专利名称：多肽的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽用于测定酶调节所述多肽磷酸化状态的能力的的用途。本发明另一方面涉及测定这种活性的方法，以及鉴定修饰所述酶的这种能力的物质的方法。
胰岛素是通过结合胰岛素受体进而激活其内在酪氨酸激酶而影响大量生长和代谢途径的肽激素。这个事件导致了大量能够结合胰岛素受体(IR)特定酪氨酸残基的蛋白的磷酸化。胰岛素受体底物(IRS)家族也属于以这种方式磷酸化的蛋白。
胰岛素受体底物1(IRS-1)是一种能够被大量蛋白激酶(酪氨酸特异性或丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶)在酪氨酸和/或丝氨酸残基和/或苏氨酸残基上磷酸化的细胞蛋白。就此而言，认为取决于酶，存在着不同的酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸残基的特异性磷酸化。除了经由比如酪氨酸激酶的磷酸化，例如，除了胰岛素受体(White 2002)、IGF-1受体(White 2002)或JAKI/2(Thirone等1999)，已知IRS-1也经由比如丝氨酸/苏氨酸激酶被磷酸化，例如，来自PKC家族的激酶(Schmitz-Peiffer 2002)、抑制因子κB激酶复合体(Gao等2002)、c-Jun NH(2)-末端激酶(JNK，Aguirre等2000)、蛋白激酶A(Sun等1991)、促分裂原活化蛋白激酶(Mothe等1996)、蛋白激酶B(Paz等1999)、酪蛋白激酶(Tanasijevic等1993)、糖原合成酶激酶β(Eldar-Finkelmann等1997)、AMP活化激酶(Jakobsen等2001)或磷酸肌醇3激酶(Freund等1995)。IRS分子是胰岛素信号传导途径中的关键分子，并在细胞功能如生长、存活和代谢的维持中起重要作用。磷酸化IRS蛋白就此而言作为“停泊”蛋白，其具有大量的胰岛素受体停泊位点，并具有复杂的胞内信号分子网络，所述胞内信号分子带有所谓的信号识别复合体(SRC)同源区段2结构域(SH2结构域)。而且这些Sh2结构域蛋白的活化也激活了某些信号级联，其依次导致了位于信号级联更下游的各种效应物的活化，最终导致了胰岛素信号向其它胞内信号级联的分支系列的传送(综述见White2002)。
IRS属于大小为160-185kDA且作为胰岛素受体底物的磷酸蛋白家族。已知IRS家族有四个成员(IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4)。它们在组织分布、亚细胞定位、发育特异性表达、与胰岛素受体的结合性质以及它们与之相互作用的SH2蛋白的性质方面存在着差异。IRS家族的四个成员就基础蛋白结构而言有着极为相似的结构它们都有氨基(N)末端结合细胞膜磷脂的普列克(plextrin)同源区段结构域(PH结构域)，以及磷酸酪氨酸结合结构域(PTB结构域)，其直接与PH结构域的羧基(C)末端相连，并参与位于胰岛素受体β亚基的靠膜区(juxtamember region)的Asp-Pro-Glu磷酸化酪氨酸(NPEpY)序列的识别。此外，它们还有稍微不那么强保守的C末端部分，其具有含特异性SH2结构域的蛋白能够与之结合的多个潜在的酪氨酸磷酸化基序。
IRS-1包含21个可能的酪氨酸磷酸化位点，其中一些位于能够结合SH2结构域蛋白的氨基酸序列基序中。IRS-1在能够被各种激酶，比如象来自PKC家族的激酶(Schmitz-Peiffer 2002)、抑制因子κB激酶复合体(Gao等2002)、c-Jun NH(2)-末端激酶(JNK，Aguirre等2000)、蛋白激酶A(Sun等1991)、促分裂原活化蛋白激酶(Mothe等1996)、蛋白激酶B(Paz等1999)酪蛋白激酶(Tanasijevic等1993)、糖原合成酶激酶β(Eldar-Finkelmann等1997)、AMP活化激酶(Jakobsen等2001)或磷酸肌醇3激酶(PI3激酶，Freund等1995)所识别的基序中，另外含有30个潜在的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。胰岛素受体信号途径中的抑制效应至少部分地可通过最近发现的IRS-1的丝氨酸/苏氨酸的磷酸化来解释，这被认为是和与胰岛素受体相互作用的削弱和/或IRS-1的酪氨酸磷酸化的减少和/或与能结合酪氨酸磷酸化了的IRS-1的后序信号蛋白的相互作用的削弱有关(见White综述2002)。到目前为止已有可能证明各种激酶如来自PKC家族的激酶(Schmitz-Peiffer 2002)、抑制因子κB激酶复合体(Gao等2002)，c-Jun NH(2)-末端激酶(JNK，Aguirre等2000)、蛋白激酶A(Sun等1991)、促分裂原活化蛋白激酶(Mothe等1996)、蛋白激酶B(Paz等1999)、酪蛋白激酶(Tanasijevic等1993)、糖原合成酶激酶β(Eldar-Finkelmann等1997)或磷酸肌醇3激酶(Freund等1995)在体外直接磷酸化IRS-1。