专利名称：人化抗-人nkg2a单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及⑶94/NKG2A受体的非竞争性拮抗剂，包括某些抗-NKG2A抗体，特别是 鼠抗-NKG2A抗体Z199的人化形式，以及生产和使用所述抗体的方法。
背景技术：
⑶94/NKG2A是发现于天然杀伤细胞(NK细胞)，天然杀伤T细胞(NKT细胞)和T 细胞(α/β和γ/δ)的亚组的抑制受体。⑶94/NKG2A限制前述淋巴细胞对表达⑶94/ NKG2A-配体HLA-E的细胞的细胞因子释放和细胞毒性应答(见例如，W099/28748)。还发 现HLA-E被某些肿瘤细胞(Derre et al.，JImmunol 2006 ；177 :3100_7)和活化的内皮细 胞(Coupel et al.，Blood 2007 ； 109 :2806_14)以可溶形式分泌。抑制 CD94/NKG2A 信号传 导的抗体可能提高淋巴细胞对HLA-E阳性靶细胞的细胞因子释放和溶胞活性，例如CD94/ NKG2A阳性肿瘤特异性T细胞对表达HLA-E的肿瘤细胞的应答，或对病毒感染细胞的NK应 答。因此，抑制⑶94/NKG2A而不刺激杀伤表达⑶94/NKG2A细胞的治疗性抗体(即，非衰竭 性抗体(non-d印leting antibody))可能在癌症患者中诱导肿瘤生长的控制。另外，某些淋巴瘤例如，NK-淋巴瘤，特征为⑶94/NKG2A表达。在所述患者中，靶 向和杀伤表达⑶94/NKG2A的细胞的治疗性抗体(S卩，耗竭性抗体)可能能够通过抗体依赖 性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)根除肿瘤细胞。抗-NKG2A抗体也已经被 建议用于治疗自身免疫或炎性疾病(见例如，US20030095965, W02006070286)。多种抗NKG2A抗体已在本领域中描述。例如，Sivori等人(Eur JImmunol 1996 ； 26 2487-92)提到鼠抗-NKG2A 抗体 Z270 ；Carretero 等人(EurJ Immunol 1997 ；27 :563_7) 描述鼠抗-NKG2A抗体Z199(现在可商业获得于Beckman Coulter, Inc.，产品号IM2750， USA) ；Vance 等人(J Exp Med 1999 ； 190 1801-12)提到大鼠抗-鼠 NKG2-抗体 20D5 (现在 可商业获得于BD Biosciences Pharmingen，目录号.550518，USA)；和美国专利申请公开 20030095965描述了鼠抗体3S9，其据称结合于NKG2A，NKG2C和NKG2E。目前可获得的抗-CD94/NKG2A抗体是非人源的，由于它们的免疫原性，这使得它 们不适于大多数在人中的治疗应用。相应地，需要适于治疗人患者的抗-CD94/NKG2A抗体。发明概述本发明提供了 NKG2A结合试剂，例如抗-NKG2A抗体，以及包含所述试剂的组合物， 和生产和使用所述试剂的方法。所述试剂典型地是人CD94/NKG2A受体的非竞争性拮抗剂， 并且降低所述受体的抑制活性而不阻断它的配体，HLA-E的结合。在一个实施方式中，所述 试剂是如下抗体，所述抗体以比与NKG2C显著更高的亲合力结合NKG2A，并且结合包含残基 P94-N107和/或M189-E197的NKG2A区段，或两种区段。在另外的或替代的实施方案中，所 述试剂与鼠抗-NKG2A抗体Z 199竞争与CD94/NKG2A的结合。所述试剂可以是，例如，人或 人化的抗-NKG2A抗体。在一个实施方式中，所述人化抗体是人化形式的Z199。提供了所述具有改善的性 质的人化抗体的示例性的互补决定区(CDR)残基或序列和/或用于在框架区(FR)的氨基 酸取代的位点，所述改善性质例如，更低的免疫原性，改善的抗原结合或其他功能性质，和/或改善的物理化学性质例如，更好的稳定性。在一个方面，本发明提供了人化抗体，其中 Z199Kabat⑶R的至少一部分与人接纳体(acceptor)序列的相应部分同一。在一个实施方 式中，人框架序列包含至少一个回复突变，例如，1，2，3，4，5或6个回复突变。在另一实施方 式中，可变轻(VL)结构域的人框架序列包含单个回复突变。在其他方面，本发明提供了药物组合物，其包含所述试剂和载体，还提供了缀合 物，其包含缀合于例如细胞毒性或可检测试剂的所述试剂。在其他方面，本发明提供了编码所述试剂的核酸和载体，以及包含所述核酸和/ 或载体的宿主细胞。还提供了通过培养所述宿主细胞以生产所述核酸来生产所述试剂的重 组方法。在其他方面，本发明提供了制备的物品，其包含容器，所述容器包含所述试剂和指 示使用者治疗患者中的病症例如癌症或病毒疾病的说明书。任选地，物品可包含另一容器， 所述容器包含另一试剂，其中说明书指示使用者利用抗体与该试剂联合治疗病症。本发明还提供了将所述本发明的试剂用于治疗患者中的病症的方法，所述病症例 如癌症，病毒性疾病，炎性病症或自身免疫病症，任选地，与另一抗癌症，抗病毒性疾病试 剂，或抗炎性试剂联合。附图描述
图1显示了 Cr-51释放测定的结果，其评价表达⑶94/NKG2A的NKL细胞杀伤表 达或缺乏功能性HLA-E的靶细胞的能力，以及鼠抗体HP-3D9 (A)(抗-CD94)或Z199(B) (抗-NKG2A)对表达HLA-E的靶细胞的杀伤的效果。NKL细胞有效地杀伤缺乏功能性HLA-E 的Cr-51-标记的靶细胞，而表达功能性HLA-E的靶细胞被较不有效地杀伤。当NKL细胞与 Z199预孵育时，表达HLA-E的靶细胞与缺乏HLA-E的靶细胞同样好地被杀伤，证实了 Z199 功能性地抑制⑶94/NKG2A。图2显示了 Biacore实验，其中与HLA-E四聚物预孵育的单链⑶94/NKG2A Fc (scCD94-NKG2A-Fc)构建体可结合Z199,而HP-3D9被防止结合。图3显示了过表达CD94/NKG2A的Ba/F3细胞结合HLA-E四聚物，HP-3D9，和Z199， 如通过流式细胞术所评价的。当与Z199预孵育时，Ba/F3-⑶94/NKG2A细胞仍然可结合 HLA-E四聚物，而当与HP-3D9预孵育时不结合。图4显示了对于Z199的VL(SEQ ID NO 2)禾口 VH(SEQ ID NO 4)序列的人化的序 列分析。在显示根据Kabat方案的残基编号的第一行中，用下划线显示掩蔽(mask)，并且 Kabat⑶R以粗体显示。在种系序列中，用灰色背景给出小鼠/人种系差异(VKIII_L6/JK2 SEQ IDNO 12 ；VH3_21/JH3 :SEQ ID NO 14)。给出了对于人化Z199 (humZ199)的 VL(SEQ ID NO 13)和VH(SEQ ID NO 15)区产生的序列，作为人的潜在回复突变残基以粗体和下划线 表不。图5显示了具有在轻链中的回复突变E1Q，L46P，L47W，I58V或D70S的humZ199变 体在Biacore中的结合概况。而重组表达的亲本鼠抗体Z199 (rec)和具有人IgG4 (S241P) 部分的嵌合Z199 (chim)有效地结合sc⑶94/NKG2A-FC，没有任何回复突变的人化 Z199 (hum)具有结合sc⑶94-NKG2A-Fc的非常低的能力。通过比较，Z199轻链中的单个回 复突变L46P恢复所述结合。图6显示了具有与轻链中的L46P组合的选择的回复突变的humZ199变体的亲合力测定。每个突变体的KD值标准化到具有轻链中L46P突变的humZ199(在图中称为 "huZ199 (LC :L46P) ” )的KD值来获得KD的相对变化。图7显示了在Z199VL和VH序列中作出的Ala突变的位点，如通过星号显示的。对 于序列标识符参见图4。图8显示了具有在VH区的丙氨酸突变的Z199与固定的sc⑶94_NKG2A_Fc的结合， 标准化到chimZ199的结合。图9显示了具有在VL区的丙氨酸突变的Z199与固定的sc_⑶94_NKG2A_Fc的结 合，标准化到chimZ199的结合。图10显示了将暴露的残基(下划线)作图到NKG2A(SEQ ID NO 11)和NKG2C(SEQ ID NO 16)的比对之上。使用从NKG2A序列的残基编号。保守残基用*标记。定义本文中术语“抗体”以最广泛的意义使用，特别地包括全长单克隆抗体，多克隆 抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示出期望的生物活 性(例如，结合人CD94/NKG2A)。与抗体生产相关的多种技术提供于，例如，Harloff,等人， Antibodies ALaboeatoey Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y.，(1988).)。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其抗体结合或可变区，并且包括合成和 半合成的抗体来源分子。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab，)2、F(ab) 3、Fv (典 型地抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv (scFv)、dsFv、Fd片段(典型地VH和CH 1结构 域)和dAb (典型地VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；微型抗体(minibody)、 双抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)和kappa body (见例如 111等人，Protein Eng 1997 ；10 :949_57)；骆驼IgG ；IgNAR ；和从抗体片段和一种或更多 种分离的CDR或功能性互补位形成的多特异性抗体片段，其中分离的CDR或抗原结合残基 或多肽可缔合或连接在一起以形成功能性抗体片段。多种类型的抗体片段已经描述或综述 于，例如 Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005 ；23，1126-1136 ；W02005040219,以 及公开的美国专利申请20050238646和20020161201。如本文所用，术语“抗体衍生物”包含全长抗体或抗体片段，优选至少包含其抗原 结合或可变区，其中一个或更多个氨基酸被化学修饰，例如通过烷化，PEG化，酰化，形成酯 或形成酰胺等等，例如，用于将抗体与第二分子连接。这包括但不限于PEG化抗体，半胱氨 酸-PEG化抗体，及其变体。本文使用的“免疫缀合物”包含与第二试剂，例如细胞毒性剂，可检测试剂等，缔合 或连接的根据本发明的试剂，例如抗体衍生物。“人化”抗体是人/非人嵌合抗体，其包含源于非人免疫球蛋白的最小序列。对于 大部分，人化抗体是人免疫球蛋白(接纳体抗体)，其中来自接纳体超变区的残基被来自非 人物种，例如小鼠，大鼠，兔，或非人灵长类动物，的具有期望特异性，亲和性和能力的的超 变区残基(供体抗体)取代。在一些例子中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的 非人残基取代。而且，人化抗体可包含在接纳体抗体或供体抗体中未发现的残基。产生这 些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人化抗体将包含基本上所有的至少一种，典型两种， 可变结构域，其中所有或基本上所有超变环对应于非人免疫球蛋白的的超变环，并且所有
5或基本上所有FR残基是人免疫球蛋白序列的FR残基。人化抗体还可任选包含至少一部 分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型人免疫球蛋白的该部分。进一步的细节见例如，Jones等 人，Nature 321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等人，Nature 332 :323_329 (1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)，WO 92/02190，美国专利申请 20060073137，和美 国专利 6，750，325，6，632，927，6，639，055，6，548，640，6，407，213，6，180，370，6，054，297， 5，929，212,5，895，205,5，886，152,5，877，293,5，869，619, 5，821，337, 5，821，123, 5，770，196,5，777，085,5，766，886,5，714，350,5，693，762,5，693，761,5，530，101, 5，585，089，和 5，225，539。术语“超变区”当在本文中使用时指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区 一般包含来自“互补决定区”或“⑶R” (轻链可变结构域中残基24-34 (Li)，50-56 (L2)和 89-97 (L3),以及重链可变结构域中的 31-35 (Hl)，50-65 (H2)和 95-102 (H3) ；Kabat 等人 1991，上文)的氨基酸残基和/或来自“超变环”(轻链可变结构域中的残基26-32 (Li)， 50-52 (L2)和 91-96 (L3)，以及重链可变结构域中的 26-32 (Hl)，53-55 (H2)和 96-101 (H3)， Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)的那些残基。典型地，在此区域的氨 基酸残基的编号是通过描述于Kabat等人上文的方法实施。本文中的短语例如“Kabat位 点”，“Kabat残基”，“利用Kabat编号”，“如Kabat中的可变结构域编号”和“根据Kabat”指 重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。利用Kabat编号系统，肽的实际的线性氨 基酸序列可包含更少或另外的对应于缩短或插入可变结构域FR或CDR的氨基酸。例如，重 链可变结构域可包括在⑶R H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)， 以及在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。通 过将抗体序列与“标准” kabat编号序列在同源区比对，可确定给定抗体的残基的Kabat编 号。除非有另外的提示或与上下文相反，本文描述的VL或VH序列的所有氨基酸残基的位 点是根据kabat。“框架区”或” FR”残基是本文定义的⑶R之外的VH或VL残基。多肽的“变体”指具有与参考多肽，典型地为天然或“亲本”多肽，基本上同一的氨 基酸序列的多肽。多肽变体可具有在天然氨基酸序列的某些位点的一个或更多个氨基酸取 代，缺失，和/或插入。“保守”氨基酸取代是其中用具有具有类似物理化学性质的侧链的氨基酸残基取 代氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域已知的，并且包括具有碱性侧 链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷 氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨 酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸， 异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β _支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸， 异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。上下文中术语两个氨基酸序列的“基本上同一”意味着，当最佳比对时，例如通过 利用缺省缺口权重(default gap weight)的程序GAP或BESTFIT，序列共享至少大约50%， 至少大约60%，至少大约70%，至少大约80%，至少大约90%，至少大约95%，至少大约 98%，或至少大约99%的序列同一性。在一个实施方式中，不同一的残基位点通过保守氨基 酸取代而区分。序列同一性典型地利用序列分析软件而测量。利用对不同取代，缺失和其他
6修饰，包括保守氨基酸取代的类似性的测量，蛋白分析软件使类似序列匹配。例如，公众可 获得的GCG软件包含例如“Gap”和“BestFit”的程序，其可与缺省参数一起使用以确定密 切相关的多肽，例如来自生物体的不同物种之间的同源多肽之间，或野生型蛋白和其突变 体之间，的序列同源性或序列同一性。见例如，GCG 6.1版。还可利用FASTA或ClustalW， 应用缺省或推荐参数，而比较多肽序列。在GCG 6. 1版中的程序，FASTA(例如，FASTA2和 FASTA3)，提供了查询和检索序列之间的最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson， Methods Enzymo1. 1990 ；183 63-98 ；Pearson,Methods Mol.Biol. 2000 ；132 185-219)。当 将序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据库比较时，或当推论其时，另一优选的算 法是计算机程序BLAST，特别是blastp，其利用缺省参数。见例如，Altschul等人，J. Mol. Biol. 1990 ；215 403-410 ；Altschul 等人，Nucleic AcidsRes. 1997 ；25 :3389_402 (1997)； 每种通过援引并入本文。在两种基本上同一的氨基酸序列中的“相应的”氨基酸位点是通 过本文提到的任何蛋白质分析软件，典型地利用缺省参数，比对的那些。具有参考抗体(例如，Z199)的“生物学特性”的抗体是具有该抗体的使其区别于 结合相同抗原(例如，NKG2A)的其他抗体的一种或更多种生物学特性的抗体。例如，具有 Z199的生物学特性的抗体可阻断NKG2A的活化，和/或与Z 199在结合NKG2A的细胞外结 构域中交叉竞争。NKG2A(0MIM161555,其全文通过援引并入本文)是NKG2组转录物的成员 (Houchins，等人(1991) J. Exp. Med. 173 1017-1020)。NKG2A 被 7 个外显子编码，横跨 25kb， 显示出一些差异剪接。与⑶94 一起，NKG2A形成了在NK细胞，α/β T细胞，γ/δ T细胞， 和NKT细胞的亚组表面发现的异二聚抑制性受体⑶94/NKG2A。类似于抑制性KIR受体，它 在细胞质结构域中具有ΙΤΙΜ。如本文所用，“NKG2A”指NKG2A基因或编码蛋白的任何变体， 衍生物或同种型。还包括与野生型，全长NKG2A共享一种或更多种生物学性质或功能，并且 共享至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高核苷酸或氨基酸同一性的任 何核酸或蛋白序列。人NKG2A包含在3个结构域中的233个氨基酸，具有包含残基1_70的 细胞质结构域，包含残基71-93的跨膜区域，和包含残基94-233的细胞外区域，具有下述序 列MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAP EKLIVGILGIICLILMASWTIfflPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTffEESLLA CTSKNSSLLSI DNEEEMKFLSI ISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQC GSSIIYHCKHKL(SEQ ID NO: 11).NKG2C (SEQ ID NO :16, 0MIM602891,其全文通过援引并入本文)和 NKG2E(0MIM602892，其全文通过援引并入本文)是NKG2组转录物的两种其他成员 (Gilenke，等人(1998) Immunogenetics 48:163-173)。