一种关于cd30免疫原多肽及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种关于CD30免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的CD30免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR?T细胞免疫治疗的应用。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞增殖，（2）抑制小鼠外周白细胞表面CD30表达，（3）能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR?T等细胞疗法。
【专利说明】
一种关于CD30免疫原多肽及其用途
技术领域
[0001] 本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的CD30免疫原 的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
【背景技术】
[0002] CD30(TNFRSF8)是最初发现于何杰金氏病(Hodgkin's disease)中的里丝氏细胞 (Reed Sternberg cell)上的跨膜糖蛋白。近年发现活化T细胞高表达该分子。尤其是，⑶30 可表达于多种恶性淋巴系统疾病，如霍奇金淋巴瘤(HL)、间变性大细胞性淋巴瘤(ALCL)、外 周T细胞淋巴瘤(PTCL)、成人T细胞性淋巴瘤(ATL)等，其中以T细胞淋巴瘤占大多数，如ALCL 肿瘤细胞中⑶30表达可达100%。
[0003] 相对于近年来B细胞淋巴瘤治疗领域中的异彩纷呈，如多种化疗方案，干细胞移 植，抗CD20单抗、硼替佐米、来那度胺、Ibrutinib等新型药物不断优化着治疗格局，外周T细 胞淋巴瘤的治疗则进展不大。主要方案以化疗为主要治疗手段，辅以放疗。目前，靶向治疗 复发/难治性CD30+T细胞淋巴瘤成为热门话题，已有诸多单药治疗研究见诸报道。有阿仑单 抗、硼替佐米、brentuximab vedotin(sALCL)、环抱素(AITL)、吉西他滨、普拉曲沙、罗米地 辛。食品药品监督管理局(FDA)批准的药物有普拉曲沙、罗米地辛、brentuximabvedotin(对 ALCL)，有效率分别为29%、25%、86%。
[0004] 肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免 疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行 体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗 肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
[0005] ⑶30可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，CD30由595个氨基酸残基组成，分 子量较大，较难得到纯度高的CD30。这样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且 会导致患者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免 疫原。
【发明内容】
[0006] 发明目的
[0007] 本发明提供一种CD30免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞免疫 应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
[0008] 技术方案
[0009] 本发明的技术方案在于提供一种C D 3 0免疫原多肽，序列为 APPVSPATMPVRDEYPPKQCEroYYLDEAGRCTACVA(SEQ ID NO: 1)。该氨基酸序列为全新的序列， 在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药 物中的应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
[0010] 有益效果
[0011] 本发明的CD30免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。 有益效果在于（1)促进T细胞增殖，（2)抑制小鼠外周白细胞表面CD30表达，（3)能与T细胞表 面的MHC有效的特异性结合，（4)能提高胸腺淋巴瘤小鼠生存率。作为细胞疗法的靶标分子， 应用于CAR-T等细胞疗法。
【具体实施方式】
[0012] 多肽由上海生工吉尔合成。
[0013] 实施例1
[0014] 用小鼠胸腺淋巴瘤模型检测⑶30免疫原多肽的体内活力。
[0015] 6-8W龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。⑴空白组；（2)多肽 低剂量组；（3)多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。腹腔注射DNA烷化剂N-甲基-N-亚硝基脲 (MNU)诱导小鼠胸腺淋巴瘤，建立相应动物模型，在造模后的第1、7、14、21天，分别进行免 疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量:5、10、20mg/Kg，在肿瘤周 围多点注射。28天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，多肽可有效提高荷瘤小鼠 的生存率，其中，剂量为20mg/Kg组的小鼠生存率达到67.90%。
[0016] 实施例2
[0017] 应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MHC的结合能力：
[0018] 将多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。将固定浓度为50y mo 1 /L的标记1251的多肽以及不同浓度（1-50M101 /L)的多肽加入反应体系（磷酸盐缓冲液 和MHC，所述的MHC试剂盒购自上海泛柯生物科技有限公司，试剂盒内有HLA-A1、A2、A3、A11 和A24)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和1251标记多肽复合物。待 测多肽与1251标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon 30，Amicon公司） 分离游离多肽和多肽MHC复合物，然后测定多肽MHC复合物的1251放射量，将此放射量与没 有竞争性抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本）的放射量比较，求待测多肽在抑 制50%标记多肽与腿(：结合时的浓度，8卩1050。由此得到，多肽对111^-六1^2^3^11和八24的 IC50值分别为5.21、4.83、6.51、4.97和7.25_〇1/1，均符合阳性多肽的标准（彡10虚）。因 此，多肽为具有有效结合能力的免疫原多肽。
[0019] 实施例3
[0020] T淋巴细胞的增殖作用:无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心（1000r/min，5min)，弃上清，TriS-NH4CL破解红细 胞，冰水浴静置3_5min，离心（1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷roS洗涤细胞两次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5 X106 个/ml，于96孔培养板中培养。
[0021] 实验设空白对照组、模型组（刀豆蛋白A，sigma公司购买）、多肽各剂量（5、10、 20mg/ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100iil/孔后，空白对照组加入1640培养液100 yl，模型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加 ConA(终浓度为5邱/1111)。37°(：细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20yl MTT，继 续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100y 1DMS0，震荡，用酶标仪检测570nm处0D值， 每孔设5个平行。
[0022]表1多肽对T淋巴细胞的增殖作用
[0024] *P〈〇 ? 05，#P〈0 ? 01 与模型组相比。
[0025]实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5 ~20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
[0026] 实施例4
[0027] 采用流式细胞技术测定免疫原多肽对免疫动物体内T细胞表面CD30表达的影响。 6-8w龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。（1)空白组；（2)免疫原多肽低剂量组； (3)免疫原多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进行免疫。方案为： 空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量 :5、10、2〇!^/私，在小鼠背部淋巴结附 近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层，用红细胞裂解液 破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的⑶30+-FITC(购自北京华泰昕生物医疗技 术有限公司)孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原多肽对CD30+T细胞的影响。 [0028]表2多肽对CD30抗体+T淋巴细胞的作用
[0030] *P〈〇 ? 05，**P〈0 ? 01 与空白组相比。
[0031 ]实验结果见表2，与空白组比较，多肽能抑制小鼠外周白细胞表面CD30表达，在剂 量为5~20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。
【主权项】
1. 一种⑶30免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列为SEQ ID NO: 1。2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于:在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于:在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫 应答药物中的应用。4. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于:在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105968188SQ201610436909
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司