Csn5多肽及其用于筛选治疗剂的用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及CSN5多肤及其用于筛选治疗剂的用途。
【背景技术】
[0002] 由泛素化（泛素分子的翻译后共价结合）介导的细胞信号传导过程对细胞 活性，尤其是对蛋白质转换至关重要。泛素连接酶E3负责泛素化反应的最后步骤。 E3cullin-RING泛素连接酶（邸L)代表了主要的泛素连接酶家族。在调节邸L活性的数个 因素中，核屯、是cullinneddylation/deneddylation循环（1)。
[0003]C0P9信号体（CSN，C0P9si即alosome)是类似于26S蛋白酶体的19S盖子的大的 多蛋白质复合体，在E3-cullinRING泛素连接酶（邸L)的调节中发挥着核屯、作用。由于大 量蛋白质被C化泛素化运一事实，C0P9信号体（CSN)与很大比例的蛋白质体的控制相关， 所述蛋白质体包括原癌基因（例如Myc)、肿瘤抑制子（例如p53)和细胞的其它重要的参 与者。CSN复合体的不同生物和生化功能已研究了多年，但迄今为止，研究最多的是其作为 邸Ldeneddylase的作用。由亚基5 (CSN5/J油1)携带的CSN复合体的催化活性体现在邸L 的denedd}dation，即cullin-NeddS异肤键的水解。结构上，CSN是约320kDa的八亚基复 合体化个基于PCI(蛋白酶体C0P9eIF3)的亚基和2个含有Mprl-Padl-N-末端[MP闲的 亚基）。亚基5 (CSN5)是含有MPN的亚基之一，其携带有包含JAMMQ油1/MPN/MOV34)基序 (也称为MPN+基序；（2))的锋依赖性异肤酶催化中屯、。最近的深入研究表明，CSN复合体 的装配类似于26S蛋白酶体盖子（3)，其中去泛素化酶化nil等同于dened如lating的亚基 CSN5(2,4) 0
[0004]CSN参与多种细胞功能，范围从细胞周期到昼夜节律再到免疫力，它是范围从植物 到哺乳动物细胞的真核生物中非常保守的多蛋白复合体。CSN对于细胞功能的重要性已经 受到遗传研究的关注巧）。CSN在正常细胞中的生理机能已经得到了深入研究，并且许多研 究发现CSN和癌症之间存在紧密的联系化）。有趣的是，CSN的癌症作用主要归因于CSN5， 其位于人类染色体8q上，自身经常在癌症中被扩增。
[0005] 在体内已经发现了具有可变组成的较小形式的完整CSN复合体（7-11)。虽然在细 胞周期进展中重要，但运些亚CSN复合体尚未在功能性上进行完全表征（12)。有趣的是， 如在蛋白酶体盖子情况下针对化nil所提示的（4)，发现CSN5存在2种形式，一种是有催 化活性的完整CSN结合形式，一种是无异肤酶活性的完整CSN-独立状态（2, 3)。在体外已 经通过非变性质谱（M巧探索了CSN复合体的模组性和拓扑学，掲示CSN5是次要的亚基，在 CSN复合体的情况下，其可在CSN复合体的外面同源二聚化，并多数与含有MPN的另一亚基 CSN6相互作用（3)。先前的报道已经强调了CSN5与其它CSN亚基，即CSN1、CSN2、CSM和 CSN7,之间潜在的相互作用（1，8,13,14)。
[0006] 虽然CSN依赖性CSN5示出有异肤酶活性，但在其它生理学相关形式中，其本质上 无活性。为了阐明CSN5活性的分子调控，本发明人通过X-射线晶体学、分子动力学（MD) 模拟和体外研究，从结构性和功能上对其CSN-独立形式进行表征。此外，本发明还提供了 对具有CSN5异肤酶活性的小分子、抗体、肤、假肤和多肤抑制剂的合理筛选的初步研究。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明设及突变的CSN5多肤及其在筛选可用作治疗剂的CSN5活性调节剂的方法 中的用途。
[000引发明详述
[0010] 本发明人分析了人类CSN5的无催化活性形式的晶体结构，从而阐明其活性状态 的分子基础。为了理解其活性控制，本发明人证明CSN5存在带有基本要素的催化结构域。 虽然CSN5活性位点具有催化能力并相容于与二异肤结合，但Ins-1段阻碍其接近底物结合 位点并且结构重排对底物口袋形成是必需的。通过MD对CSN5的详细研究掲示了Ins-1段 的柔性和可塑性的表象。运些分析带来对足W使CSN5呈活性异肤酶状态的活性/非活性 开关的触发分子的表征。本发明人证明，Ins-1段上的单个突变恢复了deneddylase活性。 本发明首次提供了对CSN5调节作用的深入理解。运些实验促进了对CSN5组成型活性形式 的设计，有助于在分子水平阐明其活化控制机制。
[0011] 本发明人证明，用除脯氨酸之外的另一个氨基酸残基取代ArglOe氨基酸残基恢 复了组成型异肤酶活性W及CSN5招募化dd8的能力。
[0012] 本发明人还证明，C0P9信号体的两个亚基CSN5和CSN6参与形成稳定的异源二聚 体。本发明人证明，CSN6能够显著地增强CSN5异肤酶和dened如lase活性，该作用在CSN5 的活化突变体形式CSN5R106T的情况下始终更显著于CSN5的WT形式。
[0013] 帝义:
[0014] 如本文所用，术语"CSN5"具有本领域的一般含义（1-5)，是指C0P9信号体复合 体亚基5。术语CSN5也被称为J油1。CSN5的示例性氨基酸序列示于表A中（SEQIDNO: 1-16)。该术语还包括SEQIDNO:1-16的功能保守变体。
[001引表A:CSN5多肤
[0016]
[0017]
[0018]如本文所用，术语"功能保守变体"是指衍生自本发明多肤的多肤，其中蛋白或酶 中给定的氨基酸残基已改变但不改变多肤的整体构象和功能，运包括但不限于，用具有相 似性质（例如极性、氨键电位、酸性、碱性、疏水性、芳族等）的一个氨基酸进行的氨基酸取 代。除了那些指示为保守氨基酸之外的氨基酸在蛋白中可W不相同，使得任何两个相似功 能的蛋白之间的蛋白或氨基酸序列相似性的百分比可能会变化且可能是，例如根据比对法 如通过Cluster法所测定的70 %至99%的相似性，其中相似性是基于MEGALIGN算法。"功 能保守变体"还包括通过BLAST或FASTA算法所测定的具有至少20 %，优选40 %，更优选 60%，优选至少75%，最优选至少85%W及甚至更优选至少90%氨基酸同一性的多肤，与 和其相比的天然或亲本蛋白有相同或基本相似的性质或功能，并且在与SEQIDNO:1的 106位的精氨酸相当的位置上具有关键的氨基酸。
[0019]本发明的多肤中对于激活/失活开关而言关键的氨基酸残基是指与SEQIDNO:1 的106位的保守精氨酸相当的位置上的氨基酸残基，其在保持本发明的多肤的构象不能与NeddS结合上是重要的，并且对于本发明的多肤的激活/失活开关W允许活性异肤酶状态 是关键的。
[0020] 如本文所用，术语"CSN6"具有本领域的通常含义（1)，是指C0P9信号体复合体亚 基6。CSN6的示例性氨基酸序列示于表B(SEQIDN0:17-25)。该术语还包括SEQIDNO: 17-25的功能保守变体。
[0021] 表B:CSN6 多肤
[0022]
[0023] 本发巧的《化
[0024] 本发明设及CSN5多肤的片段，其中对于所述多肤的激活/失活开关关键的氨基酸 残基被取代，从而使其呈活性异肤酶状态。
[0025] 在一些实施方式中，本发明设及多肤及其功能保守变体，所述多肤包含：
