抗树突细胞的人单克隆抗体的制作方法

专利名称：抗树突细胞的人单克隆抗体的制作方法
背景技术：
树突细胞是免疫系统的特化细胞，具有触发原发性和继发性T淋巴细胞和B淋巴细胞反应的独特能力。树突细胞作为专门的抗原递呈细胞(APC)，能表达MHC和致敏原初T淋巴细胞所必需的共同刺激分子。树突细胞的这种独特性质也被称为“自然之佐剂”，使得人们对其在自身免疫病中的可能作用及其在开发针对各种疾病的免疫疗法中的潜力产生了浓厚的兴趣。
树突细胞培养的最新进展已大大地提高了我们对这种复杂类型的细胞的认识。树突细胞有几种类型，可按其谱系、在组织中的位置、表现型和功能进行区分。最显著地与T淋巴细胞相关联以触发免疫应答的树突细胞类型来源于骨髓。骨髓来源的树突细胞可进一步分为1)胸腺树突细胞，来源于淋巴腺组织，似乎特异性地与成熟T淋巴细胞的缺失有关，2)朗罕氏细胞，属骨髓谱系，在皮肤中有特化的APC功能，和3)骨髓谱系来源的树突细胞，尤其出现在血液、脾脏和淋巴结中。
骨髓谱系来源的树突细胞(包括朗罕氏细胞)的标志是1)抗原摄取、加工以供递呈的能力，2)在组织中选择性迁移的能力，和3)直接刺激T淋巴细胞(原初T淋巴细胞和致敏T淋巴细胞)的能力。
尽管在树突细胞的鉴定方面有最新进展，但对树突细胞特异性受体或分子却知之甚少。存在多种与树突细胞有关的分子，它们也为其它骨髓和非骨髓细胞所共用，但树突细胞特异性试剂十分有限。能与树突细胞特异性和优先反应的试剂、尤其是抗体在作为靶向剂以诱导对肿瘤或传染病抗原的有效免疫应答方面具有极大的潜力。这些细胞特异性靶向剂也可进行改造，以传递毒素，从而清除骨髓和器官移植或其它自身免疫病中的强力APC(如树突细胞)。
因此，树突细胞特异性结合剂将具有重大的治疗和诊断价值。
发明概述本发明提供能结合抗原递呈细胞(APC)、特别是人树突细胞的分离的人单克隆抗体，还提供包含这样的抗体的疫苗缀合物、双特异性分子、免疫毒素和治疗性组合物。因此，本发明抗体和组合物能用于多种针对树突细胞的治疗方法，例如以增强抗原递呈或治疗APC介导的疾病。
在某些实施方案中，人抗体的特征在于其与树突细胞的高亲和结合力，以及其通过将具有确定功能的分子或细胞(例如肿瘤细胞、细菌、病毒、效应细胞)导向树突细胞来影响树突细胞的生长和/或功能的能力。因此，本发明人单克隆抗体可用作体内和体外诊断或治疗剂。
在其它实施方案中，人抗体的特征在于其能结合树突细胞上的特定新表位(例如受体)。例如，本发明特异性抗体包括含有SEQ IDNOS2和4分别所示的重链和轻链氨基酸序列的人单克隆抗体B11，其能结合人巨噬细胞甘露糖受体(本文中也称为“人B11抗原”)，用SDS-PAGE测得所述受体分子量约180kD，含有SEQ ID NO7所示的氨基酸序列。本发明的另一个特异性抗体为人单克隆抗体E21，其能与人树突细胞E21抗原结合，用SDS-PAGE测得所述抗原分子量约30-40kD。
本发明分离的人抗体包括多种抗体同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。通常它们包括IgG1(例如IgG1κ)和IgM同种型。抗体可以是全长的(例如IgG1和IgG4抗体)，也可以只包括抗原结合部分(例如Fab、F(ab′)2、Fv和单链Fv片段)。在一个实施方案中，人抗体为重组人抗体。在另一个实施方案中，人抗体由B细胞与无限增殖化细胞融合的杂交瘤产生，所述B细胞从具有含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物如转基因小鼠获得。
本发明的特定人抗体包括由在本发明称为A3、A5、A23、A24、A33、B9、B11、B33、B47、C8、C10、C20、C28、C29、C30、C35、E1、E8、E10、E18、E20、E21、E24、10F7、28-6、24-3、25-14、17-6、19-2和19-4的杂交瘤产生的那些抗体。
在另一个实施方案中，本发明人抗体的特征在于与人树突细胞特异性结合及一个或多个以下性质a)与人树突细胞上的甘露糖受体结合的能力，结合平衡缔合常数(Ka)为至少约107M-1；b)调理人树突细胞的能力；c)与人树突细胞结合后的内化能力；和d)阻断与人树突细胞上的甘露糖受体结合的能力。
因此，本发明的分离人抗体通常与树突细胞结合，结合平衡缔合常数(Ka)为至少约107M-1，优选约108M-1，更优选约109M-1，还优选约1010至1011M-1或更高。
另一方面，本发明提供编码本发明抗体或抗原结合部分的核酸分子。因此，本发明还包括含本发明抗体编码核酸的重组表达载体及这样的载体转染的宿主细胞，本发明还包括通过培养这些宿主细胞制备本发明抗体的方法。
又一个方面，本发明提供来自转基因非人动物如转基因小鼠的分离的B细胞，所述B细胞能够表达特异性结合树突细胞的人单克隆抗体的各种同种型(如IgG、IgA和/或IgM)。优选分离的B细胞得自用纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品免疫的转基因非人动物如转基因小鼠。优选转基因非人动物如转基因小鼠具有包括人重链转基因和人轻链转基因的基因组。然后使分离的B细胞无限增殖化，以提供抗树突细胞人单克隆抗体的来源(如杂交瘤)。
因此，本发明也提供能够产生特异性结合树突细胞的人单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，所述杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，其中B细胞得自非人动物如转基因小鼠，其具有含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。转基因非人动物可用纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品免疫以获得产抗体杂交瘤。本发明的特定杂交瘤包括在此称为A3、A5、A23、A24、A33、B9、B11、B33、B47、C8、C10、C20、C28、C29、C30、C35、E1、E8、E10、E18、E20、E21、E24、10F7、28-6、24-3、25-14、17-6、19-2和19-4的杂交瘤。
又一个方面，本发明提供表达特异性结合树突细胞的人单克隆抗体的转基因非人动物如转基因小鼠(本发明也称为“HuMab”)。在一个特定的实施方案中，所述转基因非人动物为具有包括人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因小鼠。转基因非人动物可用纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品免疫。优选转基因非人动物如转基因小鼠能够通过进行V-D-J重组和同种型转换产生抗树突细胞的人单克隆抗体的多同种型(如IgG、IgA和/或IgM)。同种型转换可通过如经典或非经典同种型转换来进行。