CD94/NKG2C 和 CD94/NKG2E 受体是 发现于淋巴细胞亚组例如NK细胞和T细胞表面的活化受体。HLA-E (0MIM143010，其全文通过援引并入本文)是非经典的MHC分子，其在细胞 表面表达，并且通过肽，例如源于其他MHC 1类分子的信号序列的片段，的结合而被调节。 HLA-E的可溶形式也已被鉴定。除了它的T细胞受体结合性质，HLA-E结合天然杀伤(NK) 细胞，天然杀伤T-细胞(NKT)和T细胞(α / β和γ / δ )的亚组，其通过与⑶94/NKG2A， CD94/NKG2B，和 CD94/NKG2C 特异性结合(见例如，Braud 等人(1998) Nature 391 :795_799，其全文通过援弓I并入本文)。HLA-E的表面表达保护靶细胞免于被CD94/NKG2A+NK，T，或NKT 细胞克隆溶解。如本文所用的，“HLA-E”指HLA-E基因或编码蛋白的任何变体，衍生物，或 同种型。还包括与野生型，全长HLA-E共享一种或更多种生物学性质或功能，并且共享至少 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸 或蛋白序列。当被置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸为“可操纵连接”。例如，前序列或 分泌前导序列的DNA可操纵连接于多肽的DNA，如果它表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动 子或增强子可操纵连接于编码序列，如果它影响序列的转录；或者核糖体结合位点可操纵 连接于编码序列，如果它的安置促进了翻译。一般地，“可操纵连接”表示被连接的DNA序列 是邻接的，并且在分泌前导序列的例子中，邻接并且位于阅读相中。然而，增强子不必须是 邻接的。通过在方便的限制性位点连接而完成连接。如果所述位点不存在，则根据通常的 实践使用合成的寡核苷酸衔接头(adaptor)或连接物(linker)。“分离的”分子是为组合物中的主要种类的分子，其中根据其属于的分子种类发现 它(即，其组成组合物中至少大约50%的分子类型，典型地组成组合物中至少大约70%，至 少大约80 %，至少大约90 %，至少大约95 %，或更多的分子种类，例如，肽)。通常，在组合 物中所有存在的肽种类的上下文下，或在建议用途的上下文中至少对于基本上活性的肽种 类，抗体分子的组合物将显示出对于抗体分子98%、98%或99%的同源性。在本发明的上下文中，“治疗”指预防，减轻，改善，控制，治愈或减少疾病或病症的 一种或更多种症状或临床相关表现，除非上下文有相反指示。例如，没有疾病或病症的症状 或临床相关表现被鉴定的患者的“治疗”是预防性的治疗，然而，已被鉴定为具有疾病或病 症的症状或临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成预防性治疗。在本发明的上下文中，“⑶94/NKG2A阳性淋巴细胞”指在细胞表面上表达⑶94/ NKG2A的淋巴系的细胞(例如，NK-，NKT-和T-细胞)，其可通过例如，利用特异性识别⑶94 和NKG2A上的组合表位或仅NKG2A上的表位的抗体的流式细胞术来检测。“⑶94/NKG2A阳 性淋巴细胞”也包括淋巴起源的永生细胞系(例如，NKL, NK-92)。在本发明的上下文中，“降低在⑶94/NKG2A阳性淋巴细胞表面上表达的人⑶94/ NKG2A受体的抑制活性”指如下过程，其中CD94/NKG2A在它负性影响导致淋巴细胞应答 例如细胞因子释放和细胞毒性应答的细胞内过程的能力方面被抑制。这可例如在基于标 准NK-或T-细胞的细胞毒性测定中测量，在所述测定中治疗化合物刺激HLA-E阳性细胞 被CD94/NKG2A阳性淋巴细胞杀伤的能力被测量。在一个实施方式中，抗体制品导致CD94/ NKG2A-限制的淋巴细胞的细胞毒性至少10%的增加，优选淋巴细胞细胞毒性至少40%或 50%的增加，或更优选NK细胞毒性至少70%的增加，并且援引所描述的细胞毒性测定。在本发明的上下文中，“结合人⑶94/NKG2A受体的试剂”指利用任何标准测定可检 测地结合人⑶94/NKG2A受体的试剂，在所述测定中所述试剂在⑶94/NKG2A或NKG2A的存 在下孵育，并且结合通过下述来检测，例如，放射标记，物理方法例如质谱法，或直接或间接 荧光标记检测，利用例如，细胞荧光测定分析(例如，FACScan)。超过用对照，非特异性试剂 所见量的结合量表明试剂结合靶标。在本发明的上下文中，“Z199抗体”是如 Carretero et al. (Eur JImmunol 1997 ； 27 563-7)所述的鼠抗-NKG2A抗体Z199，现在通过Beckman Coulter, Inc.可商业获得，产品号IM2750，USA。Z199的VH和VL序列的测定描述于实施例2。人化形式的Z199在本文 中可表示为 “humZ199”，“huZ199”，“hzZ199”，或 “hZ199”。发明描述本发明部分基于如下发现，结合人NKG2A的细胞外部分的某些试剂是非竞争性的 拮抗剂，即，降低CD94/NKG2A受体的抑制活性，而不阻断HLA-E与受体的结合。优选的试剂 结合抑制性CD94/NKG2A受体的效率高于活化性CD94/NKG2C受体。如本文所示的，所述试 剂可结合包含残基P94-N107，M189-E197或两者的NKG2A(SEQ IDNO 11)的区段。本发明的 非竞争性CD94/NKG2A拮抗剂可用作若干种类型的疾病和病症，例如癌症，病毒疾病，自身 免疫疾病和/或炎性病症中的治疗试剂。非竞争性拮抗剂可有利地用于，例如存在可溶性 HLA-E的治疗应用。一种本文所述的非竞争性拮抗剂是抗-NKG2A抗体，特别是适于治疗人类患者的 抗体。所述抗体可以是人抗体或人化形式的非人(例如，鼠)抗体。与鼠抗体Z199竞争与 人CD94/NKG2A的结合的人或人化抗体是本发明的特定方面。在一个实施方式中，与Z199竞 争与CD94/NKG2A受体的结合的人或人化抗体结合包含残基P94-N107，M189-E 197的NKG2A 区段，或结合两种区段。例如，抗体可结合包含选自NKG2A的P94，S95，T96，L97，198，Q99， R100，H101，L106，M 189，或E 197的残基的表位。在另一实施方式中，抗体与Z199结合相 同表位。如实施例所述，发现Z199为在淋巴细胞上表达的人CD94/NKG2A受体的非竞争性 拮抗剂，因为Z199抑制⑶94/NKG2A的功能(表1所图示)，但不影响HLA-E与⑶94/NKG2A 受体的结合(图2和3)。Z 199进一步以高特异性结合⑶94/NKG2A受体，KD为结合⑶94/ NKG2C受体的至多1/100。在另一方面，本发明提供了为人化形式的Z 199的特定人化抗体。所述抗体典型 特征为包含在人框架序列中的来自Z199CDR的关键氨基酸残基。例如，人化Z199抗体可 包含Z199VL结构域中的Kabat残基Y32，L50，和P95，以及Z199VH结构域中的Kabat残基 Y56，Y98和P99。在Z199VH和VL序列中，这些对应于在对应于在Z199CDR中的那些的Kabat 位点中的Z199VL结构域(SEQ ID NO 2)的氨基酸残基Y31，L49，和P94，和Z199VH结构域 (SEQ ID NO 4)的氨基酸残基 Y57，Y102，和 P103。人化Z199抗体可进一步包含在人框架序列中的一个或更多个回复突变，来例如， 增强亲合力，稳定性，或人化抗体的其它性质。优选的回复突变包括产生包含下述的人化抗 体的那些Z199VL结构域序列的氨基酸残基Ql，P45，W46，V57，和S69的一个或更多个，和 /或Z199VH结构域序列的氨基酸残基A49，T78，和T97的一个或更多个，优选至少Z199VL 结构域序列的残基P45，优选在对应于在Z199VH和VL结构域的那些的Kabat位点。在一 个实施方式中，人化Z199抗体包含至少Z199VL结构域序列的氨基酸残基24-33，49-55， 和88-96，和至少Z199VH结构域序列的氨基酸残基31-35，50-60和99-108，任选地还有 219抓!1结构域序列的残基62，64，66。人化抗体还可包含插入⑶R，特别是⑶R Ll的一个或 更多个氨基酸，例如，插入Z199VL结构域的残基30和31之间的丝氨酸(S)。在另一个方面，本发明提供了分离的抗体，其结合人CD94/NKG2A受体并且包含(a)包含 SEQ ID NO 5 的 CDR-Ll ；(b)包含 SEQ ID NO 6 的 CDR-L2 ；(c)包含 SEQ ID NO 7 的 CDR-L3 ；
(d)包含 SEQ ID NO 8 的 CDR-Hl ；(e)包含 SEQ ID NO 9 的 CDR-H2 ；(f)包含 SEQ ID NO 10 的 CDR-H3 ；(g)人框架序列；和(h)在VL结构域的Kabat位点46的脯氨酸(P)残基。在Kabat位点46的脯氨酸(P)残基可天然存在于人VL框架序列，或可通过序列 的氨基酸取代或其它修饰引入。在一个特定的实施方式中，抗体包含VL序列和VH序列，所 述VL序列包含具有L46P突变的SEQ ID NO 13，所述VH序列包含SEQ ID N0:15。抗体可 进一步包含IgG4恒定结构域，其具有任选的S241P突变来改善稳定性。这些和其它方面在下面部分和实施例中更详细地描述。试剂本发明涉及结合人CD94/NKG2A受体的细胞外部分的试剂，其中所述试剂(a)降低 在⑶94/NKG2A阳性淋巴细胞表面上表达的人⑶94/NKG2A受体的抑制活性；和(b)能够与 HLA-E同时结合⑶94/NKG2A，其中所述试剂不是Z199抗体。在另外的或替代的实施方式中，本发明涉及结合人CD94/NKG2A受体的细胞外部 分的试剂，其中所述试剂(a)降低在⑶94/NKG2A阳性淋巴细胞表面上表达的人⑶94/NKG2A 受体的抑制活性；和(b)不与HLA-E竞争与CD94/NKG2A的结合，其中所述试剂不是如下抗 体，所述抗体包含包含SEQ ID NO 2的轻链可变结构域(VL)序列和包含SEQID NO 4的重 链可变结构域(VH)序列。在本发明的一个方面，⑶94/NKG2A阳性淋巴细胞选自NK细胞，细胞毒性T细胞例 如α / β T细胞或γ / δ T细胞，和NKT细胞。在本发明的一个方面，所述试剂是选自以下的抗体全长抗体，抗体片段，和合成 或半合成抗体来源分子，其至少包括来自与Ζ199抗体竞争与CD94/NKG2A的结合的抗体的 CDR。在本发明的一个方面，所述试剂是选自全长人抗体，人化抗体，和嵌合抗体的抗 体。在本发明的一个方面，所述试剂是选自IgA，IgD, IgG, IgE和IgM抗体的抗体。在本发明的一个方面，所述试剂是包含选自IgGl，IgG2，IgG3和IgG4同种型的人 恒定结构域的抗体。在本发明的一个方面，所述试剂是选自IgA，IgD, IgG, IgE和IgM抗体的抗体的片段。在本发明的一个方面，所述试剂是包含选自IgGl，IgG2，IgG3和IgG4的恒定结构 域的抗体的片段。在本发明的一个方面，所述试剂是选自Fab片段，Fab'片段，Fab' -SH片段， F(ab)2片段，F(ab' ) 2片段，Fv片段，重链Ig (美洲陀羊(llama)或骆驼Ig)，Vhh片段，单 结构域FV，和单链抗体片段的抗体片段。在本发明的一个方面，所述试剂是选自以下的合成或半合成抗体来源分子scFV， dsFV，微型抗体(minibody)，双抗体(diabody)，三链抗体(triabody)，kappa body, IgNAR ； 和多特异性抗体。
本发明由此涉及结合NKG2A的抗体或其它试剂。在一个方面，抗体是人化形式的 抗体Z199，其是鼠单克隆抗体，与NKG2A结合的KD是与人NKG2C或NKG2E的至多1/100。 Z199可阻断人⑶94/NKG2A的功能，并且特异性诱导细胞被⑶94/NKG2A-限制的淋巴细胞以 浓度依赖模式的杀伤。在本发明的一个方面，试剂通过干扰⑶94/NKG2A信号传导降低表达⑶94/NKG2A 的淋巴细胞的⑶94/NKG2A-介导的抑制，所述干扰通过，例如，防止或诱导⑶94/NKG2A受体 的构象变化，和/或影响CD94/NKG2A受体的二聚化和/或群集。在本发明的一个方面，试剂结合NKG2A的细胞外部分的KD为结合NKG2C的至多 1/100。在进一步优选的方面，试剂结合NKG2A的细胞外部分的KD为结合NKG2C的至多 1/150，1/200，1/300，1/400，或1/10. 000。在本发明的另一方面，试剂结合NKG2A的细胞 外部分的KD为结合NKG2C或NKG2E分子的至多1/100。在进一步优选的方面，试剂结合 NKG2A的细胞外部分的KD为结合NKG2C或NKG2E分子的至多1/150，1/200，1/300，1/400， 或1/10. 000。这可以例如在BiaCore实验中测量，其中试剂结合固定的⑶94/NKG2A的细胞 外部分(例如，从表达⑶94/NKG2的细胞纯化，或在生物系统中生产)的能力被测量，并且 与试剂与类似生产的CD94/NKG2C和/或其它CD94/NKG2变体在相同测定中的结合相比较。 可选地，试剂与天然表达，或过表达(例如，瞬时或稳定转染之后)⑶94/NKG2A的细胞的结 合可被测量并与表达⑶94/NKG2C和/或其它⑶94/NKG2变体的细胞的结合相比较。本发 明的抗-NKG2A抗体可任选地结合NKG2B，其为与⑶94 一起形成抑制性受体的NKG2A剪接变 体。在本发明的一个方面，试剂与抗体Z199竞争与人CD94/NKG2A受体的细胞外部分 的结合。这可例如在BiaCore实验中测量，其中试剂结合用Z199饱和的固定的⑶94/NKG2A 受体的细胞外部分(例如，从表达CD94/NKG2的细胞纯化，或在生物系统中生产)的能力被 测量。可选地，试剂与细胞的结合被测量，所述细胞天然表达或过表达(例如，瞬时或稳定 转染之后)⑶94/NKG2A受体，并且其已被与饱和剂量的Z199预孵育。在本发明的一个方面，试剂与Z199抗体结合相同或基本上相同的表位。在本发明的一个方面，试剂包含来源于Z199VH和VL结构域的⑶R序列。在本发 明的另一方面，试剂包含在Z199CDR序列中的氨基酸取代，缺失，或插入。在本发明的另一 方面，试剂包含在天然鼠CDR序列中的回复突变，例如在Z199CDR中的有限数量的取代，例 如1，2，3，4，5，或6个回复突变。在本发明的一个方面，试剂包含Z199可变重(Vh)结构域(SEQ IDNO 4)的氨基酸 残基 31-35，50-60，62，64，66，和 99-108，和 Z199 可变轻(Vl)结构域(SEQ ID NO 2)的氨 基酸残基24-33，49-55，和88-96，任选具有1，2，3，4，或更多个氨基酸取代。在本发明的一个方面，试剂是完全人的或人化的抗体，包含在轻链的Kabat位点 46的脯氨酸。在本发明的一个方面，试剂包括选自重组种系序列和相关体细胞高度突变的人框 架区。在本发明的一个方面，抗体包含人VH3_21和VKIII_L6支架序列，具有JH3和JK2 作为种系J-区段，但原则上许多其它模板可使用，例如VH3_21，VH3_23, VH3_11, VH3_07, VH3_48，VH3_30_3，VH3_64，VH3_30_5 (重链)禾口 VKIII_L6，VKI_L23，VKIII_A11，VKIII_A27，VKIII_L20, VKVI_A14, VKI_L23, VKI_L8, VKI_L15 (轻链)。在本发明的一个方面，试剂是完全人的抗体，其已针对抗体Z199结合的CD94/ NKG2A表位来产生，或针对特异性结合Z199独特型的抗-独特型抗体来产生。在本发明的一个方面，试剂包含人框架序列，位点46的脯氨酸残基，和下列互补 决定区(CDR) :a)包含 SEQ ID NO 8 的 CDR-H 1 ；b)包含 SEQ ID NO 9 的 CDR-H2 ；c)包含 SEQ ID NO 10 的 CDR-H3 ；d)包含 SEQ ID NO 5 的 CDR-Ll ；e)包含 SEQ ID NO 6 的 CDR-L2 ； 和 f)包含 SEQ ID NO 7 的 CDR-L3。在本发明的一个方面，试剂是至少部分纯化的形式。在本发明的一个方面，试剂是基本上分离的形式。本发明提供了，例如，humZ199变体，其中VH CDR的至少一部分，例如⑶R-H2与人 VH接纳体序列的相应部分是同一的，由此降低了人化抗体的免疫原性。例如，如图4所示， humZ199⑶R-H2中残基Y58到G65同一于VH3_21序列。所述人化变体还在增强表达⑶94/ NKG2A的细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性中与Z199的鼠或嵌合形式类似地有效。在其他方 面，本发明提供了具有包含对应于鼠抗体Z199中的那些的某些抗原结合残基的⑶R，和人 框架序列的抗体。例如，如实施例4所示，Z199VL CDR中的Kabat残基Y32，L50，和P95以 及Kabat残基Y56，Y98，和Υ99显著有助于抗原识别。在一个实施方式中，根据本发明的抗 体由此包含这些残基的至少一些，优选全部。人化抗-NKG2A抗体人化非人抗体的方法在本领域中已经进行了描述。一般地，在人化方法中，编码鼠 抗体的相互作用区域的核苷酸可克隆入编码人IgG的cDNA-载体中，这样使得产生了由含 有来自鼠CDR的氨基酸残基的人IgG骨架组成的嵌合抗体。所述抗体可显示出与原始鼠抗 体相比更低的亲和力，更低的稳定性，或其他不期望的特点，并且还可以是免疫原性的。因 此，嵌合Ab中的各个氨基酸可能需要最优化以获得用于治疗性应用于人中的高质量的功 能性mAb。典型地，人化抗体具有从非人来源引入的一个或更多个氨基酸残基。这些非人氨 基酸残基经常表示为“进口”残基，其典型地来自“进口”可变结构域。人化可以基本上按 照Winter及其合作者的方法通过用超变区序列替换人“接纳体”抗体的相应序列而实施 (Jones 等人，Nature, 321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等人，Nature, 332 :323_327 (1988)； Verhoeyen等人，Science, 239 1534-1536 (1988))。相应地，所述“人化”抗体是嵌合抗体 (美国专利No. 4，816，567)，其中大大小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应 序列取代。实践中，人化抗体典型地是人抗体，其中一些超变区残基和可能地一些FR残基 被来自啮齿动物抗体的类似位点的残基取代。产生人化抗体的另一方法描述于美国专利申请公开2003/0017534，其中人化抗体 和抗体制剂从转基因非人动物中生产。非人动物被遗传工程化以包含一种或更多种人化免 疫球蛋白基因座，其能够在转基因非人动物中进行基因重排和基因转化以产生多样化的人 化免疫球蛋白。用于产生人化抗体的人可变结构域的选择，轻链的和重链的，对于降低抗原性是 非常重要的。根据所谓的“最佳适合”方法，啮齿动物抗体可变结构域序列相对于已知的 人可变结构域序列库或人种系序列库进行筛选。最接近啮齿动物的人序列可然后接受为用于人化抗体的人框架区(Sims 等人，J. Immunol. 1993 ;151 :2296et seq. ；Chothia 等 人，Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987 ； 196 :901_917)。另一方法使用源于特定亚组的 轻或重链的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人化抗 体(Carter 等人，PNAS USA, 1992 ；89 :4285et seq. ；Presta 等人，J Immunol 1993 ；151 2623et seq.)