单克隆抗体的纯化工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种从细胞培养物中纯化单克隆抗体的改善方法。期望的单克隆抗体纯化工艺包括亲合层析、疏水相互作用层析和可选的离子交换柱层析。其提供大于99%纯度的期望的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]从细胞培养基中纯化药物级单克隆抗体蛋白质包括收获/净化(clarificat1n)，接着通过使用一系列的柱层析步骤与膜超滤和渗滤结合而纯化。在纯化之后，期望的抗体制剂经适当配制并且存储在合适的条件中。然而，很多时候，这些步骤无法提供具有其药物应用所需的期望水平的纯度和质量的抗体。有时，在柱纯化期间，观察到工艺相关的和产物相关的杂质与期望的抗体一起共洗脱。因此，从期望的制剂中减少或去除这样的杂质是重要的。此外，蛋白质聚集(团聚，aggregat1n)是在单克隆抗体(mAb)生产期间主要关心的问题。聚集体的存在可以降低单克隆抗体的疗效并且已知在人类中引发免疫原应答(immunogenic responses) 0因此，在下游纯化期间，主要通过柱层析从单克隆抗体期望的制剂中去除聚集体是必须的。为了解决此问题，本发明提供了纯化抗体的新方法，其有助于以特定的方式通过使用一系列的柱层析从含有感兴趣的抗体的无细胞培养基中去除连同高分子量聚集体的工艺-和产物-相关的杂质达到期望的水平。在本发明中，所述纯化抗体的工艺以直截了当的方式证实良好控制的纯化工艺产生具有大于80 %的回收率的高纯度抗体制剂。在本发明中，高纯度抗体制剂是指至少有99%的纯度和基本上无工艺和产物相关的杂质和基本上没有高分子量蛋白质聚集体的抗体制剂。此外，本发明提供了一种高度可放大的(scalable)和可重复的纯化单克隆抗体工艺。就工艺经济性和工业生存性而言，所描述的新纯化工艺提供了一个用于纯化不同的治疗用途的抗体的公用平台。
[0003]这样的技术中的一些在以下专利中公开:
[0004]US 6417335公开了从包含抗体和污染物的组合物中纯化抗体的方法，所述方法包括:(a)加载该组合物至阳离子交换树脂上，其中在阳离子交换树脂上加载的抗体的量是每mL阳离子交换树脂约20mg至约35mg的抗体；以及(b)从该阳离子交换树脂洗脱抗体。
[0005]US 7863426描述了从包含抗体和至少一种HCP的混合物中生产宿主细胞蛋白质(HCP)减少的抗体制剂的方法，包括离子交换分离步骤，其中混合物易受到第一离子交换材料的影响，使得获得HCP减少的抗体制剂。
[0006]本发明领域的其它相关专利是US 6489447 EP 1075488 ；EP1308455 ；EP1308456B等等。通过引用将上述中的每一个的全部内容结合于此。
[0007]本发明提供了一种通过以独特的方式采用常规柱层析技术从而获得高纯度的期望抗体制剂同时去除工艺-和产物-相关的杂质(特别是蛋白质聚集体)的新抗体纯化工艺。我们在此公开了这样的纯化工艺。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种源自细胞培养物的粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法。
[0009]在一个方面中，本发明提供了一种从粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法，其包括一系列柱层析和超滤-渗滤步骤。
[0010]在另一个方面中，本发明提供了一种从粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法，其包括使用蛋白A亲和层析与疏水相互作用层析步骤。蛋白G或蛋白L在亲合层析步骤中可用作为柱基质(matrix)。
[0011]在其它方面中，蛋白A亲和层析步骤包括在用于结合的合适pH和/或电导系数(conductance)下，将含有期望抗体的粗制混合物加载至柱，接着在期望抗体以单峰形式洗脱之前进行柱冲洗。
[0012]在另一个方面中，根据本发明的方法包括三个柱冲洗步骤，其中(i)利用平衡缓冲液的第一冲洗，(ii)在与第一冲洗缓冲液相同的pH和/或比第一冲洗缓冲液更高的电导率(conductivity)下的第二冲洗，(iii)在低于第二冲洗的pH和/或电导率下的第三冲洗，(iv)在比第三冲洗更低的pH和/或更高的电导率下洗脱抗体。
[0013]在另一个方面中，利用梯度降低(down-the-gradient)的盐浓度进行根据本发明的疏水相互作用层析。
