985)生物化学杂志260，11223-30.-Pepper，M.S.，Vassalli，J.D.，Orci，L.& Montesano，R.(1993)实验细胞研究204，356-363.-Mandriota，S.J.，Seghezzi，G.，Vassalli，J.-D.，Ferrara，N.，Wasi，S.，Mazzieri，R.，Mignatti，P.& Pepper，M.S.(1995)生物化学杂志270，9709-9716.-Davis-Smyth，T.，Chen，H.，Park，J.，Presta，L.G.& Ferrara，N.(1996)EMBO J.15，4919-27.-Barleon，B.，Totzke，F.，Herzog，C.，Blanke，S.，Kremmer，E.，Siemeister，G.，Marme，D.& Martiny-Baron，G.(1997)生物化学杂志272，10382-8.-Wiesmann，C.，Fuh，G.，Christinger，H.W.，Eigenbrot，C.，Wells，J.A.& de Vos，A.M.(1997)细胞91，695-704.-Plouet，J.，Moro，F.，Bertagnoli，S.，Coldeboeuf，N.，Mazarauil，H.，Clamens，S.& Bayard，F.(1997)生物化学杂志272，13390-13396.-Park，J.E.，Keller，G.A.& Ferrara，N.(1993)分子生物学细胞4，1317-1326.-Takahashi，T.& Shibuya，M.(1997)癌基因14，2079-2089.-Seetharam，L.，Gotoh，N.，Maru，Y.，Neufeld，G.，Yamaguchi，S.&Shibuya，M.(1995)癌基因10，135-147.-DiSalvo，J.，Bayne，M.L.，Conn，G.，Kwok，P.W.，Trivedi，P.G.，Soderman，D.D.，Palisi，P.M.，Sullivan，K.A.& Thomas，K.A.(1995)生物化学杂志270，7717-7723.-Cao，Y.，Chen，H.，Zhou，L.，Chiang，M.-K.，Anand-Apte，B.，Weatherbee，J.A.，Wang，Y.，Fang，F.，Flanagan，J.G.& Tsang，M.L.-S.(1996)生物化学杂志271，3154-3162.-Stefansson，S.& Lawrence，D.A.(1996)自然383，441-443.
序列表(1)一般信息(i)申请人埃扎·考佩莱宁；比吉塔·奥洛夫松；余吉·甘吉；乌尔夫·埃里克松；凯里·阿利塔罗(ii)发明名称VEGF/受体复合物及其应用(iii)序列数6(iv)通讯地址(A)收信人Evenon，McKeown，Edwards & Lenahan PLLC(B)街道1200 G Street，N.W.，Suite 700(C)城市华盛顿(D)州DC(E)国家美国(F)ZIP20005(v)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)本申请资料(A)申请号WO(B)申请日1997年12月19日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号US60/033,697
(B)申请日1996年12月20日(viii)律师/代理人信息(A)姓名EVANS，Joseph D.
(B)注册号26，269(C)卷号1064/43148PC(ix)电讯信息(A)电话(202)628-8800(B)传真(202)628-8844(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度32bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGTACCCC CAGGCTCAGC ATACAAAAAG AC32(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度30bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2GCGTCTAGAG GGTGGGACAT ACACAACCAG 30(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度62bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATCGAGATCT TCATCACCAT CACCATCACG GAGATGACGA TGACAAACCT GTGTCCCAGT60TT 62(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度26bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CAAGGGCGGG GCTTAGAGAT CTAGCT 26(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度25bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GGAATTCCCC GCCCAGGCCC CTGTC 25(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度41bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6GGAATTCAAT GATGATGATG ATGATGAGCC CCGCCCTTGG C 4权利要求
1.一种用于鉴别VEGF-B类似物的方法，所述的类似物的特征在于具有与VEGF-B基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性，所述的方法包括如下步骤(a)提供一种含有选自如下一组的受体蛋白的样品(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；(b)将步骤(a)的所述样品与候选VEGF-B类似物接触；以及(c)检测所述的候选VEGF-B类似物与步骤(a)的受体蛋白之间的特异性结合。