。设计为降低抗体分子在人患者中的免疫原性的其他方法包括镶饰抗体 (veneered antibodies)(见例如，美国专利6，797，492和美国专利申请公开20020034765 和20040253645)和已通过T-细胞表位分析和移除而修饰的抗体(见例如，美国专利申请 公开 20030153043 和美国专利 No. 5，712，120)。抗体人化为具有保持对于抗原的高亲和性和其他优良生物学性质也是重要的。为 达到这个目标，根据优选的方法，通过利用亲本和人化序列的三维模型分析亲本序列和多 种概念上的(conceptual)人化产品的方法，制备了人化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是 可获得的，并且对于本领域技术人员是熟悉的。阐明和显示选择的候选免疫球蛋白序列的 可能的三维构型结构的计算机程序是可获得的。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球 蛋白序列的功能中的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。 以此方式，FR残基可从接纳体和进口序列中被选择并组合，以使获得期望的抗体特性，例如 对靶抗原的提高的亲和性。通常，超变区残基直接和最实质性地涉及对抗原结合的影响。在实施例1和附图1，2和3中显示了 Z199是非竞争性⑶94/NKG2A拮抗剂的令人 惊讶的发现。HP-3D9 (抗-CD94)(图 1A)，Z199 (抗-NKG2A)(图 1B)和 Z270 (抗-NKG2A)都 有效地诱导表达HLA-E的靶细胞被⑶94/NKG2A-限制的淋巴细胞的杀伤。然而，虽然HP-3D9 和Z270防止了⑶94/NKG2A和HLA-E之间的相互作用，Z199不防止这种相互作用。另外， humZ199，在剂量范围100pg/ml到1 μ g/ml内测试，能够结合与饱和剂量的HLA-E四聚物预 孵育的表达⑶94/NKG2A的细胞。Z199和humZ199因此是非竞争性⑶94/NKG2A拮抗剂。尽管不受限于理论，可能 Z199通过例如，防止或诱导⑶94/NKG2A受体的构象变化，和/或影响⑶94/NKG2A受体的二 聚化和/或群集，来干扰⑶94/NKG2A信号传导。在一个方面，根据本发明的试剂是非竞争性拮抗剂。在进一步的方面，根据本发明 的试剂是非竞争性的拮抗剂，其具有对于CD94/NKG2A受体的内化的速率或量的不同作用， 因此使得更多或更少抗原可被另外的治疗试剂和/或HLA-E结合。防止⑶94/NKG2A受体 和HLA-E之间相互作用的试剂导致HLA-E与其它CD94/NKG2受体(例如，CD94/NKG2C)结 合的提高，所述活化可引起由这些受体引发的不希望的生物学应答(例如，导致不希望的 促炎性应答)。在一个方面，根据本发明的试剂阻断CD94/NKG2A受体而不提高HLA-E结合 和引发其它CD94/NKG2受体的潜能，使得由其它CD94/NKG2受体引起的不希望的副作用更 少可能。实施例2描述了示例性人化抗-NKG2A抗体的设计，并且实施例3描述了 humZ199 和回复突变变体的Biacore分析。初始地，发现人化Z199抗体不能结合抗原。因此，将回复 突变引入humZ199轻链和重链。令人感兴趣地，轻链中的回复突变L46P恢复了抗体识别和 结合抗原的能力(图5)。这种突变体的亲合力测定为72pM，其与嵌合Z199(24pM)为同一 数量级(表1)。轻链中的其它回复突变与L46P组合时不显著增强抗体的亲合力(图6)。实施例4显示了通过丙氨酸扫描鉴定在Z199可变序列中的关键残基。如与嵌合
13Z199比较，所有测试的ala-突变体显示了在测定中使用的两种mAb浓度下类似的结合概 况(2. 5nM和5nM)，除了其中在嵌合Z199轻链中的Kabat残基Υ32，L50或Ρ95被丙氨酸取 代，或其中在重链中的Kabat残基Υ56，Υ98或Ρ99被丙氨酸取代的Ζ199变体。Ζ199轻链 丙氨酸突变体Υ32Α，L50A，和Ρ95Α显示了大约40%的抗原结合能力。轻链突变体Υ49Α的 相对结合是在60-80% (图9)。因此，Ζ199轻链中的Kabat残基Υ32，L50，和Ρ95显著地 有助于识别抗原，而轻链中的Kabat残基Υ49中度地影响抗原结合。相应地，本发明提供了 humZ199变体，其保持VL结构域的Kabat残基Y32，L50或P95。关于氨基酸残基编号，应该注意鼠Z 199轻链的可变结构域比humZ199短一个残 基，缺少humZ199轻链序列中对应于Kabat残基S31的残基(图4和7)。因此，如例如， humZ199轻链序列中的Y32，L46，L50和P95的根据Kabat编号的残基对应于鼠Z199轻链序 列中的Kabat残基Y31，P45，L49和P94。然而，图4和7中所示的Kabat编号用作本文提 到的所有Z199(鼠或人化的，天然或突变的，重或轻链)可变区残基的Kabat编号的标准， 除非另外说明。Z199重链丙氨酸突变体Y56A，Y98A，和P99A保留大约40%的抗原结合能力，然而 重链突变体Y58A和D97A的相对结合为60-80% (图8)。因此，Z199重链中的Kabat残基 Y56，Y98，和P99显著有助于抗原识别。同时，重链中的Kabat残基Y58和D97中度地影响
抗原结合。基于Z199的治疗化合物，例如humZ199，因此优选地包括如Z199轻链中存在的 CDRl中的Kabat残基Y32，CDR2中的L50和CDR3中的P95，和Z199重链中存在的位点的 CDR2中的Kabat残基Y56和CDR3中的Y98和P99两者。在一个方面，本发明提供了 Z199杂交瘤生产的抗-NKG2A抗体的人化形式，以及与 Z199共享生物学特性和/或基本的序列同一性的非人抗体的人化形式。在另一实施方式 中，单克隆抗体或其片段或衍生物能够结合非人灵长类动物NKG2A。本文的人化抗体包含并入人VH和VL结构域的非人超变区或⑶R残基。在一个方面，本发明提供了包含在人接纳体框架中的来自鼠抗体Z199的CDR的抗 原结合残基的人化抗体，其中CDR-H2的至少6个C末端氨基酸残基与人接纳体序列相同。 所述人化抗体可比原始鼠Z199抗体或其嵌合形式在例如，增强表达CD94/NKG2A的细胞毒 性淋巴细胞，例如NK-细胞，NK T细胞，α/β T-细胞和/或γ/δ T-细胞，或表达⑶94/ NKG2A的细胞毒性淋巴细胞群体，的细胞毒性中更有效。如图4所示，humZ199VL和VH中的潜在回复突变以粗体提供，下划线的为人的。本 发明的优选实施方式由此需要下列使用Kabat编号的回复突变的humZ199轻和重链变体。humZ199VL :E1Q，L46P, L47W, I58V, D70S 和(E1Q，L46P, L47W, I58V, D70S)的任何组合。humZ 199VH:S49A，S77T，A93T，A60P，S62T，K64I^P (S49A, S77T, A93T, A60P, S62T, K64T)的任何组合。还优选的是包含上示回复突变的人化重和轻链的任何组合的抗体。在另一方面，本发明提供了包含VH结构域的人化抗体，所述VH结构域具有与Z199 或humZ199的VH结构域(参见例如图4中的序列)至少大约50%，至少大约70%，至少大 约80%的序列同一性(例如，至少大约85%、90%、95%、97%或更高的同一性)。在另一
14特定方面，本发明提供了结合NKG2A的人化抗体，包含VH结构域，所述VH结构域包含并入 人VH结构域的非人⑶R残基，其中所述VH结构域至少大约50% (例如至少90%)同一于 humZ 199VH。预期了几种形式的人化抗体。例如，人化抗体可以是抗体片段，例如Fab或本文描 述的其他类型的片段。或者，人化抗体可以是全长或完整的抗体，例如全长或完整的IgGl 或IgG4抗体。在一个实施方式中，人化抗体是全长IgG4抗体或其片段。在一个方面，本发明提供了人化抗体，其特征在于a)特异性结合NKG2A ；b)不特 异性结合Fc受体；和c)当结合人NK细胞上的NKG2A时，当所述靶细胞接触所述NK细胞时， 导致所述NK细胞溶解靶细胞表面上具有HLA-E的靶人细胞。在一个实施方式中，人化抗体 包含人IgGl恒定区(例如，IgGl，-2或_3)，其已被修饰以预防结合Fc受体，或人IgG4恒 定区。所述抗体，以及不结合Fc受体的抗体片段，在期望活化NK细胞的用途中是特别有用 的(例如，癌症，感染性疾病)，而不导致NK细胞自身的衰竭，如可能被抗体依赖细胞细胞毒 性介导的那样，并且可表示为“非衰竭”抗体。在另一方面，人化抗体包含结合Fc受体(例如，IgGl，-2或-3)的人IgGl恒定区， 或已被修饰以结合Fc受体或提高与Fc受体的结合的人IgGl，2，3或4恒定区，或人IgG4 恒定区。在另一实施方式中，单克隆抗体或其片段连接于对抗体结合的细胞为毒性的部分。 所述抗体在期望衰竭NK细胞的应用中是特别有用的，在某些应用例如NK-LDGL(粒状淋巴 细胞的NK-类型淋巴细胞增殖疾病，或称为NK-LGL)中是有用的，并且可称为“衰竭”抗体。为人化抗体的重组生产，人化VH和VL区，或其变体形式，可根据标准重组方 法克隆入编码来自人抗体的全长或截短恒定区的表达载体中(见例如，Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2ndEd. ,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, New York，1989)。结果是转染的细胞系，其表达和分泌感兴趣的人化抗体 分子，包含选择的VH和VL区和恒定区。编码人抗体的恒定区的cDNA序列是已知的。获自 例如，GenBank的示例性的cDNA序列如下所示，其每种全部通过援引并入本文人IgGl恒定重链区=GenBank登录号J00228 ；人IgG2恒定重链区=GenBank登录号J00230 ；人IgG3恒定重链区=GenBank登录号X04646 ；人IgG4恒定重链区=GenBank登录号K01316 ；禾口人kappa轻链恒定区=GenBank登录号J00241。如果期望，人化抗体的类型还可通过已知方法“转换”。例如，初始产生为IgM分子 的抗体可以是转换为IgG抗体的类型。类型转换技术也可用于将IgG亚类转化为另一种， 例如，从IgGl到IgG2。由此，可通过同种型转换为例如，用于多种治疗用途的IgGl, IgG2， IgG3，IgG4，IgD, IgA, IgE，或IgM抗体，改变本发明的抗体的效应物功能。恒定区还可根据已知方法修饰。例如，在IgG4恒定区中，残基S241可突变为脯氨 酸(P)残基以允许在铰链中完整二硫键形成(见例如，Angal等人，Mol Immunol. 1993 ；30 105-8)。抗体片段本发明的人化抗体可制备为抗体片段，或抗体片段可从人化全长抗体中制备。已经开发了用于生产人化抗体的抗体片段的多种技术。通常地，这些片段通过全长抗体的蛋白水解消化而获得(见例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，24 :107_117(1992)；和 Brennan 等人，Science，229 :81 (1985))。 然而，现在这些片段可被重组宿主细胞直接产生。或者，Fab' -SH片段可直接从大肠 杆菌中回收，并且化学偶联以形成F(ab' )2片段(Carter等人，Bio/Technology, 10 163-167(1992))。根据另一方法，F(ab' ) 2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。 用于产生抗体片段的另外技术对于熟练技术人员是明显的。在其他实施方式中，选择的 抗体是单链Fv片段(scFv)。见W01993/16185 ;U. S.专利号5，571，894 ；和U. S.专利号 5, 587,458.抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如U. S.专利号5，641，870中描述的那 样。所述线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。产生双特异性抗 体的方法是本领域中已知的，并且传统产生全长双特异性抗体通常是基于两种免疫球蛋 白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature, 305 537-539(1983))。在根据本发明的双特异性抗体中，至少一个结合表位位于NKG2A蛋白 上。抗-NKG2A结合“臂”可以与结合淋巴细胞上的引发分子的“臂”组合，所述淋巴细胞 上的引发分子例如T细胞受体分子(例如，CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(Fe y -R)，例如 Fc- y -RI (CD64)，Fc- y -RII (CD32)和 Fc- y -RIII (CD16)，以使得将细胞防御机能集中到 表达NKG2A的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒性剂定位于表达NKG2A的细胞。这些 抗体具有NKG2A-结合臂和结合细胞毒性剂(例如，皂草素，抗_干扰素-α，长春花生物碱， 蓖麻毒素A链，甲氨蝶呤，或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可制备为全长抗体 或抗体片段(例如，F(ab' )2双特异性抗体)。预期了具有超过两价的抗体。例如，可制 备三特异性抗体。Tutt 等人，J. Immunol, 147 60(1991)。抗体衍生物本发明范围内的抗体衍生物包括缀合或共价结合(例如，融合)第二试剂的人化 抗体。在本发明的一个方面，试剂缀合或融合于第二试剂。在进一步的方面，所述第二试剂选自突出(protracting)基团，例如PEG，细胞毒 性试剂，可检测标记，靶向试剂。例如，在一个方面，本发明提供了包含缀合或共价结合细胞毒性剂的人化抗体 的免疫缀合物。如本文使用的术语“细胞毒性剂”是能够杀伤在细胞表面具有NKG2A受 体的细胞的分子。具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何类型的部分可与本抗体缀合， 以形成本发明的细胞毒性缀合物，并且抑制或杀伤特异性NK受体表达细胞，包括治疗 性放射性同位素，毒性蛋白，毒性小分子，例如药物，毒素，免疫调节物，激素，激素拮抗 剂，酶，寡核苷酸，酶抑制剂，治疗性放射性核素，血管生成抑制剂，化疗药物，长春花生物 碱，蒽环类抗生素，表叶毒素，紫杉烷类(taxanes)，抗代谢物，烷化剂，抗生素，C0X-2抑 制剂，SN-38，抗有丝分裂剂，抗血管生成和细胞凋亡试剂，特别是阿霉素，甲氨蝶呤，紫 杉醇，CPT-11，喜树碱类(camptothecans)，氮芥，吉西他滨，烷基磺酸盐，亚硝基脲，三氮 烯，叶酸类似物，嘧啶类似物，嘌呤类似物，钼配位络合物，假单胞菌外毒素，蓖麻毒素，相 思豆毒素，5-氟尿苷(5-fluorouridine)，核糖核酸酶(RNase)，DNase I，葡萄球菌肠毒 素-A，美洲商陆抗病毒蛋白，白树毒素，白喉毒素，假单胞菌外毒素，和假单胞菌内毒素
16禾口其他(见例如，Remington, sPharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co.1995) ；Goodmanand Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill，2001) ;Pastan 等人(1986)Cell 47 641 ；Goldenberg(1994)CancerJournal for Clinicians 44 43 ；U. S.专利号.6，077，499 ；其全文通过援引并入本文)。将理解毒素可 以是动物，植物，真菌或微生物来源，或可通过化学合成重新产生。在另一实施方式中，用放射活性同位素衍生化抗体，例如治疗性放射性核素或适 于检测目的的放射性核素。可使用任何大量的适合的放射活性同位素，包括但不限于， 1-131，铟-111，镥-171，铋-212，铋-213，砹-211，铜-62，铜-64，铜-67，钇-90，碘-125， 碘-131，磷-32，磷-33，钪-47，银-111，镓-67，镨-142，钐-153，铽-161，镝-166，钬-166， 铼-186，铼-188，铼-189，铅-212，镭-223，锕-225，铁-59，硒-75，砷-77，锶-89，钼-99， 铑-105，钯-109，镨-143，钷-149，铒-169，铱-194，金-198，金-199，和铅-211。通常，放 射性核素优选具有对于Auger发射器20到6，OOOkeV范围的衰变能，优选在60到200keV范 围，对于β发射器100_2500keV，对于α发射器4，000-6，OOOkeV。还优选的是产生α-粒 子地充分衰变的放射性核素。在其他实施方式中，第二试剂是可检测部分，其可以是可定量或定性观察或测量 的任何分子。在本发明的缀合抗体中有用的可检测标记的例子是放射性同位素，荧光染料， 或互补结合对的成员，例如下列的任何一种的成员抗原/抗体(NKG2A抗体之外)，凝集素 /碳水化合物；抗生物素蛋白/生物素；受体/配体；或分子印记聚合物/印记分子系统。例如，第二试剂还可或替代地为聚合物，目的为提高人化抗体的循环半衰期。 将所述聚合物附着于肽的示例性聚合物和方法例示于例如，U.S.专利号4，766，106; 4，179，337 ；4, 495，285 ；和4，609，546。另外的例示性聚合物包括聚氧乙烯化多元醇和聚乙 二醇(PEG)部分(例如，全长抗体或抗体片段可缀合于一个或更多个PEG分子，所述PEG分 子具有大约1，000到大约40，000的分子量，例如在大约2000到大约20000之间，例如，大 约 3000-12000)。利用大量可获得方法中的任一种，可将细胞毒性剂或其他化合物直接或间接连接 于抗体。例如，通过利用交联剂例如N-琥珀酰基3-(2_吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)形 成二硫键，或通过在抗体Fc区的碳水化合物部分，可将试剂附着在还原抗体成分的铰链区 (见例如，Yu 等人(1994) Int. J. Cancer 56:244 ；Wong, Chemistry of ProteinConjugation and Cross-linking(CRC Press 1991) ；Upeslacis 等人，"Modification of Antibodies by Chemical Methods, " in Monoclonalantibodies !principles and applications, Birch 等人(eds. ), pages 187-230 (ffiley-Liss, Inc. 1995) ；Price, " Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies, " in Monoclonal antibodies :Production, engineering and clinical application, Ritter ^A (eds.), pages60~84 (Cambridge University Press 1995), Cattel ^A (1989) Chemistrytoday 7 51-58，Delprino 等人(1993) J. Pharm. Sci 82 :699_704 ；Arpicco 等人(1997) Bioconjugate Chermistry 8 3 ；Reisfeld 等)κ (1989)Antibody, Immuncon. Radiopharm. 2 217 ；*禾中白勺 全文通过援引并入本文)。或者，例如，通过重组技术或肽合成，可制备包含抗-NKG2A抗体和第二(细胞毒性 或其他)多肽试剂的融合蛋白。
17