[0014]在进一步的方面中，本发明提供了一种从粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法，其包括蛋白A层析、疏水相互作用层析和离子交换柱层析。
[0015]在又一个方面中，本发明提供了一种从粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法，其包括与用于再调节(recondit1ning)蛋白溶液的超滤-渗滤相结合的蛋白A层析、疏水相互作用层析和离子交换柱层析。此处术语蛋白溶液是指污染蛋白质和期望抗体的混合物或者通过本文所述的方法获得的相对纯的期望抗体制剂。
[0016]在其它方面中，根据本发明的离子交换层析选自阳离子交换层析和阴离子交换层析，优选阴离子交换层析。
[0017]在优选的实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体的纯化方法，包括以下步骤:
[0018]1.蛋白A层析
[0019]2.疏水相互作用层析
[0020]3.阴离子交换层析
[0021]可以以任何次序进行疏水相互作用层析和离子交换层析步骤。
[0022]蛋白A柱步骤可用于从粗制混合物中捕获单克隆抗体并可用于以结合-洗脱模式从柱中洗脱具有高纯度水平的期望的单克隆抗体。疏水相互作用层析步骤用于以结合-洗脱模式进一步去除工艺-和产物-相关的杂质。采用阴离子交换层析用于以流动-通过模式进一步去除工艺-相关的杂质。
[0023]在一个方面中，可以根据本发明纯化的抗体包括抗HER2抗体、抗TNF α抗体、抗VEGF抗体、抗⑶20抗体、抗⑶52、抗RANKL、抗IgE抗体等。
[0024]在其它方面中，本发明提供了一种在蛋白A亲和层析步骤之后具有不大于5%的聚集体的量的抗体制剂。
[0025]在另一个方面中，本发明提供了一种具有不大于1%，更优选不大于0.5%的聚集体的量的抗体制剂。
[0026]在本说明书中使用的缩写定义如下:
[0027]蛋白A:蛋白A交联的琼脂糖凝Jj父柱。
[0028]HIC:疏水相互作用柱层析。
[0029]AEX:阴离子交换柱层析。
[0030]ΗΡ-SEC:高效-体积排阻层析(high-perfomance-size exclus1nchromatography)ο
[0031]MWCO:分子量截留。
[0032]NaCl:氯化钠。
[0033]WF1:注射用水。
【附图说明】
[0034]图1示出了通过蛋白A亲合柱层析的阿达木单抗(adalimumab)的洗脱曲线。
[0035]图2示出了通过分析HP-体积排阻层析(ΗΡ-SEC)的蛋白A亲合纯化的阿达木单抗的纯度。该图示出了在第一次柱纯化之后实现了阿达木单抗的纯度大于99%。
[0036]图3示出了通过疏水相互作用柱层析的阿达木单抗的洗脱曲线。
[0037]图4示出了通过分析HP-体积排阻层析(ΗΡ-SEC)的HIC纯化的阿达木单抗的纯度。该图示出了在第二次柱纯化之后实现了阿达木单抗的纯度大于99 %。
[0038]图5示出了阿达木单抗的阴离子交换柱层析曲线。
[0039]图6示出了通过分析HP-体积排阻层析(ΗΡ-SEC)的AEX柱纯化的阿达木单抗的纯度。该图示出了在AEX柱纯化之后实现了阿达木单抗的纯度大于99%。
[0040]图7示出了通过分析HP-体积排阻层析(ΗΡ-SEC)的纯化的阿达木单抗的纯度。该图示出了在最终制剂中在纯化结束时实现了阿达木单抗的纯度大于99 %。
[0041]图8示出了通过分析HP-体积排阻层析(ΗΡ-SEC)的HIC纯化的利妥昔单抗(rituximab)的纯度。该图示出了在第二次柱纯化之后实现了利妥昔单抗的纯度大于99%。
[0042]图9示出了通过分析HP-体积排阻层析(ΗΡ-SEC)的HIC纯化的曲妥单抗(trastuzumab)的纯度。该图示出了在第二次柱纯化之后实现了曲妥单抗的纯度大于99%。
【具体实施方式】
[0043]本发明描述了通过使用一系列柱层析步骤纯化源自细胞培养物的单克隆抗体的方法，包括与超滤和渗滤相结合的亲和柱层析、疏水相互作用柱层析和离子交换柱层析。
[0044]在一种实施方式中，本发明提供了一种通过使用蛋白A柱层析首先捕获，随后可选地在添加剂/盐存在下在低pH从柱中洗脱具有高纯度水平的蛋白质而从粗制混合物纯化源自细胞培养物的单克隆抗体的方法。粗制混合物可以包括宿主细胞衍生的污染蛋白质、产物有关的物质和除感兴趣的蛋白之外的其它杂质。在亲合层析步骤中，蛋白G或蛋白L可用作柱基质。
[0045]在另一种实施方式中，根据本发明的方法包括三个柱冲洗步骤，其中(i)利用平衡缓冲液的第一冲洗，(ii)在与第一冲洗缓冲液相同的pH和/或比第一冲洗缓冲液更高的电导率下的第二冲洗，(iii)在低于第二冲洗的pH和/或电导率下的第三冲洗，(iv)在比