另一方面，本发明提供制备能特异性与树突细胞反应的人单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品免疫具有包括人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因小鼠。然后可得到所述动物的B细胞(如脾B细胞)，将其与骨髓细胞融合以形成无限增殖化的能分泌抗树突细胞的人单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明分离的抗树突细胞的人单克隆抗体或其抗原结合部分可被衍生化或连接到另一个功能分子如另一个肽或蛋白(如另一个抗体、抗体片段、肿瘤配体或抗原)，形成分子缀合物(免疫缀合物)。例如，本发明抗体或抗原结合部分可功能性地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它方法)到一种或多种抗原，例如肿瘤抗原、自体抗原或病原抗原上，从而形成疫苗缀合物，以增强树突细胞介导地免疫应答。本发明人抗树突细胞抗体也可连接到其它治疗剂如细胞毒素药物、具有酶活性的毒素、放射性同位素及小分子，如免疫调节(如抗炎)化合物和抗癌药物。
本发明特定疫苗缀合物包括人抗树突细胞单克隆抗体或其片段与黑素瘤特异性抗原或前列腺癌特异性抗原缀合组成的那些缀合物。包括例如由连接到Pmel17、Gp100、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人抗树突细胞抗体如抗体B11组成的分子缀合物。在实施例6中描述的特定实施方案中，所述缀合物由人抗体B11与Pmel17连接(例如基因融合)组成，如由SEQ ID NO8所示核酸序列编码的MMV4缀合物。本发明也提供包含这样的分子缀合物的治疗性组合物。
因此，在又一个实施方案中，本发明提供将抗原(例如肿瘤抗原，如黑素瘤相关抗原或前列腺相关抗原、微生物抗原或病毒抗原)导向树突细胞(例如这样树突细胞内化、加工并将其表面的抗原递呈给其它免疫细胞以诱导或增强针对抗原的免疫应答)的方法。这可以通过在体外或体内使树突细胞与本发明疫苗缀合物如含上述pmel17、GP100、PSMA或PSA的缀合物接触来实现。另外，抗树突细胞抗体也可在不需要的靶细胞如肿瘤细胞的表面上表达，这样可将所述靶细胞导向树突细胞。
在再一个实施方案中，本发明提供通过给予患者其量足以诱导或增强免疫应答的本发明疫苗缀合物在患者体内诱导或增强针对抗原(如肿瘤细胞抗原、微生物抗原或病毒抗原)的免疫应答的方法。这样的免疫应答包括例如由结合树突细胞递呈的作为MHC-I或MHC-II复合体成分的抗原的T细胞介导的那些免疫应答。因此，本发明进一步提供通过给予患者有效量的上述疫苗缀合物来免疫患者的方法。
本发明进一步提供双特异性和多特异性分子，其包括至少一种本发明人抗树突细胞抗体(或其片段)和针对靶细胞或病原体上的抗原的第二种结合特异性。靶细胞是其消除对宿主有益的细胞，如肿瘤细胞、微生物病原体或病毒或病毒感染细胞。合适的靶抗原包括例如肿瘤相关抗原、病原抗原、自身抗原和Fc受体(如FcγR或FcαR)。
本发明多特异性分子也包括三特异性、四特异性和其它多特异性分子。在一个实施方案中，多特异性分子包括抗增强因子(EF)部分，如结合涉及细胞毒素活性的表面蛋白的分子。
另一方面，本发明提供包括药学上可接受的载体和至少一种结合树突细胞的本发明人单克隆抗体或其抗原结合部分的组合物，如药用组合物或诊断组合物。在一个实施方案中，所述组合物包括各种人抗体或其抗原结合部分的结合，优选每种抗体或其抗原结合部分结合不同的表位。因此，所述结合提供了适于提供最大治疗好处的多重疗法。包括至少一种本发明人单克隆抗体、或双特异性分子、多特异性分子、疫苗缀合物或包括至少一种本发明人单克隆抗体的免疫毒素的组合物如药用组合物与一种或多种其它治疗剂(如细胞毒性剂或细胞因子)一起，也在本发明的范围内。
又一个方面，本发明提供抑制树突细胞的增殖和/或分化的方法，所述方法通过使用本发明抗体或其抗原结合部分(或双特异性或多特异性抗体)，抑制树突细胞的生长和/或诱导对树突细胞的吞噬作用和/或人效应细胞如人多形核细胞(PMN)、单核细胞和巨噬细胞对树突细胞的杀灭作用来实现。在一个实施方案中，所述方法包括在体外或体内在人效应细胞的存在下将树突细胞与一种本发明人单克隆抗体或其抗原结合部分、或多种本发明人单克隆抗体或其抗原结合部分的组合接触。所述方法可用于如体外或来自体内(如包括树突细胞和效应细胞的培养物)的培养。例如，含有树突细胞和效应细胞的样品可在体外培养并与本发明抗体和其抗原结合部分(或本发明双特异性分子或多特异性分子)混合。另外，所述方法可例如作为体内(如治疗性或预防性)方案的一部分在患者身上实施。
对于体内方法，抗体和其抗原结合部分(或本发明双特异性分子或多特异性分子)可给予患有树突细胞介导的疾病的人类患者。这些疾病包括例如自体免疫病、炎症疾病、移植物抗宿主病。可用本发明方法和组合物治疗(如减轻)或预防的示例性自体免疫病包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、重症肌无力、恶性贫血、爱迪生氏病、红斑狼疮、莱特尔综合征和甲状腺机能亢进。
在一个实施方案中，患者另外可用调节(如增强或抑制)Fc受体如Fcγ受体或Fcα受体的表达或活性的药物治疗，例如用细胞因子治疗患者。在用双特异性和多特异性分子治疗过程中优选应用的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-GSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-GSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明分离的人单克隆抗体组合物也可与其它已知疗法如抗炎和免疫抑制疗法或细胞毒素组合施用。
又一个方面，本发明提供在体外或体内检测样品中树突细胞的存在情况以例如诊断树突细胞相关疾病的方法。在一个实施方案中，这通过在可形成抗体和树突细胞复合体的条件下将待测样品和对照样品与本发明人单克隆抗体或其抗原结合部分(或双特异性分子或多特异性分子)接触来实现。然后检测两个样品中的复合体形成(如采用ELISA法)，两个样品之间复合体形成的任何统计学显著差异都表示测试样品中存在树突细胞。本发明的其它特点和优点将清楚明白地见于以下详细说明和权利要求。
附图简述

图1表示用流式细胞计量术评定的人单克隆抗体B11、C20和E21与树突细胞和造血细胞系U937、CEM、THP-1和L540的反应性。结合程度通过平均荧光强度测定。