结合测定本发明提供了结合人NKG2A的抗体，特别是Z199杂交瘤产生的抗-NKG2A抗体的 人化形式。多种测定中的任何一种可用于评价抗体与人NKG2A的结合。基于ELISAs，放射免 疫测定，Western印迹，BIAC0RE，和其他竞争测定等的方案适于应用，并且是本领域中熟知 的。例如，可利用简单的结合测定，其中测试抗体在靶蛋白或表位(例如，CD94/NKG2A 或其部分)存在下孵育，洗脱未结合的抗体，并且利用例如，放射标记，物理方法例如质谱 法，或利用例如细胞荧光测定分析(例如FACScan)检测的直接或间接荧光标记，而评价结 合抗体的存在。所述方法是本领域技术人员熟知的。超过利用对照，非特异性抗体观察到 的量的结合量显示抗体特异性结合于靶标。在所述测定中，测试抗体结合靶细胞或人NKG2A的能力可与(阴性)对照蛋白结 合相同靶标的能力进行比较，所述对照蛋白例如，针对结构不相关抗原产生的抗体，或非Ig 肽或蛋白。利用任何适当的测定以25 %、50 %、100 %、200 %、1000 %或更高的相对于对照蛋 白的提高的亲和性结合靶细胞或NKG2A的抗体或片段被称为“特异性结合”或“特异性作用 于”靶标，并且优选用于下述治疗方法中。测试抗体影响抗NKG2A的(阳性)对照抗体，例 如鼠或人化Z199，或其衍生物，的结合的能力也可被评价。人化抗-NKG2A抗体可以结合或不结合人NKG2C，可以结合或不结合人NKG2E，或可 以结合或不结合人NKG2C和E中的任一。在一个特别的实施方式中，单克隆抗体或片段结 合其他人CD94/NKG2受体，特别是活化受体CD94/NKG2C和/或CD94/NKG2E，亲合力比结合 ⑶94/NKG2A显著更低。本发明抗体的NKG2C-和NKG2E-结合性质可以与上述测定类似的测 定进行评价，所述类似的测定简单地将NKG2A换成感兴趣的分子。在一个方面，本发明提供了与Z199共享生物特性和/或基本的序列同一性的非 人抗体的人化形式。一种示例性的生物特性是与Z199表位，即Z199抗体结合的NKG2A 的细胞外结构域，的结合。为筛选结合Z199表位的抗体，可实施常规的交叉阻断测定，例 如 Antibodies, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and DavidLane (1988)中描述的那些。在一种示例性的交叉阻断或竞争测定中，Z199(对照)抗体和测试抗体被混合(或 预吸附)并且应用于包含NKG2A的样品。在某种实施方式中，在应用到包含NKG2A样品之 前，预混合对照抗体与不同量的测试抗体(例如，1 10或1 100) —段时间。在其他实 施方式中，对照和不同量的测试抗体可在暴露于抗原/靶标样品过程中简单地混合。只要 可以辨别结合与游离抗体(例如，通过利用分离或清洗技术以清除未结合抗体)和辨别对 照抗体与测试抗体(例如，通过利用物种_或同种型_特异性第二抗体，通过用可检测标记 特异性标记对照抗体，或通过利用物理方法例如质谱法以辨别不同化合物)，可以确定测试 抗体是否降低了对照抗体与抗原的结合，显示出测试抗体与对照识别基本上相同的表位。 在此测定中，在完全不相关抗体的存在下的(标记)对照抗体的结合是对照高值。通过用 未标记对照抗体孵育标记(阳性)对照抗体(Z199)获得对照低值，其中将发生竞争并且降 低标记抗体的结合。在一种测试测定中，在测试抗体存在下标记抗体反应性的显著降低指示了识别相
18同表位的测试抗体，即，与标记对照抗体“交叉反应”的抗体。以对照测试抗体或化合物在 大约1 10到大约1 100之间的任何比例降低至少50%或更优选70%的标记对照与抗 原/靶标的结合的任何测试抗体或化合物被认为是与对照结合基本上相同的表位或决定 簇的抗体或化合物。优选，所述测试抗体或化合物将降低至少90%的对照与抗原/靶标的 结合。然而，降低任何可测量程度的对照抗体或化合物的结合的任何化合物或抗体可用于 本发明。类似的交叉阻断测定也可用于评价测试(人化)抗体是否通过将Z 199替换为 HLA-E的适当形式而影响人CD94/NKG2A的天然配体，HLA-E，与CD94/NKG2A的结合。例如， 为确定人化抗-NKG2A抗体制剂是否降低或阻断CD94/NKG2A与HLA-E的相互作用，可实施 下述测试表达CD94/NKG2A的细胞系，例如Ba/F3_CD94/NKG2A，NKL或NK92，在具有逐渐增 加浓度的测试抗-NKG2A抗体的情况下在冰上孵育30分钟。细胞然后与PE-标记的HLA-E 四聚物在冰上孵育30分钟，再次清洗，并且通过标准方法在流式细胞仪上(FACScalibur， Beckton Dickinson)分析HLA-E四聚物结合。在不存在测试抗体时，HLA-E四聚物结合细 胞。在阻断CD94/NKG2A与HLA-E的结合的抗体制剂存在时，HLA-E四聚物与细胞的结合降 低，并且所述mAbs被指定为“阻断抗体”。本发明提供了降低人CD94/NKG2A受体的抑制活 性而不阻断HLA-E的抗体。相应地，所述阻断的缺乏可在这些测定中类似地检测。在本发明的一些方面，例如，当不期望杀伤NKG2A-表达细胞时，本发明的人化抗 体优选不显示出与Fc受体的基本上特异性的结合。所述抗体可包含已知不结合Fc受体的 多种重链的恒定区。一种所述例子是IgG4恒定区。IgG4或者，不包含恒定区的抗体片段， 例如，Fab或F(ab’)2片段，可用于避免Fc受体结合。可根据本领域已知方法评价Fc受体 结合，包括例如在BIAC0RE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。任何其他抗体类型也可 使用，其中Fc部分被修饰以最小化或消除与Fc受体的结合(见例如，W003101485，其公开 内容通过援引并入本文)。评价Fc受体结合的测定，例如基于细胞的测定，是本领域已知 的，并且描述于例如，W003101485。功能测定如果抗-NKG2A抗体降低或阻断⑶94/NKG2A与HLA-E的相互作用，它可提高⑶94/ NKG2A-限制淋巴细胞的细胞毒性。这可通过典型的细胞毒性测定而评价，其例子在下面进 行描述。可利用例如，表达⑶94/NKG2A的NKL细胞和表达HLA-E的靶细胞，以标准的4小时 体外细胞毒性测定，测试抗体降低CD94/NKG2A-介导的信号传导的能力。所述NKL细胞不 有效地杀伤表达HLA-E的靶标，因为⑶94/NKG2A识别HLA-E，导致防止淋巴细胞-介导的细 胞溶解的抑制性信号传导的起始和传播。如例如Coligan等人，eds.，Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and WiIeyInterscience, N. Y. , (1992,1993) 所述，可通过本领域熟知的标准方法实施所述体外细胞毒性测定。在添加NKL细胞之前用 51Cr标记靶细胞，然后杀伤被评估为从细胞到培养基的51Cr释放的比例，作为杀伤的结果。 添加防止⑶94/NKG2A结合HLA-E的抗体导致了预防通过⑶94/NKG2A的抑制性信号传导的 起始和传播。因此，添加所述试剂导致了靶细胞的淋巴细胞-介导的杀伤的提高。由此这 一步骤鉴定了，通过例如阻断配体结合，防止⑶94/NKG2A-诱导的阴性信号传导的试剂。在 一个特别的51Cr-释放细胞毒性测定中，表达⑶94/NKG2A的NKL效应细胞可杀伤HLA-E阴性LCL 721. 221靶细胞，但杀伤更少的良好的表达HLA-E的LCL 721. 221_Cw3对照细胞。与 之对照，缺少CD94/NKG2A的YTS效应细胞有效的杀伤两种细胞系。因此，NKL效应细胞更 不有效地杀伤HLA-E+LCL 721. 221_Cw3细胞，由于通过CD94/NKG2A的HLA-E-诱导的抑制 性信号传导。当NKL细胞与根据本发明的阻断抗-CD94/NKG2A抗体在所述51Cr-释放细胞 毒性测定中预孵育时，表达HLA-E的LCL 721. 221-Cw3细胞以抗体浓度依赖模式被更有效 地杀伤。本发明的抗体的抑制性活性(即，细胞毒性增强潜能)也可以任一多种其他方式 进行评价，例如，通过其对于细胞内游离钙的作用，如例如Sivori等人，J. Exp. Med. 1997 ； 186 1129-1136中所述，其通过援引并入本文。如Sivori等人，J. Exp. Med. 1997 ； 186 1129-1136 ；Vitale 等人，J. Exp. Med. 1998 ；187 :2065_2072 ；Pessino 等人 J.Exp· Med. 1998 ； 188 :953_960 ；Neri 等人 Clin. Diag. Lab. Immun. 2001 ；8 :1131_1135 ；Pende 等人 J. Exp. Med. 1999 ； 190 1505-1516中所公开的，每种的全文通过援引并入本文，也可利用基 于细胞的细胞毒性测定，例如，为评价抗体刺激NK细胞以杀伤靶细胞例如P815，K562细胞 或适当的肿瘤细胞的能力的测量铬释放或其他参数，评价NK，T，或NKT细胞活性。在一个实施方式中，抗体制剂导致⑶94/NKG2A-限制淋巴细胞的细胞毒性的至少 10 %的增加，优选NK细胞毒性至少40 %或50 %增加，或更优选NK细胞毒性至少70 %增加。细胞毒性淋巴细胞的活性也可利用细胞因子释放测定而评价，其中NK细胞用抗 体孵育，以刺激NK细胞的细胞因子产生(例如IFN-y和TNF- α产生)。在一个示例性方案 中，通过培养4天之后用流式细胞术的细胞表面和细胞质内染色和分析，评价IFN-y从PBMC 的产生。简短地，布雷菲德菌素(Brefeldin) A ((Sigma Aldrich))以5 μ g/ml的终浓度在 培养的最后4小时添加。然后在透化(IntraPi^p ；Beckman Coulter)和用PE-抗_IFN_y 或PE-IgGl (Pharmingen)染色之前用抗-⑶3和抗-⑶56mAb孵育细胞。利用ELISA在上 清液中测量从多克隆活化NK细胞的GM-CSF和IFN-y的产生(GM-CSF =DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN- OptElA set, Pharmingen)。在一个特别方面，本发明提供了抗体，所述抗体比原始的，非人化抗体和/或其 嵌合形式更能够，或更有效于，提高CD94/NKG2A-限制淋巴细胞的细胞毒性，增强CD94/ NKG2A-限制淋巴细胞的细胞毒性活性，或降低或抑制CD94/NKG2A-介导的信号传导。所 述抗体可，例如，比原始的，非人化抗体或其嵌合形式至少2 %，至少5 %，至少10 %，至少 15%，或至少20%更有能力或更有效。抗体生产本发明也提供了编码本文所述抗-NKG2A抗体的分离的核酸，以及包含所述核酸 的载体和宿主细胞。在一个方面，提供了编码根据本发明试剂的核酸片段。在一个方面，提供了编码根据本发明的试剂的核酸片段，其选自DNA和RNA片段。还提供了利用重组技术生产所述抗-NKG2A抗体的方法，所述重组技术例如，培养 包含所述核酸或载体的适当的宿主细胞，使得核酸被表达并且人化抗体被产生。培养之前， 宿主细胞可，例如，用包含编码可变重结构域的核酸的载体和包含编码可变轻结构域的核 酸的载体共转染。另外，抗体可利用已知技术从宿主细胞培养物中回收和/或纯化。有用 的载体，宿主细胞，和技术在下面进一步描述。
20
通常，为重组生产抗体，编码它的核酸被分离和插入可复制的载体，以进一步克隆 (DNA的扩增)或表达，典型地可操纵地连接于一种或多种表达控制元件。利用常规程序(例 如，通过利用能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因的寡核苷酸探针)，编码单克隆抗 体的DNA被容易地分离和测序。许多载体是已知的和可获得的。载体成分通常包括但不限 于下述的一种或多种信号序列，复制起点，一种或多种标记基因，增强子元件，启动子，和 转录-终止序列。信号序列成分本发明的抗-NKG2A抗体不仅可直接重组生产，而且可作为具有异源多肽的融合 多肽重组生产，所述异源多肽优选是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异剪 切位点的其他多肽。优选的异源信号序列是宿主细胞识别和加工的序列(即，通过信号肽 酶切除)。对于不识别和加工天然抗-NKG2A抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被原 核信号序列代替，所述原核信号序列选自，例如，碱性磷酸酯酶，青霉素酶，Ipp,或热稳定肠 毒素II前导序列。对于酵母分泌，天然信号序列可被例如酵母转化酶前导序列，α因子前 导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α因子前导序列)，酸性磷酸酯酶前导序列，白色念珠 菌(C. albicans)葡糖淀粉酶前导序列，或WO 1990/13646描述的信号所代替。在哺乳动物 细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如，单纯疱疹gD信号，是可利用 的。所述前导区的DNA在阅读框内与编码抗-NKG2A抗体的DNA连接。复制起点成分表达和克隆载体都包含了使得载体能够在一种或更多种选择的宿主细胞中复制 的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是使得载体能够独立于宿主染色体DNA复制的 序列，并且包括了复制起点或自主复制序列。所述序列对于多种细菌，酵母和病毒是熟知 的。来自质粒PBR322的复制起点对于大多数革兰氏阴性细菌是适合的，2 μ质粒起点对于 酵母是适合的，并且多种病毒起点(SV40，多瘤，腺病毒，VSV, EBV，或BPV)对于在哺乳动物 细胞中的克隆载体是有用的。通常，复制起点成分对于哺乳动物表达载体是不需要的(SV40 起点可典型地使用，仅仅因为它包含了早期启动子)。选择基因成分表达和克隆载体可包含选择基因，也称为可选择标记。典型的选择基因编码蛋白， 所述蛋白(a)赋予对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨比西林，新霉素，甲氨蝶呤，或四环 素，(b)补充营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中不可获得的关键营养，例如，编码对于杆 菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个例子利用了抑制宿主细胞生长的药物。用外源基因成功转化的这 些细胞产生了赋予药物抗性的蛋白，并因此在选择体系中存活。所述显性选择的例子利用 药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。对于哺乳动物细胞适当的可选择标记的另一例子是使得能够鉴定能够吸收编码 抗-NKG2A抗体的核酸的细胞的那些标记，例如，DHFR，胸苷激酶，金属硫因-I和II，优选灵 长类金属硫因基因，腺苷(aderosine)脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过在包含甲氨蝶呤(Mtx)，一种DHFR的竞争性拮抗剂，的培养基中培养所有转化体而鉴定。当应用野生型DHFR时，一种适当的宿 主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。或者，通过在包含用于可选择标记的选择试剂的培养基中生长细胞可选择用编码 抗-NKG2A抗体，野生型DHFR蛋白，和另一可选择标记例如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH) 的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)，所述选择试 剂例如氨基糖苷抗生素，如卡那霉素，新霉素，或G418。见美国专利号4，965，199。用于酵母的适当的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp 1基因(Stinchcomb 等人，Nature，282 :39 (1979))。trp 1基因提供了用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母 突变株例如，ATCC No. 44076 或 PEP4-1. Jones，Genetics，85 12 (1977)，的选择标记。酵母 宿主细胞基因组中trpl损害的存在然后提供了通过在不存在色氨酸时生长而检测转化的 有效环境。类似地，Leu2-缺陷酵母株(ATCC 20, 622或38，626)被含有Leu2基因的已知 质粒补充。另外，源于1.6-μπι环形质粒pKDl的载体可用于转化克鲁维酵母属酵母。或 者，报道了用于K. Iactis的大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统(Van den Berg, Bio/ Technology, 8 :135 (1990)。也公开了用于通过克鲁维酵母属的工业菌株分泌成熟的重组人 血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等人，Bio/Technolog, 9 :968_975 (1991)。启动子成分表达和克隆载体通常包含被宿主生物体识别并且可操纵地连接于编码抗-NKG2A 抗体的核酸的启动子。适于与原核宿主应用的启动子包括PhoA启动子，β -内酰胺酶和乳 糖启动子系统，碱性磷酸酯酶，色氨酸(trp)启动子系统，和杂合启动子，例如tac启动子。 然而，其他已知的细菌启动子是适合的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗-NKG2A 抗体的DNA可操纵连接的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。已知多种用于真核细胞的启动子序列。实际上所有的真核基因具有位于转录起始 位点上游大约25到30个碱基的位置的富含AT区。在许多基因转录起始上游70到80个 碱基位置发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的 3'末端是AATAAA序列，其可能是用于向编码序列的3'末端添加聚-A尾的信号。所有这 些序列适于插入真核表达载体。与酵母宿主一起使用的适当的启动序列的例子包括3-磷 酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶启动子，所述其他糖酵解酶例如，烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱 氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位 酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，和葡萄糖激酶。其他酵母启动子，其为具有被生长条件控制转录的附加优点的可诱导启动子，是 醇脱氢酶2，异细胞色素CGsocytochrome C)，酸性磷酸酯酶，与氮代谢相关的降解酶，金属 硫因，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表 达的适合的载体和启动子进一步描述于EP73657。酵母增强子也与酵母启动子一起有利地 利用。从哺乳动物宿主细胞的载体的抗-NKG2A抗体转录被，例如，获自病毒基因组的启 动子控制，所述病毒例如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，禽肉 瘤病毒，巨细胞病毒(CMV)，逆转录病毒，乙型肝炎病毒，并且最优选猿猴病毒40(SV40)，异 源哺乳动物启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，和热休克启动子，只要所述启动子与宿主细胞系统兼容即可。SV40病毒的早期和晚期启动子便利地获得为SV40限制片段，其也包含SV40病 毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子便利地获得为HindIII E限制片段。利用 牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利号4，419，446 中。这种系统的修饰描述于美国专利号4，601，978中。还可见Reyes等人，Nature，297 598-601(1982)关于人β -干扰素cDNA在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小 鼠细胞中的表达。或者，劳氏肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。增强子元件成分高等真核细胞的编码本发明的抗-NKG2A抗体的DNA的转录通常通过插入增强子 序列到载体中而增加。现在已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白， α-胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，典型地，将利用来自真核细胞病毒的增强子。 实例包括在复制起点晚侧(late side)的SV40增强子(100_270bp)，巨细胞病毒早期启动 子增强子，复制起点晚侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒启动子。还可见Yaniv，Nature，297 17-18(1982)关于用于活化真核启动子的增强元件。增强子可剪接入载体中编码抗-NKG2A 抗体序列的5'或3'位点，但优选位于启动子的5'位点。转录终Ih成分