而且，在每种情况中，完整细胞中增加的激酶活性抑制了胰岛素信号传导途径的活性。此外，体外RS-1丝氨酸/苏氨酸残基上的磷酸化在一些研究中被认为是与减少的经由胰岛素受体的酪氨酸磷酸化直接相关(Le Marchand-Brustel 1999)。IRS-1、2、3、4的序列是公众可得的。这些基因的编码多核苷酸序列和相关蛋白序列可由NCBI核苷酸数据库中登录号NM 005544(人IRS-1)，XM007095(人IRS-2)，NM032074(大鼠IRS-3)，NM003604(人IRS-4)获得。NCBI是国家生物技术信息中心(邮政地址国家生物技术信息中心，国家医学图书馆，大厦38A，贝塞斯达，MD20984，美国；网址www.ncbi.nhm.nih.gov)。其中，Araki等1993和Siemeister等1996中业已描述了IRS-1基因的克隆；Araki等1994，Lavan等1997a和Lavan等1997b中业已描述了IRS-2至4的克隆。
用于测定各种激酶磷酸化IRS-1的能力和测量这种活性的各种现有技术方法是公知的，所述方法基于放射性检测法(如放射性标记磷酸盐向底物的转移)或非放射性检测法。
因而，已知通过与放射性标记的ATP和待测激酶孵育将放射性磷酸盐残基转移至IRS-1的方法，作为所述激酶磷酸化IRS-1的能力的函数，来测定IRS-1在全长IRS-1蛋白、其具有至少一个磷酸化位点的片段或多肽上的磷酸化。接着亲和层析或电泳分离IRS-1，并通过流式闪烁或放射自显影检测转移磷酸盐的量(例如Eldar-Finkerlamn等1997中描述的全长IRS-1蛋白和糖原合成酶激酶3β，Siemeister等1995中描述的IRS-1片段(氨基酸516-777)和胰岛素受体、IGF-1受体或者重组胰岛素受体激酶，或De Fea等1997中描述的伴有含PKC家族活化蛋白激酶的细胞溶解物的IRS-1肽(氨基酸601-616))。此外，正是从Siemeister等1995起，通过如下方法测定磷酸化IRS-1片段如IRS-1片段(氨基酸516-777)和胰岛素受体、IGF-1受体或者重组胰岛素受体激酶的能力，即与放射性标记的ATP孵育，逐滴将底物加到荷正电的膜上(硝化纤维或类似材料)，洗涤并通过放射自显影或测量放射性发射检测结合的放射性标记的底物。
孵育放射性标记的ATP和生物素化IRS-1多肽，将底物逐滴加到包被有链霉亲和素的膜上，洗涤并通过放射自显影或测量放射性发射检测结合的放射性标记底物是另一种用于测定激酶磷酸化IRS-1的能力的方法(见De Fea等1997)。
上文所述的放射性测定方法的缺点是显而易见的，因为放射性操作承担着相当大的危险，费用极其昂贵，因此特别是对于高通量方法(HTS方法)适用性低。
上述基于短肽使用的方法的缺点在于这些短肽有不适宜的动力学常数(Vmax，Km)，而且肽的三维结构与生理学酶底物的三维结构差异很大。这一方面通过完全不同的折叠得以证明，这样决定酶-底物相互作用的特异性的某些生物空间不存在，这导致了无识别(因而无修饰)或者非特异性识别(因而非特异性修饰)并最终导致了不正确的结果。此外，肽短意味着它们只有一个或少数磷酸化位点，这样必须多样化的肽来研究不同酶对特定底物的磷酸化修饰。这反过来也导致费用增加和对HTS形式的方法仅仅是条件性适用。
因此本发明的目的是提供一种可能的测定蛋白磷酸化酶和/或去磷酸化酶活性的方法，其没有上述缺点。
本发明目的是通过使用多肽(Def GGs to the peptide)测定酶、其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力来完成的，其中所述多肽是生物素化的。
本发明是基于发明人的这样的研究成果，其令人惊讶地表明即使用多肽或全长蛋白也不存在链霉亲和素对生物素结合的空间位阻，而且生物素化也不会干扰激酶对所研究底物的磷酸化。
用于本发明目的术语多肽是指含有通过肽键连接的氨基酸并具有至少50个以此种方式线性连接的氨基酸的分子。较短的这类分子称之为肽。术语蛋白涉及含有至少一个多肽链的分子，但是也可由大量结合或连接在一起的多肽链组成。术语蛋白因而囊括了术语多肽。
本发明多方面的一个优选实施方式中，多肽的长度是50个氨基酸和以上，优选50-300个。
本发明多方面的另一优选实施方式中，多肽的大小是1kDa和以上，优选1-100kDa，并且特别优选10-50kDa。
本文酶的底物是指适于被所述酶修饰的任何分子。用于本发明目的天然底物是以其在天然生理或病理环境中发生的方式排列且能够被相关酶修饰的分子。