图2表示用流式细胞计量术评定的人单克隆抗体B11、C20和E21与树突细胞的剂量依赖性结合。结合程度通过平均荧光强度测定。
图3表示用流式细胞计量术评定的人单克隆抗体B11与CD34+干细胞衍化树突细胞的剂量依赖性反应性。结合程度通过平均荧光强度测定。
图4表示用流式细胞计量术评定的人单克隆抗体B11与树突细胞和巨噬细胞的结合。
图5表示用流式细胞计量术评定的人单克隆抗体B11与被诱导分化成树突细胞表现型的THP-1的结合。
图6表示用流式细胞计量术评定的人单克隆抗体B11与短尾猴树突细胞的结合。结合程度通过平均荧光强度测定。
图7表示37℃下随着时间推移人单克隆抗体B11被树突细胞内化的百分比。
图8表示通过刺激破伤风类毒素特异性T细胞测得的通过抗体B11增加的抗原递呈(与单独抗原比较)。
图9表示通过将人单克隆抗体B11的VL(SEQ ID NO1和2)结构域和VH(SEQ ID NO3和4)结构域连接构建的B11 ScFv构建物。
图10表示用FACS分析测得的完整的人单克隆抗体B11和B11的F(ab′)2片段之间与树突细胞结合的比较。
图11表示树突细胞进行的FITC右旋糖苷内化百分比。
图12表示抗原与B11缀合增强了抗原递呈，因为与单独的破伤风类毒素相比，达到同等水平的T细胞刺激作用所需的与抗体B11缀合的破伤风类毒素的量可减少10倍至100倍。
图13表示抗体B11的可变轻链(VL)和可变重链(VL)的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。
图14表示编码包含与Pmel-17抗原连接的抗体B11的融合蛋白(分子缀合物)的质粒MMV4(SEQ ID NO8)图谱。
图15表示用流式细胞计量术评定的B11-Pmel-17分子缀合物与树突细胞的结合。结合程度用山羊抗人IgG(Fc特异性)检测。
图16表示用流式细胞计量术评定的B11-Pmel-17分子缀合物与树突细胞的结合。结合程度用兔抗Pmel-17血清检测，然后用山羊抗兔IgG检测。
发明详述本发明提供新型的基于抗体的疗法，以调节针对抗原的免疫应答及治疗和诊断疾病，包括树突细胞介导的疾病。
本发明疗法应用能结合抗原递呈细胞(APC)、尤其是树突细胞及其相关细胞上的表位的分离的人单克隆抗体和其抗原结合部分。尽管人抗体可用多种已知技术生产，本发明第一次例示了所述人抗体在非人转基因动物如转基因小鼠中的生产。所述转基因动物通过进行V-D-J重组和同种型转换能够生产人抗树突细胞单克隆抗体的多种同种型(如IgG、IgA和/或IgE)。因此，本发明的各个方面包括人抗体、抗体片段、抗体模拟物、双特异性和多特异性分子、疫苗缀合物、免疫毒素及其药用组合物，以及非人转基因动物及制备这样的单克隆抗体的B细胞和杂交瘤。使用本发明抗体在体外或体内检测树突细胞或能表达树突细胞抗原的相关细胞类型、或抑制树突细胞的生长、分化和/或活性的方法也包括在本发明中。
为使本发明更加容易理解，首先定义一些术语。另外的定义在本发明详细说明的全文中提到。
本文所用的术语“树突细胞”，包括未成熟和成熟树突细胞及能分化成树突细胞的相关骨髓祖细胞，或能表达树突细胞性抗原的相关抗原递呈细胞(如单核细胞和巨噬细胞)。本文所用的术语“相关”包括衍生自共同祖细胞或细胞谱系的细胞。在优选的实施方案中，本发明抗体与树突细胞的结合抑制树突细胞的生长。在另一个优选实施方案中，本发明抗体与树突细胞的结合通过将具有确定功能的分子或细胞(如肿瘤细胞、效应细胞、微生物病原体)导向树突细胞来介导对树突细胞生长和/或功能的效应。在进一步的实施方案中，本发明抗体与树突细胞的结合导致抗体被树突细胞内化。
本文所用的术语“抗体”是指包括由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。各重链由重链可变区(本文简写成HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链可变区(本文简写成LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步被细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布有称为框架区(FR)的更保守的区段。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合宿主组织或各种因子，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一个成分(Clq)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(简称“抗体部分”)是指保留特异性地结合抗原(如树突细胞上的抗原)的能力的抗体的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”所包括的结合片段的例子包括(i)Fab片段，这是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，这是包括由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然FV片段的两个结构域VL和VH由不同基因编码，但可使用重组方法通过合成接头将它们接合在一起，使它们被制成其中VL和VH区段配对形成单价分子的单条蛋白链(称为单链FV(scFv)；参见如Bird等(1988)Science242423-425；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。这样的单链抗体也有意包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可采用本领域技术人员公知的常规技术获得，且可采用与完整抗体一样的方式筛选这些片段的效用。