用于真核宿主细胞(例如，酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人，或来自其他多细胞生 物的有核细胞)的表达载体将也包含终止转录和稳定mRNA必需的序列。所述序列通常可 获自真核或病毒DNAs或cDNAs的未翻译区域的5'末端，有时获自3'末端。这些区域包 含转录为在编码抗-NKG2A抗体的mRNA的未翻译部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。 一种有用的转录终止成分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。见WO 1994/11026和其中公开的 表达载体。宿主细胞的选择和转化本文中用于在载体中克隆或表达DNA的适当的宿主细胞是原核生物，酵母，或 上述高等真核细胞。为这一目的的适当的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰 氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)， 如大肠埃希氏菌(E. coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏 菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，如，鼠伤寒沙门 氏菌(Salmonella typhimurium),沙雷氏菌属(Serratia),如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌 (B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)(如，公开于1989年4月12日出版 的DD 266，710中的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa)，和链霉菌属(Str印tomyces)。优选的大肠埃希氏菌克隆宿主是大肠埃希 氏菌294 (ATCC 31，446)，然而其他的菌株例如大肠埃希氏菌B，大肠埃希氏菌X1776 (ATCC 31，537)，和大肠埃希氏菌13110仏10 27，325)是适合的。这些实例是例示性的而不是限 制性的。除了原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于编码抗-NKG2A抗 体的载体的适当的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或普通 面包酵母，是在低级真核宿主微生物中最通常使用的。然而，大量的其他属，种，和株通常是可获得并且在本文中是有用的，例如，裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)； 克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主例如，乳酸克鲁维酵母(K. Iactis)，脆壁克鲁维 酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)，K. bulgaricus(ATCC16, 045)，K. wickeramii(ATCC 24，178)，K. waltii (ATCC 56，500)，K. drosophilarum(ATCC 36，906)，K. thermotolerans 和马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德 毕赤酵母(EP 183, 070)；念珠菌属；里氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234)； 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺酵 母(Schwanniomyces occidentalis)；禾口丝状真菌(filamentousfungi)例如，脉抱 菌属(Neurospora),青霄属(Penicillium)，弯颈霄属(Tolypocladium)禾口 曲霄属 (Aspergillus)宿主例如，构巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。用于糖基化抗-NKG2A抗体表达的适合的宿主细胞源于多细胞生物。无脊椎 动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了来自宿主的多种杆状病毒株和变体 和相应的许可的昆虫宿主细胞，所述宿主例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (虫蜀(caterpillar)), R M (Aedes aegypti) ( (mosquito)), θ(Aedes albopictus)(岐(mosquito)),黑腹果妮(Drosophila melanogaster)(果妮(fruitf Iy)) 和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾核型 多角体病毒(Autographa californica NPV)的L-1变体和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV)的Bm_5株，并且所述病毒可用作根据本发明的此处的病毒，特别是用于草地贪 夜蛾细胞的转染。棉花，玉米，土豆，大豆，矮牵牛花，西红柿，和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。然而，对脊椎动物细胞具有最大的兴趣，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养 物)中的繁殖已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾 CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾(HEK)系(293或为在悬浮培养物中生长亚克隆的 293 细胞，Graham 等人，J. Gen Virol. ,36 59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCCCCL 10)； 中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR (CHO，Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216(1980), 包括 DG44(Urlaub 等人，Som. Celland Mol. Gen.，I2 ^55-566 (I986))和 DP I2 细胞系)；小 鼠 Sertoli 细胞(TM4，Mather，Biol. R印rod. ,23 243-251 (1980))；猴肾细胞(CVlATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)； 犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL 34) ；buffalo 大鼠肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺 细胞(Wl38，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562， ATCCCCL51) ；TRI 细胞(Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sci.，383 :44_68 (1982)) ；MRC 5 细 胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。宿主细胞用上述用于抗-NKG2A抗体生产的表达或克隆载体转化，并且在改良为 适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码期望序列的基因的普通营养培养基中培养。培养宿主细胞用于生产本发明的抗-NKG2A抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。商 业上可获得的培养基例如Ham ‘ s FlO (Sigma)，最小必需培养基((MEM)，(Sigma)， RPMI-1640(Sigma), FreeStyle (Cibco)和 Dulbecco ‘ s Modified Eagle ‘ s
24Medium((DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，例如，任何描述于Ham等人，Meth. Enz. 58 44 (1979) ；Barnes 等人，Anal. Biochem.，102 255 (1980)；美国专利号 4，767，704 ； 4, 657, 866 ；4,927, 762 ；4,560, 655 ；或 5，122，469 ;W0 1990/03430 ；W01987/00195 ；或 U. S. Pat. Re. 30,985中的培养基可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可根据需要 补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(例如氯化 钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲剂(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(例如 GENTAMYCIN. TM.药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合 物)，和葡萄糖或等价能量源。任何其他必需补充物也可以本领域技术人员已知的适当浓度 包括在内。培养条件，例如温度，PH等是选择用于表达的宿主细胞先前使用的那些，并且对 于本领域普通技术人员是明显的。抗体纯化当利用重组技术时，抗体可在细胞内或在周质空间中产生，或直接分泌到培养基 中。如果抗体细胞内产生，作为第一步骤，例如通过离心或超滤，除去微粒碎片，其为宿主细 胞或裂解片段。Carter等人，Bio/Technology，10 :163_167 (1992)描述了分离分泌到大肠 埃希氏菌的周质空间中的抗体的方法。简短地说，在大约30分钟期间在醋酸钠(pH3.5)， EDTA，和苯甲磺酰氟(PMSF)的存在下将细胞糊解冻。细胞碎片可通过离心除去。当抗体分 泌到培养基中时，来自所述表达系统的上清液通常利用商业上可获得的蛋白浓缩滤器而首 次浓缩，所述滤器例如，AMIC0N 或MILLIPORE PELLIC0N 超滤单元。蛋白酶抑制剂例如苯 甲磺酰氟(PMSF)可包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止外 来污染物的生长。可利用例如羟磷灰石色谱法，凝胶电泳，透析，和亲和层析，纯化从细胞中制备的 抗体组合物，亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适应性依赖于存在于抗 体中的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ 1，Y，或 Y 4重链的抗体(Lindmark等人，J. Immunol.Meth. ,62 1-13 (1983)) 对于所有小鼠同种 型和人y3，推荐蛋白G(Guss等人，EMBO J.，5 :15671575(1986))。亲和配体附着的基质最 经常是琼脂糖，但是其他的基质是可利用的。机械稳定的基质例如可控孔度玻璃或聚(苯 乙烯二乙烯)苯比利用琼脂糖允许更快的流率和更短的加工时间。当抗体包含CH3结构域 时，BAKERBOND ABX 树脂(J. T. Baker, Phillipsburg，N. J.)对于纯化是有用的。蛋白纯 化的其他技术例如在离子交换柱上分级分离，乙醇沉淀，逆相HPLC，在硅石上的色谱法，在 肝素SEPHAR0SE 上的色谱法，在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的色谱 法，层析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀，根据待回收的抗体也是可利用的。药物制剂在一个方面，提供了用作药物的根据本发明的试剂。在一个方面，提供了用作治疗恶性肿瘤，病毒感染，炎性病症和自身免疫疾病的药 物的根据本发明的试剂。在一个方面，提供了用作用于中和或降低在人患者细胞表面上表达的⑶94/NKG2A 受体的抑制活性的药物的本发明的试剂。在一个方面，提供了用作用于增强在人患者中⑶94/NKG2A表达细胞的细胞杀伤 活性的药物的本发明的试剂。
在一个方面，提供了用作在人患者中诱导Cw3表达靶细胞的杀伤的药物的本发明 的试剂。在进一步的方面，提供了包含根据本发明的试剂与药学上可接受的载体，稀释剂 或赋形剂的组合物。在一个实施方式中，本发明提供了包含本文所述的抗体和一种或更多种载体的药 物组合物。相应地，本发明的一个目标是提供包含以lmg/ml到500mg/ml的浓度存在的所述 抗体的药物制剂，其中所述制剂具有从2. 0到10. 0的PH。制剂可进一步包含缓冲体系，防 腐剂，张度剂，螯合剂，稳定剂和表面活性剂。在一个实施方式中，药物制剂是水制剂，即包 含水的制剂。所述制剂典型地是溶液或悬浮液。在一个进一步的实施方式中，药物制剂是 水溶液。术语“水制剂”定义为包含至少50% w/w的水的制剂。同样地，术语“水溶液”定 义为包含至少50% w/w的水的溶液，术语“水悬浮液”定义为包含至少50% w/w的水的悬 浮液。在另一实施方式中，药物制剂是冷冻干燥的制剂，内科医生或患者在使用前将溶 剂和/或稀释液加入到其中。在另一实施方式中，药物制剂是先前没有进行任何溶解的备用的干燥制剂(例 如，冷冻干燥或喷雾干燥)。在一个进一步的方面，药物制剂包含所述抗体和缓冲剂的水溶液，其中抗体以 lmg/ml或更高的浓度存在，并且其中所述制剂具有大约2. 0到大约10. 0的PH。在另一实施方式中，制剂的PH的范围选自大约2.0到大约10.0，大约3.0到大 约9. 0，大约4. 0到大约8. 5，大约5. 0到大约8. 0，以及大约5. 5到大约7. 5。在一个进一步的实施方式中，缓冲剂选自醋酸钠，碳酸钠，柠檬酸盐，双甘氨肽， 组氨酸，甘氨酸，赖氨酸，精氨酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钠，和三(羟甲基)_氨基甲 烷，N-二(羟乙基)甘氨酸，tricine，苹果酸，琥珀酸盐，马来酸，富马酸，酒石酸，天冬氨酸 或其混合物。这些特定缓冲剂中的每种组成了本发明的一个可选实施方式。在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。防腐剂可 选自例如，苯酚，邻甲酚，间甲酚，对甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，2-苯氧基 乙醇，对羟基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，苯甲醇，氯丁醇，和硫柳汞(thiomerosal)，溴硝丙 二醇，苯甲酸，imidurea，氯己啶，脱氢乙酸钠，氯化甲酚，对羟基苯甲酸乙酯，苯索氯铵，氯 酚醚(chlorphenesine) (3-对氯苯氧基丙_1，2- 二醇)，或其混合物。防腐剂可，例如，以 0. lmg/ml 至Ij 20mg/ml,0. lmg/ml 至Ij 5mg/ml，5mg/ml 至Ij 10mg/ml，或 10mg/ml 至Ij 20mg/ml 的浓 度存在。这些特定防腐剂中的每种组成了本发明的一个可选实施方式。防腐剂在药物组合 物中的应用对于熟练技术人员是熟知的。方便的参考可参见Remington :The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995。在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含等渗剂。等渗剂可以，例如，选自 盐(例如，氯化钠)，糖或糖醇，氨基酸(例如，L-甘氨酸，L-组氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮 氨酸，天冬氨酸，色氨酸，苏氨酸)，醛醇(例如，甘油，1,2-丙二醇，1,3-丙二醇，1，3- 丁二 醇)，聚乙二醇(例如，PEG400)，或其混合物。可利用任何糖例如单_，二-或聚糖，或水溶葡 聚糖，包括例如果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，右旋糖酐，普鲁兰多糖(pullulan)，糊精，环式糊精，可溶淀粉，羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一 个实施方式中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个一OH基团的C4-C8烃，并且包 括例如，甘露醇，山梨醇，肌醇，半乳糖醇，己六醇，木糖醇，和阿糖醇。在一个实施方式中，糖 醇添加剂是甘露醇。上述糖或糖醇可独立使用或联合使用。对于用量没有固定的限制，只 要糖或糖醇在液体制剂中可溶并且不会不利地影响利用本发明方法获得的稳定效果即可。 糖或糖醇浓度可以，例如，在大约lmg/ml到大约150mg/ml之间。等渗剂可以例如，lmg/ml 到 50mg/ml，lmg/ml 到 7mg/ml，8mg/ml 到 24mg/ml，或 25mg/ml 到 50mg/ml 的浓度存在。这 些特定等渗剂中的每种构成了本发明的一个可选实施方式。等渗剂在药物组合物中的应 用是熟练技术人员熟知的。