酶对磷酸化状态的调节涉及酶修饰底物的本性，其中将至少一个磷酸基团转移至底物或除去。因此与本发明相关的酶具有催化一种和/或另一种反应的能力。因此它们至少具有这种激酶和/或磷酸酶的能力，但是可能另外还具有其它酶学特性(如蛋白酶特性等)。各种酶的分类及其特性是本领域技术人员熟知的。
本文酶的功能性片段是酶的任何片段(与天然存在的形式相比大小减少或者截短的分子)，其仍具有调节至少一种多肽磷酸化状态的能力。就此而言术语酶的“功能性衍生物”包括与天然存在的形式相比的酶修饰的每种类型，其不代表截短物，酶的衍生物仍有调节至少一种多肽磷酸化状态的能力。就此而言，本发明也涉及酶片段的功能性衍生物，其能够调节至少一种多肽的磷酸化状态。
测定酶调节多肽的磷酸化状态能力就此而言既可以定性又可以定量(如作为可计量的测量)进行。
根据本发明的用途具有由此获得的结果信息更丰富的优点，这归因于所用底物的长度，因为它们包括了趋于对应于生理学环境的三级结构。此外，所用的多肽，与现有技术的已知多肽形成对照，具有良好的动力学常数(如对于IRS-1Km 19μM与肽相比＞200μM，参见Siemeister等1995)，而且分析具有大量磷酸化位点的底物只需要一个底物，并且也能够例如用于测定不同酶的能力。
一个优选的实施例涉及测定酶磷酸化多肽的能力的用途。
用于本发明多方面具有激酶活性的特别有利类型的酶涉及丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶。其中特别合适的激酶的例子包括胰岛素受体、IGF-1受体、trK受体、EGF受体、酪蛋白激酶II、蛋白激酶C家族成员、蛋白激酶B/Akt、促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)、GSK-3β、ERK1/2、IKKβ激酶、AMP激酶、P13激酶或JNK。
根据本发明的用途另外同样也适于测定酶去磷酸化多肽的能力。
本发明的另一方面涉及用于测定酶、其功能性片段或衍生物调节生物素化多肽的磷酸化状态的能力的方法。
用于测定生物素化多肽的磷酸化程度的合适方法涉及例如适合于测定短肽的磷酸化程度的已知方法。这些都是本领域技术人员很熟悉的。
在一优选实施方案中，本发明的方法涉及以如下步骤测定酶、其功能性片段或衍生物磷酸化多肽能力的方法a)使酶或功能性片段或衍生物与生物素化多肽接触，并在合适的反应混合物中起始磷酸化反应，b)使反应混合物与偶联于载体且能够结合生物素化多肽的部件接触，c)测定与部件结合的多肽磷酸化状态。
本发明的另一优选实施方案涉及测定酶、其功能性片段或衍生物磷酸化多肽能力的方法，其步骤为a)使酶或功能性片段或衍生物与具有至少一个磷酸化残基的生物素化的多肽接触，并在合适的反应混合物中起始磷酸化反应，b)使反应混合物与偶联于载体且能够结合生物素化多肽的部件接触，c)测定与部件结合的多肽磷酸化状态。
就此而言的部件可以是适于结合生物素化多肽的任何类型分子或超分子结合(如实体或装置)。此例中结合可能发生在生物素部分或多肽本身上，而对于结合多肽本身的情况，优选是依赖于磷酸化状态的结合(如参照单个或多个磷酸化位点，仅在磷酸化或者非磷酸化状态下结合)。因此部件优选的实施方案涉及链霉亲和素或磷酸特异性抗体(如能够识别多肽上特定残基的磷酸化并与此处磷酸化的多肽特异结合的抗体)。
此外，用于本发明多方面目的的反应混合物在本质上可是生化混合物(如在体外)或细胞混合物。生化混合物的组成就此而言取决于待研究酶的需要，但是合适的组分和组成，如ATP、调节期望PH环境和期望盐浓度以确保酶活性的缓冲液，是相关领域技术人员公知的。在生化混合物的情况下，可能酶和/或多肽是通过重组和/或作为部分或完全由天然来源纯化的分子和/或以来自生物材料的抽提物的形式提供的，特别是细胞或组织抽提物。
其中，生物材料可包括组织或器官(如大脑、血液、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、血管)的细胞，优选脊椎动物的，包括人，或来自细胞培养物的细胞。用于本发明目的的细胞就此而言包括所有类型的细胞，如真核或原核单细胞生物(比如细菌，如大肠杆菌(E.coli)或酵母，如裂变酵母(S.pombe)或酿酒酵母(s.cerevisiae))或来源于多细胞生物的细胞系(比如象HeLA、COS、NIH-3T3、CHO等)，优选哺乳动物细胞系。脊椎动物，包括人的组织集合或器官的细胞，可通过常规的技术如血样采集、活组织检查或外科技术获得。这些重组分子的制备，来自细胞或组织的天然分子的纯化以及细胞或组织抽提物的制备都是本领域技术人员充分熟知的(参见下文列出的标准文献的例子)。
适用于本发明多方面目的的细胞体系同样是本领域技术人员公知的，并且优选包括初始来自组织集合的分离细胞(优选来自脊椎动物，特别优选哺乳动物且更优选人)，特别优选培养的细胞系的形式；它们还包括单细胞的生命形式(真核生物或原核生物)，比如象酵母或细菌细胞，特别是培养的菌株的形式。