术语“双特异性分子”有意包括具有能与例如(a)树突细胞和(b)效应细胞表面上的Fc受体结合或相互作用的两个不同的结合特异性的任何物质，如蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合体。在另一个实施方案中，本发明双特异性分子具有能与(a)树突细胞和(b)靶细胞(如肿瘤细胞)上的抗原结合或相互作用的两个不同的结合特异性。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”有意包括具有能与例如(a)附突细胞、(b)效应细胞上的Fc受体和(c)至少一个其它成分结合或相互作用的两个以上的不同的结合特异性的任何物质，如蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合体。因此，本发明包括但不限于针对细胞表面抗原如树突细胞抗原和针对效应细胞上的Fc受体或靶细胞(如肿瘤细胞)上的抗原的双特异性分子、三特异性分子、四特异性分子和其它多特异性分子。术语“双特异性抗体”进一步包括双特异性抗体。双特异性抗体是其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达的二价双特异性抗体，但其表达采用短得不足以容可同一条链上的两个结构域之间进行配对的接头，从而迫使所述两个结构域与另一条链的互补结构域配对并造成两个抗原结合部位(参见例如Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；R.J.等(1994)Structure21121-1123)。
本文所用的术语“多特异性抗体”是指连在一起的两个和多个抗体、抗体结合片段(如Fab)及其衍生物或抗原结合区，其中至少有两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对树突细胞的结合特异性和对效应细胞上的Fc受体或靶细胞如肿瘤细胞上的抗原或表位的结合特异性。
本文所用的术语“人抗体”有意包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外随机诱变和位点特异性诱变或体内体细胞突变所引入的突变)。但是，本文所用的术语“人抗体”不包括其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移殖入人框架序列的抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一抗体分子组成的制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性、具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由包括来自转基因非人动物如转基因小鼠的B细胞与无限增殖化细胞融合的杂交瘤产生，所述转基因动物具有包括人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文所用的术语“重组人抗体”有意包括通过重组手段制备、表达、构建或分离的所有人抗体，如从转有人免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)分离的抗体(在以下第I节中进一步描述)；用重组表达载体转染到宿主细胞表达的抗体、从重组组合人抗体文库分离的抗体或通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、构建或分离的抗体。这样的重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是在某些实施方案中，这样的重组人抗体经受体外诱变(或当使用转有人Ig序列的动物时，体内发生体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽然衍生自人种系VH和VL序列并与其有关，但可能不属于体内人抗体种系存在成分。
本文所用的“异源抗体”的定义关系到产生这种抗体的转基因非人生物体。该术语是指这样的抗体，所述抗体具有的氨基酸序列或编码核酸序列与在转基因非人动物以外的生物体中存在的序列相对应，而且通常所述序列来自转基因非人动物物种以外的物种。
本文所用的“异源杂种抗体”是指具有来源于不同生物体的轻链和重链的抗体。例如，同时具有人重链和鼠轻链的抗体即是异源杂种抗体。如前所述，异源杂种抗体的例子包括嵌合抗体和人源化抗体。
本文所用的“分离(的)抗体”意指基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如，特异性结合树突细胞和相关骨髓来源的抗原递呈细胞(如单核细胞和巨噬细胞)且基本上不含特异性结合树突细胞之外的细胞类型的抗体的分离抗体)。但是，特异性结合树突细胞的分离抗体对其它细胞(例如能表达与树突细胞上的关联抗原相关的抗原的细胞类型)具有交叉反应性。此外，分离抗体可实质上无其它细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，具有不同特异性的“分离”单克隆抗体的组合物为组成明确的组合物。
本文所用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指抗体结合预定的抗原或细胞类型的特异性。“特异性地结合”或“特异性地针对”特定抗原或细胞类型的抗体能相对于其它抗原和细胞类型有选择性地结合抗原或细胞类型。虽然本发明的每一种抗体特异性结合特定靶表位(例如树突细胞表面上的表位)，但在某些实施方案中，本发明的特异性抗体可表现出与其APC的交叉反应性。在其它的实施方案中，特异性抗体只与树突细胞反应。通常，抗体以至少约1×107M-1的亲和力结合，其与预定抗原结合的亲和力比其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)结合的亲和力至少高两倍。词组“识别抗原的抗体”和“特异性地针对抗原的抗体”在本文中可与术语“特异性地结合抗原的抗体”互换使用。
本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指结合亲和力至少约107M-1，优选至少约109M-1，更优选至少约1010M-1、1011M-1、1012M-1或更高，例如高达1013M-1或更高。但是，对于其它抗体同种型，“高亲和力”结合可能会变化。例如，对于IgM同种型，“高亲和力”结合是指结合亲和力至少为约1×107M-1。
本文所用的术语“K缔合”意指特定抗体-抗原相互作用的缔合常数。
本文所用的术语“K解离”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
本文所用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如IgM或IgG1)。
本文所用的“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别变成另一种其它的Ig类别的现象。
本文所用的“非转换同种型”是指没有发生同种型转换时产生的重链同种型类别；编码非转换同种型的CH基因通常是紧接在功能性重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换分为典型或非典型同种型转换。典型同种型转换通过重组活动进行，所述重组活动涉及转基因中至少一个转换序列区。非典型同种型转换可通过例如人σμ和人∑μ(δ-相关性缺失)之间的同源重组进行。另外的非典型转换机制，其中如转基因间和/或染色体间重组可进行并实现同种型转换。