方便的参考可参见Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995。在一个进一步的实施方式中，制剂可包含螯合剂。螯合剂可，例如，选自乙烯二胺 四乙酸(EDTA)，柠檬酸，和天冬氨酸的盐，或其混合物。螯合剂可，例如，以0. lmg/ml到5mg/ ml，0. lmg/ml到2mg/ml，或2mg/ml到5mg/ml的浓度存在。这些特定螯合剂中的每种构成 了本发明的一个可选实施方式。螯合剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员熟知的。方 便的参考可参见Remington :The Science andPractice of Pharmacy, 19th edition，1995。在本发明的一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含稳定剂。稳定剂在药物组 合物中的应用是熟练技术人员熟知的。方便的参考可参见Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition，1995。更特别地，本发明的组合物可以是稳定化的液 体药物组合物，其治疗活性成分包括在液体药物制剂的储存过程中可能显示出聚集物形成 的多肽。“聚集物形成”意指多肽分子之间的物理反应，其导致寡聚物的形成，其可保持可 溶，或从溶液中沉淀的大的可见聚集物。“在储存过程中”意指液体药物组合物或制剂一旦 制备，不立刻给予受试者。而是，制备之后，它被包装用以储存，以液体形式，以冷冻状态，或 以干燥形式用以后来重建为液体形式或其他适于给予受试者的形式。“干燥形式”意指通过 冷冻干燥(即，冻干，见例如，Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38 48-59), B^ # zF ( JAL, Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed ；Longman Scientific and Technical, Essez, U. K. ), pp. 491-676 ；Broadhead 等 人(1992)Drug Devel. Ind. Pharm. 18 :1169-1206 ；and Mumenthaler 等人(1994)Pharm. Res. 1112-20)， 或空气干燥(Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25 459-470 ；and Roser (1991) Biopharm. 4 :47_53)，而干燥液体药物组合物或制剂。在液体药物组合物储存过程中多肽的 聚集物形成可不利地影响多肽的生物学活性，导致药物组合物的治疗效能的损失。而且，聚 集物形成可导致其他问题，例如当利用输注系统给予包含多肽的药物组合物时，管类，膜， 或泵的堵塞。本发明的药物组合物可进一步包含一定量氨基酸基料，所述量足以降低在组合物 储存过程中多肽的聚集物形成。“氨基酸基料”意指一种氨基酸或氨基酸的组合，其中任何 给定的氨基酸以其游离基本形式或以盐形式存在。当利用氨基酸组合时，所有氨基酸可以 游离基本形式存在，所有可以盐形式存在，或一些可以游离基本形式存在，而其他的以盐形 式存在。在一个实施方式中，用于制备本发明组合物的氨基酸是携带了带电侧链的那些，例 如精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸。特定氨基酸(例如，甲硫氨酸，组氨酸，咪唑，精氨 酸，赖氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，苏氨酸及其混合物)的任何立体异构体(即，L，
27D，或其混合物)或这些立体异构体的组合，可存在于本发明的药物组合物中，只要特定的 氨基酸以游离基本形式或盐形式存在即可。在一个实施方式中，使用L-立体异构体。本发 明的组合物还可用这些氨基酸的类似物进行制剂。“氨基酸类似物”意指天然存在的氨基酸 的衍生物，其带来降低在本发明的液体药物组合物储存过程中多肽的聚集物形成的期望效 果。适当的精氨酸类似物包括例如，氨基胍，鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，适当的甲硫氨 酸类似物包括乙硫氨酸，丁硫氨酸，并且适当的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。 对于其他氨基酸，氨基酸类似物以游离基本形式或盐形式引入组合物中。在本法明的一个 进一步的实施方式中，氨基酸或氨基酸类似物以足以防止或延迟蛋白的聚集的浓度使用。在本发明的一个进一步实施方式中，甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸类似 物)可被添加，以当作用为治疗剂的多肽为包含至少一个易于进行所述氧化的甲硫氨酸残 基的多肽时，抑制甲硫氨酸残基氧化为甲硫氨酸亚砜。“抑制”意指随着时间甲硫氨酸氧化 种类的最小聚集。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更大地保持在其正确分子形式中。可使用甲 硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。添加的量应该足以抑制甲硫氨酸残基使得甲 硫氨酸亚砜的量对于管理机构可接受。典型地，这表示组合物包含不超过大约10%到大约 30%的甲硫氨酸亚砜。通常，这可通过添加甲硫氨酸使得添加到甲硫氨酸残基的甲硫氨酸 的比例范围为大约1 1到大约1000 1，例如10 1到大约100 1而获得。在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含选自高分子量聚合物或低分子 化合物的稳定剂。在本发明的一个进一步的实施方式中，稳定剂选自聚乙二醇(例如， PEG3350)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，羧基-/羟基纤维素或其衍生物(例如，HPC, HPC-SL，HPC-L和HPMC)，环糊精，含硫物质如单硫甘油，硫代乙醇酸和2-甲基硫代乙醇，和 不同的盐(例如，氯化钠)。这些特定稳定剂中的每种构成了本发明的一个可选实施方式。药物组合物还可包含附加的稳定剂，其进一步增强了其中的治疗活性多肽的稳定 性。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽免于甲硫氨酸 氧化，和非离子表面活性剂，其保护多肽免于与冷冻融化或机械剪切相关的聚集。在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含表面活性剂。表面活性剂可，例如， 选自去污剂，乙氧基化蓖麻油，聚乙二醇化甘油酯，乙酰基化单甘油酯，失水山梨糖醇脂肪 酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如，poloxamers如piulOnic F68，poloxamer 188和407，Triton X-100)，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例 如烷基化和烷氧基化衍生物(tweens，例如，Tween-20，Tween-40，Tween-80和Bri j_35)， 单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物，甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物，醇，甘油，外源凝集素和 磷脂(例如，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，二磷脂酰甘油和鞘磷 脂)，磷脂衍生物(例如，二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂(例如，棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝 氨酸和乙醇胺，胆碱，丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯)和溶血磷脂酰 和磷脂酰胆碱的烷基，烷氧基(烷基酯)，烷氧基(烷基醚)_衍生物，例如，溶血磷脂酰胆 碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物，和极性端基(polar head group)的 修饰物，即胆碱，乙醇胺，磷脂酸，丝氨酸，苏氨酸，甘油，肌醇，和带正电D0DAC，D0TMA, DCP, BISHOP,溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸，和甘油基磷脂(例如，脑磷脂)，甘油基糖 脂(例如，吡喃半乳糖苷(galactopyransoide))，鞘糖脂(例如，神经酰胺，神经节苷脂)， 十二烷基磷酸胆碱，母鸡鸡蛋溶血卵磷脂，羧链孢酸衍生物(例如，牛磺酸二氢羧链孢酸
28钠(sodium tauro-dihydrofusidate)等)，C6-C12的长链脂肪酸和其盐(例如，油酸和 辛酸)，酰基肉毒碱和衍生物，赖氨酸，精氨酸或组氨酸的Na-酰基化衍生物，或赖氨酸或 精氨酸的侧链酰基化衍生物，包含赖氨酸，精氨酸或组氨酸和一个中性或酸性氨基酸的任 何组合的二肽的…-酰基化衍生物，包含一个中性氨基酸和两个带电氨基酸的任何组合的 三肽的Na-酰基化衍生物，DSS(多库酯钠，CAS登记号[577-11-7])，多库酯钙，CAS登记 号[128-49-4])，多库酯钾，CAS登记号[7491-09-0])，SDS (十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸 钠)，辛酸钠，胆酸或其衍生物，胆汁酸和其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物，熊去氧胆酸，胆酸 钠，脱氧胆酸钠，牛磺胆酸钠，甘胆酸钠，N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸 盐，阴离子(烷基_芳基-磺酸盐)单价表面活性剂，两性离子表面活性剂(例如，N-烷 基-N，N- 二甲基铵基-1-丙烷磺酸盐，3-胆酰胺-1-丙基二甲基铵基-1-丙烷磺酸盐，阳 离子表面活性剂(季铵碱)(例如，鲸蜡基-三甲基溴化铵，氯化鲸蜡基吡啶)，非离子表面 活性剂(例如，十二烷基0-0_吡喃葡萄糖苷)，？01( ￡11^11^(例如，1^廿011化’ s)，其是源 于连续添加氧化丙烯和氧化乙烯到1，2_乙二胺的四功能嵌段共聚物，或者表面活性剂可 选自咪唑啉衍生物，或其混合物。这些特定表面活性剂中的每种构成了本发明的一个可选 的实施方式。表面活性剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员熟知的。方便的参考可参见 Remington :The Science and Practice ofPharmacy，19thedition，1995。在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含蛋白酶抑制剂例如EDTA(乙烯二胺 四乙酸)和苄甲脒HCL，但是也可使用其他的商业上可获得的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂 的利用在包含蛋白酶的酶原的药物组合物中是特别有用的，以抑制自身催化。其他成分也可存在于本发明的肽药物制剂中。所述附加成分可包括湿润剂，乳化 剂，抗氧化剂，填充剂，张力改良剂，螯合剂，金属离子，油质媒介，蛋白(例如，人血清白蛋 白，胶质或蛋白)和两性离子(例如，氨基酸例如甜菜碱，牛磺酸，精氨酸，甘氨酸，赖氨酸和 组氨酸)。所述附加成分当然不应不利地影响本发明药物制剂的总的稳定性。包含根据本发明抗体的药物组合物可在几个位点给予需要所述治疗的患者，例 如，在局部位点，例如，皮肤和粘膜位点，在旁路吸收的位点，例如，在动脉，静脉，心脏内给 药，和在涉及吸收的位点，例如，在皮肤内，皮肤下，肌肉内或在腹部内给药。根据本发明的药物组合物的给药可通过几种给药途径，例如，皮下，肌肉内，腹膜 内，静脉内，舌，舌下，口腔，嘴内，口服，胃内，肠内，鼻内，肺内，例如，通过细支气管和海马 槽或其组合，表皮，真皮，经皮，阴道，直肠，眼睛，例如通过结膜，输尿管，和肠胃外给予需要 所述治疗的患者。本发明的组合物可以几种剂量形式给药，例如，以溶液，悬浮液，乳剂，微乳剂，多 乳剂，泡沫剂，软膏(salves)，糊剂，硬膏剂(plasters)，油膏剂(ointments)，片剂，包衣片 剂，冲洗剂，胶囊，例如，硬胶质胶囊和软胶质胶囊，栓剂，直肠胶囊，滴剂，凝胶，喷雾剂，粉 末剂，气溶胶，吸入剂，滴眼剂，眼油膏，眼冲洗剂，阴道栓剂，阴道环，阴道油膏，注射液，原 位转化溶液，例如原位凝胶化，原位设置，原位沉淀，原位结晶化，输注溶液，和植入物。本发明的组合物可进一步化合入，或附着于，例如，通过共价，疏水和静电相互作 用，药物载体，药物递送系统和高级药物递送系统以进一步增强抗体的稳定性，提高生物可 利用度，提高溶解性，降低不利效应，获得本领域熟练技术人员熟知的时间治疗，并且提高
29患者顺从或其任何组合。载体，药物递送系统和高级药物递送系统的例子包括但不限于聚 合物，例如纤维素和衍生物，多糖，例如右旋糖酐和衍生物，淀粉和衍生物，聚(乙烯醇)，丙 烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸和其嵌段共聚物，聚乙二醇，载体蛋白， 例如白蛋白，凝胶，例如，热凝胶化系统，例如本领域熟知的嵌段共聚系统，微胶粒，脂质体， 微球体，纳米微粒，液晶和其分散体，L2相和其分散体，这是脂质_水系统中相行为的领域 中熟练技术人员熟知的，聚合微胶粒，多乳剂，自身乳化，自身微乳化，环式糊精和其衍生 物，禾口 dendrimers。本发明的组合物在用于肺给予抗体的固体，半固体，粉末和溶液制剂中是有用的， 所述给药利用例如计量剂量吸入器，干燥粉末吸入器和喷雾器，所有都是本领域熟练技术 人员熟知的装置。本发明的组合物在控释，持续释放，延长释放，延迟释放，和缓释药物递送系统的 制剂中也是有用的。更特别地，但不限于，组合物在肠胃外控释和持续释放系统(两种系统 都导致给药量的许多倍的降低)的制剂中是有用的，这是本领域熟练技术人员熟知的。甚 至更优选的是皮下给药的控释和持续释放系统。不限制本发明的范围，有用的控释系统和 组合物的例子是水凝胶，油质凝胶，液晶，聚合微胶粒，微球，纳米颗粒。产生对于本发明的组合物有用的控释系统的方法包括但不限于，结晶化，浓 缩，共结晶化，沉淀，共沉淀，乳化，分散，高压均化，胶囊化，喷雾干燥，微胶囊化，凝聚， 相分离，溶剂蒸发以产生微球，挤压和超临界流体方法。一般的参考可参见Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise, D. L. , ed.Marcel Dekker, New York, 2000)禾口 Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99 :Protein Formulation andDelivery(MacNally, E. J. , ed. Marcel Dekker, New York,2000)。可通过用注射器，任选类钢笔注射器，皮下，肌肉内，腹膜内或静脉内注射而实施 肠胃外给药。或者，肠胃外给药可通过输注泵而实施。进一步的选择是可以是用于给予鼻 或肺喷雾形式的抗体化合物的溶液或悬浮液的组合物。作为仍然进一步的选择，包含本发 明抗体的药物组合物也可调整为经皮给药，例如通过无针注射或从贴片，任选电离子透入 贴片，或透粘膜，例如口腔，给药。抗体可在媒介中作为溶液，悬浮液或干燥粉末利用适于肺给药的任何已知类型的 装置通过肺途径给药。这些的例子包含但不限于三种普通类型的用于肺给药的气溶胶产 生，并且可包括喷射或超声喷雾器，计量剂量吸入器，或干燥粉末吸入器(参见Yu J, Chien Yff. Pulmonarydrug delivery :Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther DrugCarr Sys 14 (4) (1997)395-453)。基于标准化的测试方法，粒子的空气动力学直径(da)定义为单位密度的参考标准 球形颗粒的几何当量直径(lg/cm3)。在最简单的情况中，对于球形颗粒，da与参考直径(d) 的关系为如下述的密度比例的平方根函数对于非球颗粒存在这种关系的修正(参见Edwards DA, Ben-JebriaA, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379—385)。术语 “MMAD” 禾口 “MMEAD” 被很好地描述并且是本领域已知的(参见 Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R and represents a measure of themedian value of an aerodynamic particle size distribution. Recentadvances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385)。质量中值空气动力学直径(MMAD)和质量中值 有效空气动力学直径(MMEAD)可互换使用，是统计学参数，并且根据经验地描述了与它 们沉积在肺中的潜能有关而与实际形状，大小，或密度无关的气溶胶颗粒的大小(参见 EdwardsDA,Ben-Jebria A,Langer R. Recent advances in pulmonary drug deliveryusing large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379—385) 。 MMADffl^H 用撞击器(impactors)，一种测量空气中颗粒惯性行为的仪器，的测量中计算。在一个进一步的实施方式中，可通过任何已知的气溶胶化技术气溶胶化制剂， 例如喷雾法，以获得小于1(^!11的气溶胶颗粒皿仪0，更优选在1-5 μ m之间，并且最优选 1-3 μ m之间。优选的颗粒大小是基于递送药物到深肺的最有效大小，在深肺中蛋白被最 佳地吸收(参见 Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drugdelivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998)379-385)。包含抗体的肺制剂的深肺沉积可通过利用吸入技术的改进而进一步最优化，例 如，但不限于缓慢吸入流动(slow inhalation flow)(例如，30L/分钟)，呼吸保持和定时 刺激。术语“稳定化的制剂”指具有提高的物理稳定性，提高的化学稳定性或提高的物理 和化学稳定性的制剂。本文所用的术语蛋白制剂的“物理稳定性”指蛋白形成蛋白的无生物活性和/或 不溶聚集体的倾向，作为蛋白暴露于热-机械压力和/或与去稳定化的界面和表面，例如疏 水表面和界面，相互作用的结果。水蛋白制剂的物理稳定性通过在将填充入适当容器(例 如，药筒或管形瓶)中的制剂在不同温度暴露于机械/物理压力(例如，搅动)不同时间段 之后目测和/或浊度测量来评价。制剂的目测在具有黑暗背景的尖锐聚焦灯中进行。制剂 的浊度用目测评分表征，所述目测评分将浊度分级为例如0到3的等级(不显示浊度的制 剂对应于目测评分0，在日光下显示出目测浊度的制剂对应于目测评分3)。制剂是根据蛋 白聚集的分级的物理不稳定的，当它显示出在日光下的目测浊度时。或者，制剂的浊度可通 过熟练技术人员熟知的简单的浊度测量而评价。