载体可以是适于介由生物素-链霉亲和素相互作用从反应混合物中去除与它们偶联的肽、或适于标记肽的任何类型的分子或超分子结合(如实体或装置)。合适的装置有，例如膜、板或各种形状的实体(文中一般称之为珠子)，是由现有技术充分熟知的各种材料制成的。载体的性质就此而言取决于方法的目标(如诊断，寻找活性物质或发现新作用配偶体)和检测的方式，并且合适载体的选择落在本领域技术人员能力范围内。
在本发明方法的一个实施方案中，向反应混合物中加入放射性标记的γ32P-ATP，并在完成至少一次清洗步骤后，通过测量载体上残留的放射性确定磷酸化状态，所述载体优选为膜或板。以这种方式，有可能简单地除去反应混合物中不与链霉亲和素结合的组分，包括游离的放射性，这样多肽的磷酸化状态仅基于固定在载体上的放射性就可确定。在该例中，适合于结合生物素化的多肽的部件特别是链霉亲和素。
在本发明方法的另一实施方案中，向反应混合物中加入能够特异结合磷酸化多肽的抗体(BSP)。在该例中抗体既可以代表部件本身，又可在部件之外另行加入(在此情况下，后者优选不是磷酸特异性抗体，并特别优选链霉亲和素)。在该例中磷酸化状态的确定是通过测定结合多肽的抗体量进行的。标记和检测抗体的合适操作是本领域技术人员已知的。因而，有可能一方面使用合适标记的可被直接检测的一抗，或者使用合适标记的针对所述一抗FC部分(可结晶片段)的二抗，从而增加检测的特异性。
术语抗体就此而言包括单克隆抗体和多克隆抗血清、重组制备的抗体和重组制备的单链抗体。这类抗体的选择和制备落在本领域技术人员能力范围内，就此而言的参考文献也可参见下文列出的标准文献。用于这类抗体的合适标记在现有技术中也是已知的，并且包括例如，酶标记CIP(小牛碱性磷酸酶)或HRP(辣根过氧化物酶)，经由特定波长光辐照激发产生可检测信号的荧光分子，如得克萨斯红(Texas Red)、Cy3、FITC(异硫氰酸荧光素)，或已知的荧光蛋白。合适标记的选择同样是与本领域技术人员的能力相符的。合适标记或非标记的一抗和二抗及其制备是已知的现有技术中，而且这些抗体在商业上可通过多家供应商获得。例如，一抗和二抗可通过Becton Dickinson、Pharmacia或Santa Cruz Biotech获得。
在上述方法的优选实施方式中，结合多肽的抗体量通过在完成至少一次清洗步骤后，测量载体优选膜或板上残留的抗体量来确定。
在本发明方法的另一优选实施方式中，与偶联于部件的载体是包含第一信号发生器的第一载体，而多肽偶联于包含第二信号发生器的第二载体，当两个信号发生器彼此直接邻近时，能够产生可检测的信号，由此通过测定是否产生了可检测的信号来确定磷酸化状态。在该例中载体优选为珠子。这里部件优选为磷酸特异性抗体。在该例中载体可直接或间接地与抗体相连，优选通过与偶联于载体的蛋白A间接相连。在该例中第二载体可直接或间接地与多肽连接，优选通过生物素化多肽的生物素部分间接相连；这优选介由与偶联于载体的链霉亲和素进行。
信号发生器在该例中可以是适于产生可检测信号的任何部件或分子；例子包括荧光团，其暴露于能量被激发后，发射可直接或通过现有技术已知的合适手段经信号扩大后检测的光。在该例中选择信号发生器用于本发明目的，从而仅当部件(即优选磷酸特异性抗体)与多肽发生直接相互作用时才产生信号。合适的载体和信号发生器(如ALPHAScreenTM或LANCETM，Perkin-Elmer Life Sciences；HTRFTM，CIS Bio International的形式)是已知的。在这些例子中，对信号发生至关重要的是载体彼此直接邻近。因此非常令人惊讶的是这类方法适于与多肽结合使用，虽然后者明显大于现有技术中所使用的肽。
适合本发明多方面目的的多肽优选是酶的天然底物，优选是未截短的长度。特别适合的多肽包括胰岛素受体激酶的所有底物。就此而言特别要提及胰岛素受体底物(IRS)家族的多肽，优选IRS-1、2、3或4，并且特别优选IRS-1或其功能性片段或衍生物。这是指具有被胰岛素受体磷酸化能力的片段或衍生物(或片段的衍生物)。还优选IRS为人IRS-1。
此外，特别优选使用IRS-1，特别是具有SEQ ID No.1所示序列的人IRS-1，(即)由SEQ ID No.2所示序列编码的人IRS-1用于本发明多方面目的。此外，前述多肽特别适用于确定胰岛素受体磷酸化它们的能力。
优选IRS-1片段是具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽。
可在不同的水平采用本发明的多方面。因此其在鉴定物质修饰酶或其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力方面的用途特别有利。
称之为测定法的合适的分析方法或系统在现有技术中是已知的，其测量机体特定靶分子(在多肽磷酸化的状态下称之为“靶”，)的活性或浓度或量作为潜在活性物质的活性参数。其可能的例子是体外测定，即生化测定，其中混合分离的或部分分离的成分以提供反应混合物，并可在此基础上测量潜在活性物质的活性。其它可能性还有细胞测定系统(测定法)，其中可测定细胞环境中靶蛋白的活性(即本例中酶的活性)和潜在活性物质对该靶分子的活性。