本文所用的术语“转换序列”是指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序列，通常为□转换区，在转换重组过程中待缺失的构建物区的5′方向(即上游)。“转换接纳体”区在待缺失构建物区和置换恒定区(如γ、ε等)之间。由于没有其中重组经常发生的特异性位点，最终基因序列通常不能从构建物预测到。
本文所用的“糖基化模式”定义为碳水化合物单位共价连接到蛋白质、更具体而言连接到免疫球蛋白的模式。异源抗体的糖基化模式的特征实质上与在非人转基因动物物种产生的抗体上天然存在的糖基化模式类似，同时本领域一般技术人员知道，异源抗体的糖基化模式与衍生自转基因的CH基因的物种的糖基化模式相比，更类似于非人转基因动物物种中的所述糖基化模式。
本文所用的应用于某个对象的术语“天然存在(的)”，是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如，存在于可从自然界分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
本文所用的术语“重排(的)”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段以基本上分别编码完整VH或VL结构域的构象直接位于D-J或J区段邻近。重排免疫球蛋白的基因座可通过与种系DNA比较来鉴别；重排基因座具有至少一种重组的七聚体/九聚体同源性成分。
本文所用的涉及V区段的术语“非重排(的)”或“种系构型”是指这样的构型，其中V区段不被重组以直接邻近D或J区段。
本文所用的术语“核酸分子”意指包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链DNA也可以是双链DNA，但优选双链DNA。
本文所用的涉及编码能结合树突细胞的抗体或抗体部分(如VH、VL、CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”意指这样的核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含其它核苷酸序列，所述其它核苷酸序列编码能结合除树突细胞外的细胞的抗体或抗体部分，且天然位于人基因组DNA中核酸的旁侧。
对于核酸，术语“基本同源性”表示两种核酸或其指定序列当以最佳方式进行序列对比和比较时，虽发现有适当的核苷酸插入或缺失，但至少有约80％的核苷酸是相同的，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的核苷酸是相同的。另外，当区段在选择性杂交条件下与核酸链的互补体杂交时，也存在基本同源性。
两个序列之间的百分相同性是它们共有的相同位置数目的函数(即％同源性＝相同位置数目/总位置数目×100)，其中考虑了缺口的数目及各缺口的长度，为达到两个序列的最佳对比是需要引入所述缺口的。两条序列之间的序列比较和百分相同性确定可用数学算法实现，这在以下非限制性实施例中有描述。
两个核苷酸序列之间的百分相同性可应用GCG软件包(可从http//www.gcg.com获得)的GAP程序，采用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列的百分相同性也可应用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))的算法(所述算法已合并到ALIGN程序中(版本2.0))，采用PAM120加权残基表、缺口长度罚分12及缺口罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分同源性可应用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法(已合并到GCG软件包(可从http//www.gcg.com获得)的GAP程序)，采用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。
本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作“询问序列”，对公共数据库进行搜索，以例如鉴别相关序列。这样的搜索可用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来进行。可用NBLAST程序(计分＝100、字节长度＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序(计分＝50、字节长度＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。可如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中所描述应用缺口BLAST，获得缺口对比结果。当应用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序的默认参数(如XBLAST和NBLAST)。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物中，或为部分纯化或实质上纯净的形式。当采用标准技术将核酸从其它细胞成分或其它污染物，如其它细胞核酸或蛋白质中纯化出来时，所述核酸即是“分离的”或“变得实质上是纯净的”，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域公知技术。参见F.Ausubel等编辑Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
本发明核酸组合物，虽然经常为cDNA、基因组或其混合物的天然序列(修饰的限制位点等除外)，但可按照标准技术进行突变，以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可按需影响氨基酸序列。尤其，设想了获得实质上同源于或衍生自本文所述天然V、D、J、恒定区、转换区和其它类似序列的DNA序列(其中“衍生自”表示某序列与另一序列相同或从后者修饰得到)。