水蛋白制剂的物理稳定性还可通过利用蛋 白的构象状态的分光镜试剂或探针来评价。探针优选是优先结合蛋白的非天然构象体的小 分子。蛋白结构的小分子分光镜探针的一个例子是硫黄素T。硫黄素T是广泛应用于淀粉 样蛋白小纤维的检测的荧光染料。在小纤维存在下，并且也许还有其他蛋白构型，硫黄素T 当与小纤维蛋白形式结合时在大约450nm产生新的最大激发，并且在大约482nm产生增强 的发射。未结合的硫黄素T在该波长基本上是非荧光的。其他小分子可用作蛋白结构从天然到非天然状态的改变的探针。例如优先结合蛋 白的暴露的疏水贴片的“疏水贴片”探针。疏水贴片通常隐藏在天然状态的蛋白的三级结构 中，但当蛋白开始解折叠或变性时成为暴露的。这些小分子，分光镜探针的例子是芳香的， 疏水染料，例如蒽类(antrhacene)，吖啶类(acridine)，菲咯啉类等。其他分光镜探针是金 属氨基酸复合物，例如疏水氨基酸的钴金属复合物，例如，苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，和缬氨酸等。本文所用的术语蛋白制剂的“化学稳定性”指蛋白结构中的化学共价改变，其导 致形成与天然蛋白结构相比具有潜在更小的生物效能和/或潜在提高的免疫原性质的化 学降解产物。可根据天然蛋白的类型和性质以及蛋白暴露的环境形成多种化学降解产物。 化学降解的消除最可能不能完全避免，并且提高量的化学降解产物通常在储存和蛋白制剂 的利用过程中可见，如本领域熟练技术人员熟知的。大多数蛋白倾向于脱酰胺，在该过程 中谷氨酰或天冬氨酰残基的侧链酰胺基被水解以形成游离羧酸。其他降解途径涉及形成 高分子量的转化产物，其中两种或更多种蛋白分子通过转酰胺和二硫键相互作用而相互 共价连接，导致形成共价结合的二聚体，寡聚体和多聚体降解产物(Stability ofProtein Pharmaceuticals, Ahern. Τ· J. & Manning Μ. C. ,Plenum Press,New Yorkl992)。氧化(例 如甲硫氨酸残基的)可被提及为化学降解的另一变体。蛋白制剂的化学稳定性可通过在暴 露于不同环境条件后在不同时间点测量化学降解产物的量而评价(降解产物的形成通常 可通过例如提高温度而增加)。每种独立降解产物的量通常通过根据分子大小和/或电荷 利用多种色谱法技术(例如，SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分离降解产物而确定。因此，如上所述，“稳定化的制剂”指具有提高的物理稳定性，提高的化学稳定性或 提高的物理和化学稳定性的制剂。通常，制剂必须在使用和储存过程中(按照推荐的使用 和储存条件)稳定直到到达产品有效期。在本发明的一个实施方式中，包含抗体的药物制剂在超过6周的使用中，和超过3 年的储存中保持稳定。在本发明的另一实施方式中，包含抗体的药物制剂在超过4周的使用中和超过3 年的储存中保持稳定。在本发明的另一实施方式中，包含抗体的药物制剂在超过4周的使用中和超过2 年的储存中保持稳定。在本发明的一个更进一步的实施方式中，包含抗体的药物制剂在超过2周的使用 中和超过2年的储存中保持稳定。还可通过调查其他已经开发的治疗性单克隆抗体的经验确定适当的抗体制 剂。几种单克隆抗体已经显示出在临床环境下是有效的，例如Rituxan (Rituximab)， Herceptin (Trastuzumab)Xolair(Omalizumab) , Bexxar(Tositumomab)， Campath (Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym并且类似制剂可与本发明抗体一起使用。例如， 单克隆抗体可以在IOOmg(IOmL)或500mg(50mL) —次使用的管形瓶中10mg/mL的浓度提 供，制剂用于以9. Omg/mL氯化钠，7. 35mg/mL柠檬酸钠二水合物，0. 7mg/mL聚山梨醇酯80， 和注射用无菌水IV给予。PH调整到6.5。在另一实施方式中，抗体以包含大约20mM柠檬 酸钠，大约150mMNaCl，PH为大约6. O的制剂提供。治疗应用还提供了利用本文所述的抗-NKG2A抗体治疗患者的方法。在一个实施方式中，本 发明提供了本文所述的抗体用于制备用于给予人患者的药物组合物的用途。典型地，患者 患有癌症，病毒性疾病，炎性病症，或自身免疫病症，或有患有这些疾病的风险。或者，本发 明的抗体用于改善患者中的骨髓移植。例如，在一个方面，本发明提供了增强CD94/NKG2A-限制的淋巴细胞在有此需要
32的患者中的活性，包括步骤给予所述患者人或人化抗-NKG2A抗体，所述抗体降低或防止 HLA-E介导的CD94/NKG2A受体的活化。在一个实施方式中，方法涉及提高所述淋巴细胞在 患者中的活性，所述患者具有疾病，在所述疾病中提高的NK、T和/或NKT细胞活性是有益 的，其涉及，影响对NK、T或NKT细胞溶解易感的细胞或由其引起，或其由不充分的NK、T或 NKT细胞活性引起或表征，例如癌症，感染性疾病或免疫病症。更特别地，本发明的方法和组合物用于治疗多种癌症和其他增殖性疾病，包括但 不限于癌症，包括膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，胃 癌，子宫癌，甲状腺癌和皮肤癌，包括鳞状细胞癌；淋巴系造血肿瘤，包括白血病，急性淋巴 细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，B-细胞淋巴瘤，T-细 胞淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，非-何杰金淋巴瘤，毛细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤，和多发性 骨髓瘤骨髓系造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病，前髓细胞性白血病，和骨髓异常 增生综合征；间充质源肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其他肿 瘤，包括黑素瘤，精原细胞瘤，畸胎癌，成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统的 肿瘤，包括星细胞瘤，成神经细胞瘤，神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质源肿瘤，包括纤维肉 瘤，横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤，着色性干皮病 (xeroderma pigmentosum)，角化棘皮瘤，精原细胞瘤，甲状腺滤泡性癌和畸胎癌。可被根据本发明治疗的特定病症包括淋巴系造血肿瘤，例如T-细胞和B-细胞肿 瘤，包括但不限于T-细胞病症例如T-前淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑形细 胞类型；优选T细胞类型的大粒状淋巴细胞白血病(LGL) ；Sezary综合征(SS)；成人T-细 胞白血病淋巴瘤(ATLL) ；T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/后-胸腺T细胞淋巴瘤(多形和免疫母 细胞亚型)；血管免疫母细胞T-细胞淋巴瘤；血管中心性(angiocentric)(鼻)T-细胞淋 巴瘤；退行发育的(Kil+)大细胞淋巴瘤；肠T-细胞淋巴瘤；T-成淋巴细胞的；淋巴瘤/白 血病(T-Lbly/T-ALL)，多发性骨髓瘤。其他的增生性病症也可根据本发明治疗，包括例如，增生，纤维症(特别是肺部 的，还有其他类型的纤维症，例如肾纤维症)，血管发生，牛皮癣，动脉硬化症和血管中的平 滑肌增生，例如器官狭窄或血管成形术之后的再狭窄。在一个特别方面，本发明的抗体用于治疗粒状淋巴细胞的NK-类型的淋巴增生性 疾病；或称为NK-LGL)，指由NK细胞或NK-样细胞的克隆扩增引起的一类增生性病症，所 述NK-样细胞即显示出表面抗原表达的特征性组合(例如，⑶3_，⑶56+，⑶16+等；见例 如，Loughran(1993)Blood 82:1)的大粒状淋巴细胞。这些病症之下的细胞增殖可具有可 变效果，从在一些患者中可见的温和症状到称为NK-LDGL白血病的攻击性，经常致命的形 式的疾病。这类病症的症状可包括发烧，温和的嗜中性白血球减少症，血小板减少症，贫 血症，淋巴细胞增多，脾肿大，肝肿大，淋巴结病，骨髓渗透，和其他(见例如，Zambello等 人(2003)Blood 102 1797 ；Loughran(1993)Blood 82 1 ；Epling-Burnette 等人(2004) Blood-2003-02-400)。基于⑶94/NKG2A抗体的治疗还可用于治疗或防止感染性疾病，优选包括任何由 病毒，细菌，原生动物，霉菌或真菌引起的感染。所述病毒感染性生物体包括但不限于， 甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，流感，水痘，腺病毒，1型单纯疱疹(HSV-I)，2型单纯疱 疹(HSV-2)，牛瘟，鼻病毒，艾柯病毒，轮状病毒，呼吸道合胞病毒，乳头瘤病毒，乳头瘤病毒，巨细胞病毒，echinovirus，虫媒病毒，huntavirus，柯萨奇病毒，腮腺炎病毒，麻疹病 毒，风疹病毒，脊髓灰质炎病毒和1型或2型人免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2)。细菌构 成了另一优选类的感染性生物体，包括但不限于下述葡萄球菌属(Staphylococcus)； 链球菌属(Str印tococcus)，包括化脓链球菌(S. pyogenes) ；Enterococcl ；芽孢杆菌属 (Bacillus)，包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，和乳酸杆菌属(Lactobacillus)； 李斯特菌属(Listeria)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；加德纳氏菌属 (Gardnerella)，包括阴道加德纳氏菌G. vaginalis ；诺卡式菌属(Nocardia)；链霉菌属 (Streptomyces)；普通 ι 放线菌(Thermoactinomyces vulgaris) ；Treponema ；Sf
If 菌属(Camplyobacter),假单胞菌属(Pseudomonas)包括铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)； 军团菌属(Legionella)；奈瑟球菌属(Neisseria)，包括淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae) 和脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)；黄杆菌属(Flavobacterium)，包括脑膜脓毒性黄 杆菌(F. meningosepticum)禾口气味黄杆菌(F. odoraturn)；布鲁氏菌属(Brucella)； 包特菌属(Bordetella)，包括百日咳包特菌(B. pertussis)和支气管炎包特菌 (B. bronchiseptica)；埃希氏菌属(Escherichia)，包括大肠埃希氏菌(E. coli)，克雷伯氏 菌属(Klebsiella)；肠杆菌属(Enterobacter)，沙雷氏菌属(Serratia)，包括粘质沙雷氏 菌(S. marcescens)禾口液化沙雷氏菌(S. Iiquefaciens)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)； 变形杆菌属(Proteus)，包括奇异变形菌(P. mirabilis)和普通变形菌(P. vulgaris)； 链杆菌属(Str印tobacillus)；立克次氏体科(Rickettsiaceae)，包括 R. fickettsfi，衣 原体(Chlamydia)，包括鹦鹉热衣原体(C. psittaci)和砂眼衣原体(C. trachomatis)； 分枝杆菌属(Mycobacterium)，包括结核分枝杆菌(M. tuberculosis)，胞内分枝杆菌(M. intracellulare)， M. folluiturn, M. laprae, Mj 资 木干胃(M. avium)， 41 ^ ff (M. bovis)，非洲分枝杆菌(M. africanum)，堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)，胞内分枝杆菌(M. intracellulare),禾口鼠麻风分枝杆菌(M. Iepraernurium)；禾口诺卡氏菌属(Nocardia)。原 生动物可包括但不限于,利什曼原虫(Ieishmania)，kokzidioa，和锥体虫(trypanosoma)。 寄生虫包括但不限于衣原体和立克次氏体。感染性疾病的完整名单可在疾病控制中心 (⑶C)的国家感染性疾病中心(NCID)的网址上找到(全球网(www)地址cdc. gov/ncidod/ diseases/)，其名单通过援引并入本文。所有这些疾病是利用本发明的抑制性抗-⑶94/ NKG2A抗体治疗的候选者。在另一方面，抗-NKG2A抗体用于靶向和杀伤在例如患有特征为癌细胞上的CD94/ NKG2A表达的癌症的患者中的NKG2A-表达细胞，所述癌症例如NK-或T-细胞淋巴瘤。在一 个实施方式中，给予包含人化抗体和细胞毒性剂的免疫缀合体的形式的人化抗体。在另一方面，抗-NKG2A抗体用于治疗或预防自身免疫或炎性病症。可利用本方 法治疗的示例性的自身免疫病症包括，尤其是，溶血性贫血，恶性贫血，结节性多动脉炎，全 身性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus) ,Wegener' s肉芽肿病，自身免疫性肝炎， Behcet' s疾病，Crohn' s疾病，原发性胆汁性肝硬化，硬皮病，溃疡性结肠炎，Sjogren' s 综合征，1型糖尿病，葡萄膜炎，Graves ‘疾病，阿尔茨海默病，甲状腺炎，心肌炎，风湿热， 硬皮病，强直性脊柱炎，类风湿性关节炎，血管球性肾炎，结节病，皮肌炎，肌无力，多肌炎， Guillain-Barre综合征，多发性硬化症，秃头症，天庖疮/类天庖疮，大疱性类天疱疮， Hashimoto' s甲状腺炎，牛皮癣，和白癜风。
可被这些方法治疗的炎性病症的例子包括但不限于，肾上腺炎，齿槽炎，胆囊胆管 炎，阑尾炎，龟头炎，睑炎，支气管炎，粘液囊炎，心脏炎，蜂窝织炎，子宫颈炎，胆囊炎，声带 炎，耳蜗炎，结肠炎，结膜炎，膀胱炎，皮炎，憩室炎，脑炎，心内膜炎，食道炎，咽鼓管炎，纤维 组织炎，毛囊炎，胃炎，肠胃炎，齿銀炎，舌炎，肝脾炎，角膜炎，内耳炎，喉炎，淋巴管炎，乳腺 炎，中耳炎，脑膜炎，子宫炎，粘膜炎，心肌炎，肌炎，鼓膜炎，肾炎，神经炎，睾丸炎，骨软骨 炎，耳炎，心包炎，腱鞘炎，腹膜炎，咽炎，静脉炎，急性骨髓灰白质炎，前列腺炎，牙髓炎，视 网膜炎，鼻炎，输卵管炎，巩膜炎，巩膜脉络膜炎，阴囊炎，窦炎，脊椎炎，脂肪组织炎，口炎 (stomatitis)，滑膜炎，咽鼓管炎，腱炎，扁桃腺炎，尿道炎和阴道炎。还显示了 NK细胞同种异体反应性地杀伤树突状细胞改善了造血细胞在骨髓移植 中的移植(L. Ruggeri等人，Science，2002，295 :2097-2100)。因此，在另一实施方式中，本 发明提供了改善造血细胞在患者中的移植的方法，包括给予所述患者包含活化性抗体的本 发明的组合物的步骤。移植体对抗宿主的疾病的发生率和严重性的降低，移植体存活的延 长，或移植体治疗的疾病(例如，造血性癌症)的症状的降低或消除中的任何一种证明了移 植的改善。这种方法优选用于白血病的治疗。组合治疗许多治疗剂对于治疗癌症是有用的。本发明的抗体组合物和方法因此还可与任何 其他通常用于治疗特定疾病，特别是肿瘤，癌症，或患者显示出的其他疾病或病症，的方法 组合。只要特定的治疗方法不已知自身损害患者的状况，并且不显著地抵消基于抗-CD94/ NKG2A抗体的治疗即可，其与本发明的组合是预期的。与实体肿瘤治疗相关，本发明可用于与经典方法组合，例如，外科手术，放射治疗， 化疗，等。本发明因此提供了组合疗法，其中根据本发明的抗-CD94/NKG2A抗体在外科手术 或放射治疗同时，之前，或之后使用；或在另一抗癌症试剂给予同时，之前，或之后给予。可 以确信外科手术，放射治疗或抗癌症试剂与本发明组合物的活性试剂组合对癌症施加了有 利的组合作用。示例性抗癌症试剂包括化疗试剂，激素试剂，抗_血管生成试剂，抗_转移试剂， 抗_癌症抗体(例如，Rituximab)，针对抑制性KIR-分子的抗体，生长因子抑制剂，细胞凋 亡促进化合物，细胞因子和其他免疫调节试剂，与毒素或放射核素缀合的肿瘤靶向试剂，干 扰DNA复制，有丝分裂和染色体分离的化合物，和破坏多核苷酸前体的合成和保真度的试 剂。对于自身免疫或炎性病症，已知对于一种或更多种类型的自身免疫或炎性病症， 或自身免疫或炎性病症的任何症状或特征有效的任何其他化合物，包括尤其是，免疫抑制 剂，例如，咪唑硫嘌呤(例如，Imuran), chiorambucil (例如，Leukeran)，环磷酰胺(例 如，Cytoxan)，环抱霄素(例如，Sandimmune, Neoral),甲氛蝶吟(例如，Rheumatrex),. 皮质类固醇，强的松(例如，Deltasone, Meticorten)，Etanercept (例如，Enbrel)， infliximab(例如 Remicade)，TNF 抑制剂，FK-506，雷帕霉素(raparnycin)，霉酚酸酯 (mycophenolate mofetil)，来氟米特(leflunomide)，抗-淋巴细胞球蛋白，脱氧精胍菌素 (deoxyspergualin)或 OKT0免疫调节化合物的优选例子包括细胞因子。其他例子包括具有效果的化合物，优 选效果为活化或增强NK细胞活性，或诱导或支持NK细胞增殖。在包含本发明试剂的组合
35物之前，同时，或之后给予的其他化合物是附加化合物(例如，抗-催吐药和止痛剂)和抗
病毒试齐U。如本领域普通技术人员理解的，抗癌症试剂的适当剂量大约为已用于临床治疗的 那些，其中抗癌症试剂单独给予或与其他试剂组合给予。剂量将很可能根据待治疗的状况 而改变。给予治疗的内科医师将能够确定对于各个受试者的适当剂量。制备的物品在本发明的另一实施方式中，提供了包含对于上述病症的治疗有用的材料的制备 的物品。例如，制备的物品可包括容器，所述容器包含本文所述的抗体与指导使用者用有效 量的抗体治疗哺乳动物中的病症，例如癌症或病毒性疾病，的说明。在一个优选实施方式 中，哺乳动物是人类。制备物品典型地包含容器，和在容器上或与容器关联的标记或包装说 明书。适当的容器包括，例如，瓶子，管形瓶，注射器等。容器可从多种材料形成，例如玻璃， 或塑料。容器包含对于治疗状况有效的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可以是具 有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液包或管形瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本 文的人化抗-NKG2A抗体，或包含所述人化抗体的抗体衍生物(例如，免疫缀合物)。标记或 包装说明显示了组合物用于治疗选择的状况，例如癌症或病毒性疾病。而且，制备的物品可包含(a)具有包含在其中的组合物的第一容器，其中组合物 包含本文所述抗体，和(b)具有包含在其中的组合物的第二容器，其中组合物包含第一抗 体之外的治疗剂。在本发明的这一实施方式中的制备的物品可进一步包含包装说明，其显 示第一和第二组合物可组合用于治疗癌症或病毒性疾病。所述治疗剂可以是任何先前部分 所述的附加治疗(例如，化疗剂，抗_血管生成试剂，抗_激素化合物，心脏保护剂，和/或 哺乳动物免疫功能调节剂，包括细胞因子)。替代地，或另外地，制备物品可进一步包含第二 (或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如细菌抑制注射用水(BWFI)，磷酸盐缓 冲盐水，Ringer' s溶液和葡萄糖溶液。可进一步包含其他从商业和使用者立场期望的材 料，包括其他缓冲剂，稀释液，过滤器，针，和注射器。如上所述，几种单克隆抗体已经显示出在临床环境下是有效的(例如， Rituxan(Rituximab)和其他)，并且类似的给药方案(即，剂量和/或给药计划)可用于本 发明的抗体。给药的方案和剂量可根据用于这些产品的已知方法确定，例如利用生产者的 说明。例如，抗体制剂可以在IOOmg(IOmL)或500mg(50mL) —次使用的管形瓶中10mg/mL的 浓度提供。对于本发明抗体的示例性的适当剂量范围可以是大约10mg/m2到500mg/m2。注 射抗-NKG2A抗体的量和计划，例如，使细胞饱和24小时，48小时，72小时或一周或一个月， 可考虑抗体的亲和性和其药物动力学参数而确定。然而，应理解这些计划是示例性的，抗体 的最佳计划和方案和耐受性必须在临床实验中确定。非治疗应用本发明的抗体(例如，人化抗-NKG2A抗体)还具有非治疗应用。例如，抗体可用作亲和纯化试剂。在这种方法中，抗体固定在固相上例如， SEPHADEX 树脂或滤纸，利用本领域熟知的方法。固定的抗体与待纯化的包含NKG2A蛋白 (或其片段)的样品接触，并且然后用适当的溶剂清洗支持物，所述溶剂将基本上除去样品 中除了 NKG2A蛋白之外的所有物质，NKG2A蛋白与固定抗体结合。最后，用另一适当的溶剂