测定法就此而言是可在其基础上监控生物过程的任何类型的分析方法。这按照惯例需要(不仅)代表部分生理代谢途径和调控机制而且代表在细胞或生化体系中再现的病理状态的分子过程和信号级联。活性物质的药理学活性可根据它干预这些途径和机制的能力来测定。
对于寻找活性物质的目的特别是高通量筛选活性物质的用途，测定法必须是可重复且优选也是可升级和强壮的(即对外部影响敏感性小)。测定法应该优选适于高通量筛选对靶分子活性有影响能力的化学物质。其中，测定法的性质就此而言取决于所用靶分子的性质(如基础生化分子的确切类型或性质，如多肽或多核苷酸)和“读出”，即以其为基础确定靶分子活性的参数。
现有技术中已知的各类测定法，且大多数也可经商业途径从商业供应商获得。
适于测量两个结合配偶体相互作用的测定法包括，例如，放射性同位素分析或荧光分析，如荧光极化分析，例如由商业途径从Panvera，Perkin-Elmer Life Sciences(NEN、LANCETM、ALPHAScreenTM)或CIS Bio International(HTRFTM)获得。测定法的其它例子包括细胞测定法，其中细胞系稳定(诱导型或组成型；染色体型或游离型)或瞬时地表达期望的重组蛋白。这些测定法包括，例如报告基因测定法，其中基于其表达处于相关启动子控制下的报告酶的活性，测量特定启动子的调控或信号转导途径的调控或信号转导级联成员的调控。对于这类测定法，有必要产生表达这样的报告基因的重组细胞系，所述报告基因处于其本身待研究或被待研究的信号转导级联体调控的明确启动子控制之下。合适的报告酶通常是相关领域技术人员已知的，包括萤火虫荧光素酶，海肾(Renilla)荧光素酶(它们都可从Packard Reagents购买)，β-半乳糖苷酶等。合适细胞系的选择是相关领域技术人员公知的，其中取决于分析的目的或“读出”。它们通常是可简单培养和转染的细胞系，比如HeLA、COS、CHO或NIH-3T3细胞系。
适于测量蛋白磷酸化或激酶活性的有，例如荧光极化，如从Panvera商业上可获得的均相时间分辨荧光(homogeneous time resolvedfluorescence)(HTRFTM，CIS Bio International)或LANCETM分析(Perkin-Elmer Life Sciences)或增强发光临近均相分析(amplifiedluminescent proximity homogeneous assay)(Perkin-Elmer Life Sciences的ALPHAScreenTM)。使用Perkin-Elmer Life Sciences的ALPHAScreenTM测量激酶的活性对本发明目的特别有利，例如这是通过待研究激酶在有ATP存在的生化混合物中磷酸化生物素化肽进行的。然后磷酸化的肽被特异性的抗磷酸抗体结合，该抗体上偶联有缀合了蛋白A或提供了合适二抗的受体珠。相同的混合物中含有与肽的生物素部分结合的偶联了链霉亲和素的供体珠。肽的结合使受体珠和供体珠直接相邻，发动了级联化学反应，并产生高度扩增的可检测的发光信号供体珠中的光敏剂经由激光激发而被激发，将周围的氧转化成纯态氧。然后纯态氧扩散到受体珠上，此处激发了二甲基噻吩衍生物，因而释放出波长为370nm的化学荧光，其依次激发受体珠上更多的荧光团发射波长为520-620nm的光。由于纯态氧对荧光团的激发仅发生在供体珠和受体珠密切靠近时，只有在此时才会产生可检测的信号。
其它类型的测定法和其它类型的“读出”同样是相关领域技术人员所充分熟知的。
就此而言特别要提及高通量(HTS，高通量筛选)方法形式的用途，通过它能够在最短时间内分析大量的物质。
取决于目的，调节的修饰可意味着酶调节的抑制或激活。修饰的性质就此而言包括最终对酶催化的多肽的磷酸化状态产生作用的所有可能的影响，如酶-底物的相互作用的修饰或者酶催化活性的修饰，也包括(优选在使用细胞反应混合物分析的情况中)酶表达的修饰等。
本发明的另一方面涉及一种方法，用于鉴定修饰酶或其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力的物质，其步骤为a)按照本发明上述方法之一，测定酶或其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力，其中反应混合物中不加待测物质，b)按照本发明上述方法之一，测定酶或其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力，其中向反应混合物中加入待测物质，c)比较来自a)和来自b)的能力。
本发明的方法特别适合鉴定用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、肿瘤(IGFRK)或用于治疗炎症过程(IKK激酶)的药理学活性物质。下文通过多个附图和实施例对本发明作更详细的说明，而并不由此限制本发明的主题。