[0026]-范围从SEQIDNO:1的53位氨基酸到252位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:1的106位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0027]-范围从SEQIDNO:2的98位氨基酸到297位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:2的151位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0028]-范围从SEQIDNO:3的58位氨基酸到257位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:3的111位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0029] -范围从SEQIDNO:4的57位氨基酸到256位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:4的110位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0030] -范围从SEQIDNO:5的55位氨基酸到254位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:5的108位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0031] -范围从SEQIDNO:6的56位氨基酸到255位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:6的109位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0032] -范围从SEQIDNO:7的61位氨基酸到260位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:7的114位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0033] -范围从SEQIDNO:8的51位氨基酸到250位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:8的104位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0034] -范围从SEQIDNO:9的52位氨基酸到251位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQID NO:9的105位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[003引-范围从SEQIDNO:10的50位氨基酸到249位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQ IDNO: 10的103位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0036] -范围从SEQIDNO:11的50位氨基酸到249位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQ IDNO: 11的103位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0037] -范围从SEQIDNO:12的57位氨基酸到256位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQ IDNO: 12的110位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[003引-范围从SEQIDNO:13的57位氨基酸到256位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQ IDNO: 13的110位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0039] -范围从SEQIDNO:14的48位氨基酸到247位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQ IDNO: 14的101位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，
[0040] -范围从SEQIDNO:15的56位氨基酸到255位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQ IDNO: 15的109位的氨基酸被另一个氨基酸所取代，或
[00川-范围从SEQIDNO:16的75位氨基酸到273位氨基酸的氨基酸序列，其中SEQ IDNO: 16的127位的氨基酸被另一个氨基酸所取代。
[0042] 本发明设及CSN5多肤，其中对于所述多肤的激活/失活开关关键的氨基酸残基被 取代，从而使其呈现活性异肤酶状态。
[0043] 在一些实施方式中，本发明设及多肤及其功能保守变体，所述多肤包含：
[0044]-氨基酸序列SEQIDNO:1，其中SEQIDNO:1的106位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0045]-氨基酸序列SEQIDNO:2,其中SEQIDNO:2的151位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0046]-氨基酸序列SEQIDNO:3,其中SEQIDNO:3的111位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0047]-氨基酸序列SEQIDNO:4,其中SEQIDNO:4的110位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0048]-氨基酸序列SEQIDNO:5,其中SEQIDNO:5的108位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0049]-氨基酸序列SEQIDNO:6,其中SEQIDNO:6的109位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0050]-氨基酸序列SEQIDNO:7,其中SEQIDNO:7的114位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0051]-氨基酸序列SEQIDNO:8,其中SEQIDNO:8的104位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0052]-氨基酸序列SEQIDNO:9,其中SEQIDNO:9的105位氨基酸被另一个氨基酸所 取代，
[0053]-氨基酸序列SEQIDNO: 10,其