2.一种用于鉴别VEGF-B类似物的方法，所述的类似物的特征在于具有与VEGF-B基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性，所述的方法包括如下步骤(a)提供一种含有能表达一种表面受体蛋白的细胞的样品，所述的表面受体蛋白具有结合VEGF-B的亲和性并选自如下一组(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；(b)将所述的细胞与候选VEGF-B类似物接触；以及(c)检测VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生。
3.权利要求2所述的方法，其中步骤(c)中所检测的所述VEGF-B介导的细胞应答是内皮细胞增殖。
4.权利要求2所述的方法，其中所述的VEGF-B介导的细胞应答是血管发生。
5.一种用于鉴别样品中VEGF-B或VEGF-B类似物的试剂盒，所述的试剂盒包括(a)一种适于接受样品并含有选自如下一组的受体蛋白的容器(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；(b)用于检测VEGF-B或候选VEGF-B类似物与所述容器中所含的受体蛋白之间的相互作用的装置，所述的VEGF-B或候选VEGF-B类似物属于所述容器中的样品的一部分。
6.权利要求5所述的试剂盒，其中所述的检测装置包括用于检测VEGF-B或VEGF-B类似物与所述的受体蛋白的特异性结合作用的装置。
7.权利要求5所述的试剂盒，其中所述的检测装置包括用于检测VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生的装置。
8.一种分离的配体—受体复合物，包括两种分子，一种分子是配体并包括VEGF-B的至少1-115位氨基酸或其受体结合类似物，第二种分子是受体并选自如下一组(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链。
9.权利要求8所述的复合物，其中所述的受体也具有结合VEGF的亲和性。
10.权利要求8所述的复合物，其中所述的配体是VEGF-B或与VEGF-B的1-115位氨基酸具有至少50％氨基酸序列相同性的VEGF-B类似物或其受体结合氨基酸序列变体或异种同系物。
11.一种分离的结合配对物，其对一种配体—受体复合物上的一个表位具有结合亲和性，所述的复合物包括与下述细胞表面受体的配体结合功能域具有特异性结合作用的VEGF-B蛋白或其类似物，所述的细胞表面受体为(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；所述的结合配对物对未复合的VEGF-B或VEGF-B类似物几乎没有结合亲和性。
12.权利要求11所述的分离的结合配对物，其中所述的结合配对物对未复合的所述细胞表面受体蛋白或其受体类似物几乎没有结合亲和性。
13.权利要求11所述的结合配对物，其中所述的结合配对物是抗体。
14.权利要求13所述的结合配对物，其中所述的结合配对物是单克隆抗体。
15.权利要求13所述的结合配对物，其中所述的结合配对物是多克隆抗体。
16.根据权利要求1或2的方法获得的VEGF-B类似物在如下方法中的应用，所述的方法为(1)拮抗VEGF-B与细胞表面受体的结合，或(ii)拮抗VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生。
17.权利要求16的应用，其中所述的VEGF-B类似物包括一种抗体，所述的抗体具有与(i)由Flt-1的1-347位氨基酸所限定的细胞表面受体的配体结合功能域或其VEGF-B特异性受体类似物，或(ii)由VEGF-B的1-115位氨基酸所代表的VEGF-B受体结合功能域，或其受体结合类似物的结合的特异性。
18.一种选自如下一组的受体蛋白(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；在拮抗(a)VEGF-B与细胞表面受体的结合，或(b)VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生的方法中的应用。
19.一种用于拮抗VEGF-B与细胞表面受体结合的方法，所述的方法包括提供一种蛋白，所述的蛋白具有结合Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列或其VEGF-B受体结合序列变体的特异性，并且所述的蛋白与VEGF-B的残基1-115具有至少50％氨基酸序列相同性，从而当将该蛋白提供给表达所述细胞表面受体的细胞时，其能与所述受体特异地相互作用，从而基本上抑制VEGF-B与所述受体的结合。
20.权利要求18的方法，其中所述的蛋白是根据权利要求1或2的方法获得的VEGF-B类似物。
21.一种治疗以Flt-1细胞表面受体的过量表达为特征的疾病状态的方法，所述的方法包括给予患有这种疾病的患者受体结合有效量的VEGF-B拮抗剂，其中所述的VEGF-B拮抗剂包括根据权利要求1或2的方法获得的VEGF-B类似物，或VEGF-B的抗体。
22.一种治疗以Flt-1细胞表面受体的表达不足为特征的状态的方法，所述的方法包括给予处于这种状态的患者受体结合有效量的VEGF-B或VEGF-B激动剂，所述的VEGF-B激动剂包括根据权利要求1或2的方法获得的VEGF-B类似物。
23.一种VEGF-B类似物，其包括VEGF-B的VEGFR-1结合片段。
24.权利要求23所述的VEGF-B类似物，其中所述的类似物选自由VEGF-B的蛋白裂解过程产生的结合受体的16kDa片段，由VEGF-B经纤溶酶消化产生的结合受体的片段，含有C-末端Kemptide基序的结合受体的外显子1-5突变片段，以及包含至少一种所述结合受体的片段的二聚体。
25.权利要求23所述的VEGF-B类似物，其包括两个由VEGF-B的蛋白裂解过程产生的结合受体的16kDa片段的二聚体。
26.权利要求23所述的VEGF-B类似物，其是全长的VEGF-B单体和由VEGF-B的蛋白裂解过程得到的结合受体的16kDa片段的二聚体。
27.编码权利要求24的VEGF-B类似物的多核苷酸。
全文摘要
本发明公开了血管内皮生长因子－B(VEGF－B)和Flt－1酪氨酸激酶受体的复合物;这种VEGF－B/Flt－1复合物在检测VEGF－B或具有与VEGF－B基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性的VEGF－B类似物中的应用,和/或在促进或拮抗VEGF－B介导的细胞应答中的应用;以及针对这种VEGF－B/Flt－1复合物的特异结合配对物例如抗体。
文档编号C07K14/71GK1241258SQ97180819
公开日2000年1月12日 申请日期1997年12月19日 优先权日1997年12月19日
发明者埃扎·考佩莱宁, 余吉·甘吉, 凯里·阿利塔罗, 比吉塔·奥洛夫松, 乌尔夫·埃里克松 申请人:路德维格癌症研究所, 赫尔辛基大学许可贸易公司