实施例1所用的IRS-1片段为了证明生物素化来自胰岛素信号途径的多肽底物及在本发明用途和方法中采用它的可能性，选择来自人IRS-1大小为262个氨基酸的片段(氨基酸516-氨基酸777)，其编码中心潜在的酪氨酸(粗体)和丝氨酸磷酸化位点(以下划线标出)(Siemeister等J.Biol.Chem 1995)。该片段包括五个潜在的酪氨酸磷酸化位点，这在图3中已着重指出，并在下文中和它们的基序一起用粗体表示出来。
代表YMXMSP基序中四个可能的丝氨酸激酶磷酸化位点的丝氨酸612、632、662和731，定位于胰岛素受体的酪氨酸磷酸化位点附近，容纳于SH2区域的结合位点之中。这些丝氨酸残基突变成丙氨酸导致了IRS-1介导的磷脂酰-肌醇三磷酸盐激酶(PI3K)的活性增加(Mothe等1996)，这表明它们有抑制功能。然而，不能排除还有其它丝氨酸磷酸化位点的存在，但是目前还不知道。
实施例2hIRS-1-p30的克隆和生物素化为进行研究，人IRS-1的262个氨基酸长的结构域D516-P777(hIRS-1-p30)最初在如Siemeister等1995所述的大肠杆菌中表达。在该例中表达载体通过常规方法制备，将具有SEQ ID No.10(hIRS-1-p30的cDNA序列)所示序列的多核苷酸插入到质粒pET3d(以Novagen订货号69421购买获得)中。为此目的，首先用酶NcoI(由Roche Diagnostics GmbHMannheim订货号835315购买获得)和BamHI(由Roche DiagnosticsGmbH Mannheim订货号656275购买获得)在标准条件下消化空载体，然后用自旋柱纯化(由Qiagen，Hilden订货号28104购买获得)。
在该例中生物素化按照商业供应商N-Zyme，达姆施塔特，德国的规定使用常规技术进行。hIRS-1-p30胰岛素受体片段的表达如Siemeister等1995所述进行。为了检查表达效果，制备大肠杆菌(E.coli菌株BL21，由Novagen订货号69451-3购买获得)的蛋白抽提物，在标准条件下用SDS-PAGE分离(例如见下文列出的标准文献)，并在标准条件下用考马斯亮蓝染色溶液染色证明(例如见下文列出的标准文献)。hIRS-1-p30的纯化同样地根据Siemeister等进行。hIRS-1-p30的生物素化利用转谷氨酰胺酶酶促进行。
实施例3ALPHAScreenTM用麦芽凝集素亲和纯化的大鼠肝脏胰岛素受体对生物素化IRS-1片段的磷酸化在如图4所示的实验中，用麦芽凝集素亲和纯化的大鼠肝脏胰岛素受体(WGA-IR，序列登录号NP_058767或由Sigma订货号70543购买获得)与各种浓度的人胰岛素(如由Sigma订货号I-9266购买获得)和85nM生物素化IRS片段在50mM Tris缓冲液，PH7.4，8mM MgCl2，2mMMnCl2中4℃孵育10分钟，然后加入ATP(终浓度为50μM)在30℃孵育30分钟。加入EDTA至终浓度20mM终止反应，用直接与受体p-Tyr(由Perkin-Elmer Life Sciences订货号676061C购买获得)偶联的特异抗体检测IRS-1的磷酸化，其产生如图4所示的读出。借助于这种方法有可能确定胰岛素的EC50是10nM。
实施例4ALPHAScreenTMPKC和重组胰岛素受体激酶对生物素化IRS-1片段的磷酸化Perkin-Elmer Life Sciences的ALPHAScreenTM使得检测磷酸化IRS-1片段与识别磷酸化了的丝氨酸或酪氨酸残基(p-Ser/p-Tyr抗体)的抗体间的相互作用成为可能。在该例中生物素化IRS-1结合链霉亲和素供体，而抗体被受体偶联的蛋白A或结合于受体的合适二抗结合。如果发生了相互作用，则受体实现并保持与供体直接邻近，这样由供体产生的纯态氧原子能够通过扩散抵达受体珠中的化学发光基团，其最终导致可检测光的发射。
IRS-1与蛋白激酶C和ATP孵育30分钟后，随后加入p-Ser抗体(由Biosource比利时订货号44-550购买获得)，并再孵育120分钟，通过用Perkin-Elmer Fusion或AlphaQuest仪器测量，检测和量化前述分析产生的光强度(所谓的“读出”)，如图5A和B中柱形图所示。有和没有PKC时产生的光强度的比较如图11A所示。在如图11B所示的实验结果中，重组胰岛素受体激酶(IRK，氨基酸941-1343，NCBI登录号NM_000208)通过与多聚赖氨酸在50mM Tris缓冲液PH7.4，8mM MgCl2，50μM ATP反应缓冲液中30℃孵育10分钟，然后加入IRK底物IRS，接着在30℃孵育30分钟活化。用直接与受体偶联的p-Tyr特异性抗体(由Perkin-ElmerLife Sciences订货号6760601C购买获得)检测IRS-1的磷酸化，其产生如图11B所示的读出。