36清洗支持物，例如，甘氨酸缓冲液，PH5. 0，其将NKG2A蛋白从抗体中释放出来。抗-NKG2A抗体还可用于诊断性测定NKG2A蛋白，例如，检测其在特定细胞，组织， 或血清中的表达。对于诊断性应用，抗体典型地用可检测部分标记。可一般地分组入下述类别的多 种标记是可用的(a)放射性同位素，例如 35S，14C，125I，3H，和 131L 利用例如 Current Protocols in Immunology, Volumes land 2, Coligen 等人，Ed. ffiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs. (1991)所述的技术，可用放射性同位素标记抗体，并且可利用闪烁计数测量放射活性。(b)荧光标记例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生 物，丹磺酰(dansyl)，丽丝胺(Lissamine)，藻红蛋白和德克萨斯红(Texas Red)是可用的。 这些荧光标记可利用例如上述Current Protocols in Immunology中公开的技术与抗体缀 合。可利用荧光计定量荧光。(c)多种酶-底物标记是可用的，并且美国专利号4，275，149提供了这些中的一 些的综述。酶通常催化可利用多种技术测量的发色底物的化学改变。例如，酶可催化底物 中的颜色改变，其可分光光度地测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。定量荧光 改变的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应成为电子激发的，并且可然后发射可被 测量的光(例如，利用化学发光计量器)或提供能量给荧光接纳体。酶标记的例子包括萤 光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4，737，456)，萤光素，2，3- 二 氢二氮杂萘二酮类，苹果酸脱氢酶，尿素酶，过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性 磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧 化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化 物酶，微过氧化物酶，等。将酶与抗体缀合的技术描述于0' Sullivan等人，“Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay,” in Methods in Enzym. (Ed. , J. Langone&H. VanVunakis) , Academic Press, New York,73 147-166(1981)。酶-底物组合的例子包括，例如(i)过氧化氢作为底物的辣根过氧化物酶(HRPO)，其中过氧化氢氧化染料前体 (例如，邻苯二胺(OPD)或3，3' ,5,5' _四甲基对二氨基联苯盐酸盐(TMB))；(ii)对-硝苯基磷酸酯作为发色底物的碱性磷酸酶(AP)；和(iii)具有发色底物的β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)(例如，对硝苯基-β _D_半 乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基umbelliferyl-对-β-半乳糖苷酶。多种其他酶_底物组合对于本领域熟练技术人员是可获得的。对于关于这些的普 通综述，见美国专利号4，275，149和4，318，980。有时，标记间接与抗体缀合。熟练技术人员将了解获得其的多种技术。例如，抗体 可与生物素缀合，并且上述三大类标记可与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性 地结合抗生物素蛋白，并且由此，标记可与抗体以间接方式缀合。或者，为获得标记与抗体 的间接缀合，抗体与小半抗原(例如，地高辛)缀合并且一种上述不同类型的标记与抗-半 抗原抗体缀合(例如，抗-地高辛抗体)。由此，可获得标记与抗体的间接缀合。
在本发明的另一实施方式中，抗-NKG2A抗体不需要标记，并且可利用结合NKG2A 抗体的标记的二抗检测其存在。本发明的抗体可用于任何已知的测定方法中，例如竞争结合测定，直接和间接三 明治测定，和免疫沉淀测定。Zola，Monoclonal Antibodies :A Manual ofTechniques, pp.147-158(CRC Press, Inc. 1987)。对于免疫组织化学，例如，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或可包埋于石蜡中并 且用防腐剂例如福尔马林固定。抗体还可用于体内诊断性测定。通常地，抗体用放射性核素或可通过例如核磁共 振或本领域已知的其他方法检测的非放射活性指示剂标记。优选，标记是放射性标记，例 如，125I，131I，67Cu，99mTc，或mIn。标记的抗体给予宿主，优选通过血流，并且标记抗体在宿主 中的存在和定位被测定。这种成像技术适当地用于检测肿瘤，肿瘤分期，和治疗肿瘤中。放 射性同位素与蛋白通过任何手段缀合，包括金属-螯合化合物或乳过氧化物酶，或用于碘 酸化的iodogen技术。为方便起见，本发明的抗体可以试剂盒提供，即组合了预定量的试剂和实施诊断 性测定的说明的包装。当抗体标记了酶时，试剂盒将包括底物和酶需要的辅因子(例如，提 供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包括其他添加剂例如稳定剂，缓冲剂(例 如，block缓冲剂或裂解缓冲剂)等。不同试剂的相对量可以广泛地改变以提供大大优化 测定的灵敏度的溶液中试剂的浓度。特别地，试剂可提供为干燥粉末，通常为冷冻干燥的， 包括赋形剂，当溶解时，其将提供具有适当浓度的试剂溶液。
实施例本发明的进一步的细节通过下述非限制性实施例例示。实施例1-Z199是非竞争性CD94/NKG2A拮抗剂本实施例描述了 HP-3D9，Z270，和Z199的结抗性和HLA-E-阻断能力的评价。材料&方法Zl99诱导表达HLA-E的肿瘤细胞被CD94/NKG2A-限制NK-细胞的杀伤。HLA-E 是NK-抑制性受体⑶94/NKG2A的功能配体，如图1所示。该图包含代表性的51Cr-释放细 胞毒性测定，其中描述了⑶94/NKG2A+NKL细胞杀伤51Cr-标记的LCL 721. 221 (功能性地 HLA-EO或LCL 721. 221_Cw3细胞(功能性地HLA-E+)的能力。在这些测定中，效应细胞(E) 与51Cr-标记的靶细胞⑴以不同的E T比例，在包含5% CO2的潮湿孵育器中在37°C孵 育4小时。通过测量在组织培养基中51Cr的量分析靶细胞的杀伤，其在杀伤时被靶细胞释 放。杀伤注解为最大可能杀伤(即，当细胞溶解时)的百分比，对在同一时期中细胞的51Cr 的自发释放校正。在方程式中比杀伤(％ )定义为
100，样品中51Cr-释放—自发51Cr-释放) (最大51Cr-释放-自发51Cr-释放)在图1中，很明显与缺乏功能HLA-E的肿瘤细胞(菱形)相比NKL细胞较不有 效地杀伤表达功能HLA-E的肿瘤细胞(三角形)。当NKL细胞与饱和浓度的小鼠mAb HP-3D9 (抗-CD94)或Z199 (抗-NKG2A)预孵育时，HLA-E+靶细胞以相似于相同测定中HLA-E—肿瘤细胞的水平被有效得多地杀伤(叉)。因此，HLA-E限制了靶细胞被表达⑶94/ NKG2A的效应细胞(例如，NK, NKT, α / β T-细胞和Y / δ T-细胞)的杀伤，其可被功能性 地阻断CD94/NKG2A的mAb防止。Z199是非竞争性⑶94/NKG2A拮抗剂。为测试⑶94/NKG2A-抑制性抗体是否防止 配体(S卩，HLA-E)结合CD94/NKG2A，我们分析了 HP-3D9和Z199是否能防止HLA-E四聚物 结合过表达 CD94/NKG2A 的 Ba/F3 细胞(Ba/F3_CD94/NKG2A)。为此，Ba/F3_CD94/NKG2A 与下列孵育1) mAb (HP-3D9 (10 μ g/ml)或 Z199 (10 μ g/ml))，2) PE 标记的 HLA-E 四聚物 (4.7yg/ml)，或3)首先与mAb孵育，然后与PE标记的HLA-E四聚物孵育。所有的孵育在 包含2% FCS的组织培养基中在冰上进行。接下来，洗涤之后，细胞与APC-缀合的特异于小 鼠Ab的二抗孵育，并利用BD Biosciences FACSarray通过流式细胞术分析。如图2所示， HP-3D9(2A)和Z199(2D)导致细胞群沿着Y轴移动，未染色的细胞留在门外(左下四分之 一)。与之对比，HLA-E(2B，2E)导致细胞群沿着X轴移动，未染色细胞留在左下四分之一之 外。两种抗体和HLA-E四聚物不能结合Ba/F3-NKG2D细胞，表明它们在这些测定中特异性 结合 Ba/F3-CD94/NKG2A 细胞上的 CD94/NKG2A。当 Ba/F3_CD94/NKG2A 细胞首先与 HP-3D9 孵育，并且然后与HLA-E四聚物孵育，不能检测到HLA-E四聚物的结合(图2C)。HP-3D9由 此防止了 HLA-E结合CD94/NKG2A，并且这种mAb在NK-细胞毒性测定中的CD94/NKG2A-抑 制性效果因此是防止HLA-E可通过⑶94/NKG2A诱导对细胞毒性淋巴细胞的负信号的结果。 如此，HP-3D9可被认为竞争性CD94/NKG2A拮抗剂。与之相比，当Ba/F3_CD94/NKG2A细胞 首先与Z199孵育，然后与HLA-E四聚物孵育时，Z199和HLA-E四聚物与细胞的结合都可 被检测，如在图2F右上四分之一中双阳性细胞所示。由于Z199不防止HLA-E结合⑶94/ NKG2A，Z199在NK-细胞毒性测定中的⑶94/NKG2A-抑制性效果，例如图1所示，可能不是 防止HLA-E可通过⑶94/NKG2A诱导对细胞毒性淋巴细胞的负信号的效果。如此，Z199可 被认为是非竞争性CD94/NKG2A拮抗剂。图2的观察在BiaCore实验中证实。在这些实验中，scCD94/NKG2A_mFc，由在C-末 端与由CD94和NKG2A的细胞外部分构成的单链构建体融合的鼠IgGl组成的Fc-融合蛋白， 固定在芯片上，并然后用HP-3D9或Z199饱和。接下来，分析HLA-E四聚物与蛋白复合物的 结合。尽管HP-3D9饱和的sc⑶94/NKG2A不能结合HLA-E四聚物，HLA-E四聚物可结合用 Z199饱和的scCD94/NKG2A (图3)。这些结果证实Z199不防止HLA-E结合CD94/NKG2A，和 它功能性阻断CD94/NKG2A的能力是基于非竞争性拮抗。结果HP-3D9 (抗-CD94)(图 1A)，Z199 (抗-NKG2A)(图 1B)和 Z270 (抗-NKG2A)都有 效诱导表达HLA-E的靶细胞被⑶94/NKG2A-限制的淋巴细胞的杀伤。如图2A和2B所示， HP-3D9防止了⑶94/NKG2A和它的配体，HLA-E之间的相互作用，而Z 199不防止这种相互 作用。Z270还防止⑶94/NKG2A和HLA-E之间的相互作用。当细胞与饱和剂量的HLA-E四聚物孵育时，所有测试剂量的humZ199 (从100pg/ml 直至1 μ g/ml)能够结合Ba/F3-⑶94/NKG2A细胞，尽管结合的KD稍微被影响( llog)，其 可能由于由使用的HLA-E复合物的四聚性质引起的一些空间位阻(数据未显示)。Z199和humZ199因此是非竞争性⑶94/NKG2A拮抗剂。尽管不受限于理论，很可 能Z199通过例如，防止或诱导⑶94/NKG2A受体的构象变化，和/或影响⑶94/NKG2A受体的二聚化和/或群集，来干扰⑶94/NKG2A信号传导。实施例2-Z199的人化通过从提取自Z199杂交瘤的mRNA的5，RACE_和RT-PCR克隆获得编码Z199的重 (Z199. H)和轻(Z199. L)链的可变结构域的cDNA。通过从Z199杂交瘤的克隆(5' RACE和RTPCR，NN中国)获得Z199VH(1序列)和 VL(1序列)的序列。Z 199VL caaattgttctcacccagtctccagcactcatgtctgcgtctccaggggagaaggtcaccatgacctgc agtgccagctcaagtgtaagttacatttactggtaccagcagaagccaagatcctcccccaaaccctggatttatctcacatccaa cctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagat gctgccacttattactgccagcagtggagtggtaacccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg(SEQ I D NO 1)翻译序列QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQffSGNPYTFGGGTKLEI KR(SEQ I D NO 2)Z199VH gaagttcaactggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcttgtgca gcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagtctccagagaagaggctggagtgggtcgcagaaattagta gtggtggtagttacacctactatccagacactgtgaccggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgg aaatcagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtacaaggcatggtgactaccctaggttcttcgatgtctggg gcgcagggaccacggtcaccgtctcctca(SEQ I D NO 3)翻译序列EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISSGGSYTYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEISSLRSEDTAMYYCTRHGDYPRFFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO 4)已通过表达验证亲合力。从Z199序列的分析，根据kabat定义的CDR为
权利要求
分离的人或人化抗 NKG2A抗体，其(a)结合在表达CD94/NKG2A的淋巴细胞的表面上表达的人CD94/NKG2A受体的细胞外部分；(b)降低人CD94/NKG2A受体的抑制活性；和(c)不与HLA E竞争与人CD94/NKG2A受体的结合。
2.权利要求1的抗体，其与⑶94/NKG2A结合的KD为与人⑶94/NKG2C的至多1/100。
3.任一项前述权利要求的抗体，其与Z199抗体竞争与人CD94/NKG2A受体的结合。
4.任一项前述权利要求的抗体，其与Z199抗体结合相同的表位。
5.任一项前述权利要求的抗体，其结合包含残基P94-N107，M189-E197，或两者的 NKG2A(SEQ ID NO 11)的区段。
6.任一项前述权利要求的抗体，其结合包含选自NKG2A(SEQIDNO 11)的P94，S95， T96，L97，198，Q99，R100，H 101，L 106，M 189，或 E197，或其任何组合的残基的表位。
7.任一项前述权利要求的抗体，其为人化Z199抗体。
8.权利要求7的抗体，包含Z199可变轻(VL)结构域(SEQID NO 2)的氨基酸残基 Y31, L49，和P94，和Z 199可变重(VH)结构域(SEQID NO 4)的氨基酸残基Y57，Y102，和 P103。
9.权利要求7-8任一项的抗体，包含VL或VH结构域框架序列中的至少一个回复突变。
10.权利要求7-9任一项的抗体，包含Z199VL结构域的氨基酸残基P45。
11.权利要求7-10任一项的抗体，包含Z199VL结构域的氨基酸残基24-33，49-55，和 88-96，和 Z199VH 结构域的氨基酸残基 31-35，50-60，62，64，66，和 99-108。
12.权利要求7-11任一项的抗体，包含Z199VL结构域的残基30和31之间插入的丝氨 酸⑶。
13.分离的抗体，其结合人⑶94/NKG2A受体，并且包含(a)包含SEQ ID NO 5 的 CDR-Ll ；(b)包含SEQ ID NO 6 的 CDR-L2 ；(c)包含SEQ ID NO 7 的 CDR-L3 ；(d)包含SEQ ID NO 8 的 CDR-Hl ；(e)包含SEQ ID NO 9 的 CDR-H2 ； (F)包含 SEQ ID NO 10 的 CDR-H3 ；(g)人VL和VH框架区；和(h)VL结构域中Kabat位点46的脯氨酸(P)残基。
14.权利要求13的抗体，包含人IgG4恒定结构域，任选地包含S241P突变。
15.组合物，包含任一项前述权利要求的抗体和药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
16.权利要求1-14任一项的抗体，用于治疗恶性肿瘤，病毒感染，炎性病症，和/或自身 免疫疾病。
17.用于生产权利要求1-14任一项的抗体的方法，包含在一定条件下培养用一种或更 多种载体转化的宿主细胞，和任选地回收生产的所述抗体，所述载体包含编码所述抗体的 核酸片段，所述条件有利于所述核酸片段的表达。
全文摘要
本发明涉及为CD94/NKG2A受体的非竞争性拮抗剂的试剂，例如某些抗-NKG2A抗体，特别是人化形式的鼠抗-NKG2A抗体Z199，以及生产和使用所述试剂和抗体的方法。
文档编号C07K16/28GK101952317SQ200980102632
公开日2011年1月19日 申请日期2009年1月23日 优先权日2008年1月24日
发明者J·余, J·张, J·陈, P·J·L·斯皮, S·B·帕德克耶尔, S·景 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司