术语“有效连接”意指分子功能性地互相偶合在一起，这样一个分子的活性或状态的变化受到其它分子的活性或状态的影响。当使一核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，所述核酸即是“有效连接”的。例如启动子或增强子如果能影响序列的转录，即是“有效连接”到编码序列。对于转录调节序列，有效连接指被连接DNA序列是毗邻的，且当需要连接两个蛋白质编码区时，所述DNA序列是毗邻的并位于读框中。对于转换序列，有效连接表示序列能够实现转换重组。通常，两个有效连接在一起的多肽通过肽键共价连接。
本文所用术语“载体”意指能够转运其连接的另一种核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，它指环状双链DNA环，另一DNA区段可连接到其上。另一种载体是病毒载体，其中另一DNA区段可连接到病毒基团组。某些载体能够在其引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这样的载体在本发明称为“重组表达载体”(简称“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒的形式出现。在本说明书中，“质粒”和“载体”互换使用，因为质粒时最常用的载体形式。但是，本发明有意包括能提供等同功能的其它类型的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本文所用术语“重组宿主细胞”(“简称”宿主细胞“)意指其中引入了重组表达载体的细胞。应该理解，这样的术语不但意指特定细胞，也指这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在以后各代中可能发生某些修饰作用，这样的后代可能实际上与亲代细胞不相同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
本发明的各个方面在以下各部分中进行进一步的详细描述。
I.抗树突细胞人抗体的制备虽然本文描述了生产本发明人单克隆抗体(mAb)特别优选的方法，但也可使用多种其它方法，包括常规单克隆抗体方法，如Kohler和Milstein，Nature256495(1975)的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交程序，但也可应用其它生产单克隆抗体的技术，如B淋巴细胞的病毒转化或癌性转化。
优选的制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。用鼠系统生产杂交瘤是一种成熟的程序。分离用以融合的免疫脾细胞的免疫方案和技术为本领域所公知。融合伙伴(如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也为人们所熟知。
在优选的实施方案中，针对树突细胞的人单克隆抗体可使用携带部分人免疫系统的转基因小鼠而不是小鼠系统来生产。这些转基因小鼠在本文称为“HuMAb”小鼠，含有编码非重排人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白微小基因座，以及使内源μ链基因座和κ链基因座失活的定向突变(Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474)856-859)。因此，所述小鼠表达小鼠IgM或κ减少，免疫应答时，其中引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞变异，以产生高亲和性人IgGκ单克隆。(Lonberg，N.等，文献同上；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 11349-101中综述；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immuno.Vol.1365-93，及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764536-546)。HuMab小鼠的培育在本文以下第二节及以下文献中详细描述Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonberg等(1994)Nature 368(6474)856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 11349-101；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y Acad.Sci 764536-546；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851，上述所有文献的内容通过引用全部结合到本文中。进一步参看美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号和第5,770,429号；以上专利均属于Lonberg和Kay及GenPharmInternational；Surani等的美国专利第5,545,807号；国际公开号WO98/24884(1998年6月11日公开)；WO 94/25585(1994年11月10日公开)；WO 93/1227(1993年6月24日公开)；WO 92/22645(1992年12日23日公开)；WO 92/03918(1992年3月19日公开)，上述所有专利的公开内容通过引用全部结合到本文中。
HuMab免疫为产生抗树突细胞的完全人单克隆抗体，HuMab小鼠可用纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品免疫，如Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14845-851和WO98/24884所述。优选小鼠第一次免疫时鼠龄在6-16个星期。例如纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品(一百万至一千万个细胞)可用以从腹膜内免疫HuMab小鼠。如果用纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品免疫不能导致抗体产生，也可用树突细胞裂解物免疫小鼠，以促进免疫应答。
关于各种抗原的累积经验表明，当HuMAb转基因小鼠初次用抗原配以弗氏完全佐剂从腹膜内(IP)免疫，然后每两星期用抗原配以弗氏不完全佐剂进行IP免疫(共6次)时，应答效果最佳。免疫应答可在免疫方案过程中用通过眶后取血获得的血浆样品进行监测。血浆可例如用ELISA或流式细胞术(如下所描述)进行筛选，具有足够滴度的抗树突细胞人免疫球蛋白的小鼠可用于融合目的。小鼠在处死并摘出脾脏前3天用抗原经静脉进行刺激。据认为，对于每种抗原，可能需要进行2至3次融合。用每种抗原免疫几只小鼠。例如，共有12只HC07和HC012系HuMAb小鼠被免疫。