前述的研究首次能够证明生物素化多肽可被激酶磷酸化。这通过28kDA大小的hIRS-1片段在生物素化状态下被丝氨酸激酶PKCδ和胰岛素受体的酪氨酸激酶磷酸化得以证实。在该例中通过磷酸特异性抗体的检测同样是成功的，不会因与生物素残基连用的多肽的大小所致的空间位阻产生对检测反应的干扰。由此在ALPHAScreenTM原理的基础上，利用因生物素化而成为可能的纯化和检测手段产生可测定多肽的磷酸化状态的均相分析体系是可能的。这是第一次将该测定原理应用于具有多肽大小的蛋白片段(更确切地是28kDa)。这使得改进用于与细胞的磷酸化和去磷酸化机器相互作用的药学活性物质的研究-诊断磷酸化依赖性紊乱/鉴定针对大和甚至结构完整的生理学底物上的特定多肽的新蛋白激酶成为可能，因而大大地增加了基于其进行这些研究的磷酸化或去磷酸化及以这种方式产生的数据提供的信息的特异性。此外，这里使用的分析系统的读出不是放射性的，而是发光的，这构成了用于高通量筛选(HTS)方法的优点。因此这里描述的分析可用于所有调节多肽和蛋白磷酸化状态的酶的高通量筛选，比如激酶和磷酸酶，用于鉴定新的活性物质或验证已知的活性物质。同样也适用于其它方法，比如前述的寻找新的磷酸化特定多肽的酶，例如全细胞裂解液中新的IRS-1磷酸化激酶。
图1IRS-1-IRS-4(SEQ ID No.1-4)的蛋白序列。四个家族成员的序列登录号(NCBI蛋白数据库)是NM-005544(人IRS-1)、M007095(人IRS-2)、NM032074(大鼠IRS-3)、NM_003604(人IRS-4)。
图2IRS-1-IRS-4(SEQ ID No.5-8)的编码DNA序列。四个家族成员的序列登录号(NCBI核苷酸数据库)是NM-005544(人IRS-1)、M007095(人IRS-2)、NM032074(大鼠IRS-3)、NM_003604(人IRS-4)。
图3用于本研究的IRS-1蛋白的包含262个氨基酸的结构域(hIRS-1-p30)。丝氨酸612、632、662和731以下画线标出。YXXM酪氨酸磷酸化基序用粗体表示。
图4使用经由麦芽凝集素亲和层析纯化的胰岛素受体的ALPHAScreenTM结果图5ALPHAScreenTM结果图6胰岛素受体、IRS-1和丝氨酸激酶相互作用的概述7有抑制效应的丝氨酸磷酸化的可能的分子机制的概述图参考文献White，M.F.(2002)“IRS蛋白和常见的糖尿病途径”Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.283，E413-422Thirone AC，Carvalho CR，Saad MJ.(1999)“生长激素刺激JAK2的酪氨酸激酶活性并诱导大鼠组织中胰岛素受体底物和Shc的酪氨酸磷酸化”Endocrinology 140，55-62Schmitz-Peiffer C，Craig DL，Biden TJ.(2002)“神经酰胺的产生足以解释用棕榈酸盐预处理的C2C12骨骼肌细胞中胰岛素刺激PKB途径的抑制”Ann.N.Y.Acad.Sci.967，146-157Gao Z，Hwang D，Bataille F，Lefevre M，York D，Quon MJ，YeJ.(2002)“抑制因子κB激酶复合体对胰岛素受体底物1的丝氨酸磷酸化”J.Biol.Chem.277，48115-48121Aguirre V，Werner ED，Giraud J，Lee YH，Shoelson SE，White MF.(2000)“胰岛素受体底物-1的Ser307的磷酸化阻断与胰岛素受体的相互作用并抑制胰岛素的作用”J.Biol.Chem.275，9047-9054Sun XJ，Rothenberg P，Kahn CR，Backer JM，Araki E，Wilden PA，CahillDA，Goldstein BJ，White MF.(1991)“胰岛素受体底物IRS-1的结构决定了独特的信号传导蛋白”
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材料和方法除非另有说明，所述的方法是相关技术人员公知的标准方法，例如可在上述引证文献中找到，特别是关于标准方法的文献(在本文中也称之为标准文献)缩略词氨基酸使用三字母或单字母的代码(通常也缩写为AA)(也见所示的标准文献)；核苷酸使用普遍常规的单字母缩写(也见所示的标准文献)。
权利要求
1.多肽用于测定酶、其功能性片段或衍生物调节所述多肽磷酸化状态的能力的用途，其中所述多肽是生物素化的。
2.如权利要求1所述的用途，用于测定酶磷酸化所述多肽的能力。
3.如权利要求1所述的用途，用于测定酶去磷酸化所述多肽的能力。
4.用于测定酶、其功能性片段或衍生物调节生物素化多肽的磷酸化状态的能力的方法。
5.如权利要求4所述的方法，用于测定酶、其功能性片段或衍生物磷酸化所述多肽的能力，其步骤为a.使酶或功能性片段或衍生物与生物素化多肽接触，并在合适的反应混合物中起始磷酸化反应，b.使反应混合物与偶联于载体且能够结合生物素化多肽的部件接触，c.测定与部件结合的多肽的磷酸化状态。
6.如权利要求4所述的方法，用于测定酶或其功能性片段或衍生物去磷酸化所述多肽的能力，其步骤为a.酶或功能性片段或衍生物与具有至少一个磷酸化残基的生物素化的多肽接触，在合适反应混合物中开始磷酸化反应，b.使反应混合物与载体偶联且能够结合生物素化多肽的部件接触，c.测定与部件结合的多肽磷酸化状态。
7.如权利要求4-6任一项所述的方法，其中载体是膜或板。
8.如权利要求4-7任一项所述的方法，其中部件是链霉亲和素或磷酸特异性抗体。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中向反应混合物中加入放射性标记的γ32P-ATP，并在完成至少一次清洗步骤后，通过测量膜或板上残留的放射活性确定磷酸化状态。
10.如权利要求4-8任一项所述的方法，其中向反应混合物中加入能够特异结合磷酸化多肽的抗体，并通过测定结合多肽的抗体量确定磷酸化状态。
11.如权利要求10所述的方法，其中结合多肽的抗体量通过在完成至少一次清洗步骤后，测量膜或板上残留的抗体量来确定。
12.如权利要求10所述的方法，其中与链霉亲和素偶联的载体是包含第一信号发生器的第一载体，而多肽偶联于包含第二信号发生器的第二载体，当两个信号发生器彼此直接邻近时，能够产生可检测的信号，由此通过测定是否产生信号确定磷酸化状态。
13.如权利要求1-3任一项所述的用途或如权利要求4-12任一项所述的方法，其中多肽的长度为50个氨基酸和以上，优选50-300个。
14.如权利要求1-3任一项所述的用途或如权利要求4-12任一项所述的方法，其中多肽的大小是1kDa和以上，优选1-100kDa，特别优选10-50kDa，尤其是25-35kDa。
15.如权利要求1-3或14任一项所述的用途或如权利要求4、5或7-14任一项所述的方法，其中酶是激酶，优选酪氨酸激酶。
16.如权利要求1-3或12-15任一项所述的用途或如权利要求4-15任一项所述的方法，其中多肽是酶的天然底物，优选为未截短的长度。
17.如权利要求1-3或12-16任一项所述的用途或如权利要求4-16任一项所述的方法，其中多肽是胰岛素受体底物(IRS)，优选IRS-1、2、3或4，特别优选IRS-1或其功能性片段或衍生物。
18.如权利要求17所述的用途或方法，其中IRS-1是具有SEQ ID No.1所示序列或由SEQ ID No.2所示序列编码的人IRS-1。
19.如权利要求18所述的用途或方法，其中IRS-1片段具有SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列，并且优选由其组成。
20.如权利要求1-3或12-19任一项所述的用途或如权利要求4-19任一项所述的方法，其中酶是下列激酶或其功能性片段或衍生物胰岛素受体、IGF-1受体、trK受体、EGF受体、酪蛋白激酶II、蛋白激酶C、蛋白激酶B/Akt、促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)、GSK-3、ERK或JNK。
21.如权利要求1-3或12-20任一项所述的用途或如权利要求4-20任一项所述的方法，用于鉴定修饰酶或其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力的物质。
22.用于鉴定修饰酶或其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力的物质的方法，其步骤为a.按照权利要求3-21任一项所述的方法，测定酶或其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力，其中反应混合物中不加待测物质，b.按照权利要求3-21任一项所述的方法，测定酶或其功能性片段或衍生物调节多肽磷酸化状态的能力，其中向反应混合物中加入待测物质，c.比较来自a)和来自b)的能力。
23.如权利要求21所述的用途或如权利要求21或22任一项所述的方法，用于鉴定治疗非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的药理学活性物质。
全文摘要
本发明涉及多肽用于测定酶、其功能性片段或衍生物调节所述多肽磷酸化状态的能力的用途，所述发明的特征在于所述多肽是生物素化的。
文档编号C07K14/47GK1795273SQ200480014092
公开日2006年6月28日 申请日期2004年4月27日 优先权日2003年5月22日
发明者N·特纳格尔斯, A·坎特, H·蒂林 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司