产抗树突细胞人单克隆抗体的杂交瘤的生产小鼠脾细胞可按照标准方案分离并用PEG与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后筛选所得杂交瘤，找出产抗原特异性抗体的杂交瘤。例如，采用50％PEG，将免疫小鼠脾脏淋巴细胞的单细胞悬浮液融合到六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)。细胞以约2×105的浓度加入平底微量滴定板中，然后在选择性培养基中温育两个星期，所述培养基含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mML～谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5Mm HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1XHAT(Sigma；HAT在融合后24小时加入)。两个星期后，细胞在其中HAT用HT代替的培养基中培养。然后通过ELISA筛选板上各个孔，找出抗树突细胞人单克隆IgM和IgG抗体。一旦出现杂交瘤大量生长的情况，通常在10至14天后就观察培养基。再次接种和筛选抗体分泌杂交瘤，如果人IgG抗树突细胞单克隆抗体仍为阳性，杂交瘤可通过有限稀释亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆进行体外培养，在组织培养基中产生少量抗体以供鉴定。
人单克隆抗体结合树突细胞的鉴定为鉴定本发明人单克隆树突细胞抗体的结合，可例如通过流式细胞术筛选杂交瘤，找出与树突细胞的阳性反应。
简而言之，收集树突细胞并洗涤，然后加入96孔板，在4℃下与杂交瘤上清液稀释液(或者含0.1％Tween 80和20％小鼠血清的单克隆抗体PBS液)温育1小时。然后将板洗涤，并进一步在4℃下与第二抗体(如FITC或PE标记的抗人IgG)温育1小时。细胞洗涤后，用1％多聚甲醛固定，然后分析。样品可通过FACScan仪器，利用对单个细胞闸门的光及侧散射特性进行分析。除流式细胞术试验法外，也可使用另一采用荧光显微术的试验法，或该法可替代流式细胞术试验法。细胞恰好如上所描述那样染色，并通过荧光显微术检测。用这个方法可看见单个细胞，但取决于抗原的密度，灵敏度可能降低。
将与树突细胞高亲合力结合的杂交瘤进行亚克隆并进一步鉴定。可从每个杂交瘤中选出一个保留亲代细胞反应性(由流式细胞术测定)的克隆，以制成5至10小管细胞库保藏于-140℃，以及用于抗体纯化目的。
为纯化人抗树突细胞抗体，选出的单克隆可在两升旋动烧瓶中生长，以供单克隆抗体纯化。在用蛋白质A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和色谱前，可将上清液过滤并浓缩。洗脱的IgG可用凝胶电泳和高效液相色谱检测，以确保纯度。缓冲溶液可换成PBS，而浓度可用1.43消光系数通过OD280确定。可将单克隆抗体等分并保藏于-80℃。
为确证选出的人抗树突细胞单克隆抗体是否结合到单一表位，各抗体可用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)进行生物素酰化。可用如上所描述的流式细胞术，使用未标记的单克隆抗体和生物素酰化的单克隆抗体进行竞争性研究。可用链霉亲和素碱性磷酸酶探针检测生物素酰化的单克隆抗体。
为确定纯化抗体的同种型，可进行同种型ELISA。微量滴定板孔可在4℃下包被10μg/ml抗人Ig过夜。所述板用5％BSA封闭后，在环境温度下与10μg/ml单克隆抗体或纯化同种型对照反应两小时。然后板孔可与缀合人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶的探针反应。所述板洗涤后，用pNPP底物(1mg/ml)显色，在OD值405-650下分析。
可通过蛋白质印迹法，进一步测试抗树突细胞人IgG与树突细胞的反应性。概括地讲，可制备树突细胞的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，分离的抗原被转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，并用待测单克隆抗体探测。人IgG的结合可用抗人IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)显色。
抗树突细胞人单克隆抗体的吞噬和细胞杀灭活性除可检测人单克隆抗树突细胞抗体与树突细胞的特异性结合外，还可以检测其介导吞噬和杀灭树突细胞的能力。单克隆抗体活性的体外检测可在体内模型检测前提供初始筛选。概括地讲，来自健康供体的多形核细胞(PMN)或其它效应细胞可通过Ficoll Hypaque密度离心法纯化，然后裂解污染性红血细胞。洗涤后的PMN可悬浮于补充10％热灭活胎牛血清的RPMI，并与51Cr标记的树突细胞以不同效应细胞对树突细胞的比例(效应细胞树突细胞)进行混合。然后可加入不同浓度的纯化人抗树突细胞IgG。非相关人IgG可用作阴性对照。试验可在37℃下进行0至120分钟。通过测量培养物上清液中51Cr释放量，可分析样品的细胞裂解情况。抗树突细胞单克隆也可互相组合进行试验，以确定用多种单克隆抗体是否可提高细胞裂解程度。
结合树突细胞的人单克隆抗体也可在体内模型中(如在小鼠中)进行试验，以确定其介导吞噬和杀灭树突细胞的效力。这些抗体可例如按照以下标准进行选择，所述标准并是唯一的。
1.)与活树突细胞的结合；
2.)与树突细胞结合的高亲和力；3.)与树突细胞上单一表位的结合(以排除这样的可能性，即具有互补活性的单克隆抗体组合使用时会竞争结合到同一表位)；4.)树突细胞的调理作用；5.)在人效应细胞存在下介导对树突细胞的生长抑制、吞噬作用和/或杀灭；6.)结合到树突细胞后的内化；7.)与树突细胞的原位结合(例如在人组织中)；8.)树突细胞的活化(例如诱导细胞因子释放、免疫调节表面分子的表达(例如CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40和CD54(ICAM))；9.)与树突细胞上人甘露糖受体的结合；和10.)与灵长类动物中保守的树突细胞抗原的结合。
本发明优选的人单克隆抗体符合这些标准中的一个或多个，优选符合全部标准。在特定实施方案中，人单克隆抗体可组合使用，例如作为包括两种或多种抗树突细胞单克隆抗体或其片段的药用组合物。例如，具有不同但互补的活性的人抗树突细胞单克隆抗体可组合到单一疗法中，以达到所需的治疗或诊断效果。这方面的一个例证是这样的一种组合物，其含有能被树突状细胞迅速内化的抗树突细胞人单克隆抗体，所述抗体与另一种能诱导树突细胞的抗原递呈细胞活性(如释放免疫刺激细胞因子)的人抗树突细胞单克隆抗体组合。
II.产生人单克隆抗树突细胞抗体的转基因非人动物的培育本发明又一方面提供转基因非人动物，如转基因小鼠，所述转基因非人动物能够表达能特异性结合树突细胞(优选以高亲和力结合)的人单克隆抗体。在优选的实施方案中，转基因非人动物如转基因小鼠(HuMab小鼠)具有包括人重链转基因和轻链转基因的基因组。在一个实施方案中，转基因非人动物如转基因小鼠用纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品和/或树突细胞裂解物免疫。优选转基因非人动物如转基因小鼠通过进行V-D-J重组和同种型转换，能够产生抗树突细胞人单克隆抗体的多种同种型(如IgG、IgA和/或IgE)。同种型转换可通过如典型或非典型同种型转换进行。
要设计能用异源抗体库对外来抗原刺激作出应答的转基因非人动物，需要转基因动物中含有的异源免疫球蛋白转基因在B细胞发育的途径中正确地发挥其功能。在优选的实施方案中，异源重链转基因的正确功能包括同种型转换。因此，这样构建本发明转基因，以产生同种型转换及一种或多种下列功能(1)高水平及细胞类型特异性表达，(2)功能性基因重排，(3)活化和应答等位基因排斥，(4)足够的初级库的表达，(5)信号转导，(6)体细胞高突变，和(7)免疫应答过程中转基因抗体基因座的支配作用。
不需要符合以上所有标准。例如，在其中转基因动物的内源免疫球蛋白基因座被功能性地破坏的那些实施方案中，转基因不需要激活等位基因排斥。此外，在其中转基因包括功能性重排重链和/或轻链免疫球蛋白基因的那些实施方案中，第二个标准即功能性基因重排是不需要的，至少对已重排的那个转基因是不需要的。有关分子免疫学的背景知识参看Fundamental Immunology，第二版，(1989)，Paul William E.编辑Raven Press，N.Y.，其内容通过引用结合到本文中。
在某些实施方案中，用以产生本发明人单克隆抗体的转基因非人动物在其种系中含有重排、非重排异源免疫球蛋白重链和轻链转基因，或既含有重排又含有非重排异源免疫球蛋白重链和轻链转基因。各重链转基因包括至少一个CH基因。此外，重链转基因可含有功能性同种型转换序列，其能够支持编码转基因动物B细胞中多种CH基因的异源转基因的同种型转换。这样的转换序列可以是天然存在于作为转基因CH基因来源的物种的种系免疫球蛋白基因座中的那些序列，或这样的转换序列可衍生自存在于接受转基因构建物的物种(转基因动物)的那些转换序列。例如，用以生产转基因小鼠的人转基因构建物，如果它加入了与天然存在于小鼠重链基因座的那些转换序列相类似的转换序列，可发生更高频率的同种型转换事件，因为据推测，小鼠转换序列可被优化以与小鼠转换重组酶系统一起发挥其功能，而人转换序列却不能这样。转换序列可用常规克隆方法分离并克隆，或可从重叠合成寡核苷酸从头合成。所述重叠合成寡核苷酸可在有关免疫球蛋白转换区序列的公开序列信息的基础上加以设计(Mills等，Nucl.Acids Res.157305-7316(1991)；Sideras等，Intl.Immunol.1631-642(1989)，其通过引用结合到本文中)。对于上述各转基因动物，功能性重排异源重链和轻链免疫球蛋白转基因可见于很大一部分的转基因动物B细胞(至少百分之十)。
用以产生本发明转基因动物的转基因包括一个这样的重链转基因，其包含编码至少一个V基因区段、一个D基因区段、一个J基因区段和至少一个C区基因区段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因包含编码至少一个V基因区段、一个J基因区段和至少一个C区基因区段的DNA。编码轻链和重链基因区段的基因区段异源于转基因非人动物，因为它们衍生自或对应于来自转基因非人动物之外的物种的编码免疫球蛋白重链和轻链基因区段的DNA。在本发明的一个方面，转基因这样构建，使得各个基因区段是非重排的，即不进行重排以编码功能性免疫球蛋白轻链或重链。这样的非重排转基因支持V、D和J基因区段的重组(功能性重排)，并优选支持当接触树突细胞时，在转基因非人动物中产生的重排免疫球蛋白重链中加入整个D区基因区段或部分D区基因区段。
在替代实施方案中，转基因包括非重排“小基因座”。这样的转基因通常包括相当部分的C、D和J区段以及V基因区段的亚组。在这样的转基因构建物中，各种调节序列，如启动子、增强子、类别转换区、RNA加工的剪接供体和剪接受体序列、重组信号等，包括来源于异源DNA的相应序列。这样的调节序列可被掺入到来自与本发明非人转基因动物相同或相关物种的转基因中。例如，人免疫球蛋白基因区段可结合于携带啮齿动物免疫球蛋白增强子序列的转基因，以用于转基因小鼠。另外，合成调节序列可掺入到转基因，其中这样的合成调节序列与已知天然存在于哺乳动物基因组的功能性DNA序列不同源。合成调节序列可按照普遍的规则进行设计，例如规定剪接受体位点或启动子/增强子基序的允许序列。例如，小基因座包括基因组免疫球蛋白基因座的一部分，所述基因座与天然存在的种系Ig基因座相比，具有至少一个非必需DNA部分(如间插序列、内含子或其部分)的内部(即不在部分末端)缺失。
在本发明优选实施方案中，用以生产抗树突细胞人抗体的转基因动物含有至少一个、通常为2至10个、有时为25至50个或更多的在WO 98/24884的实施例12中描述的转基因(如pHC1或pHC2)拷贝，所述转基因动物是用含有一个拷贝轻链转基因(WO98/24884实施例5、6、8或14介绍的转基因)的动物配种获得的，子代是WO98/24884实施例10介绍的JH缺失动物配适种获得的，所述专利的内容通过引用特意结合到本文中。动物配种使得上述三种性状均为纯合型。这样的动物具有以下表现型人重链非重排小基因座的单拷贝(每个半倍体染色体组)(WO 98/24884的实施例12中描述)、重排人K轻链构建物的单拷贝(每个半倍体染色体组)(WO 98/24884的实施例14中描述)及各内源小鼠重链基因座中去除所有功能性JH区段的缺失(WO 98/24884的实施例10中描述)。将这样的动物与所述JH区段的缺失纯合小鼠配种(WO 98/24884的实施例10)，以产生JH缺失纯合、人重链构建物和轻链构建物半合后代。所得动物用抗原注射，并用以生产抗这些抗原的人单克隆抗体。
从这种动物分离的B细胞对于人重链和轻链是单特异性的，因为它们只含有单拷贝的各个基因。此外，它们对于人或小鼠重链将是单特异性的，因为由于引入的跨越JH区的缺失(如WO 98/24884的实施例9和12所描述)，内源小鼠重链基因的两份拷贝都是非功能性的。此外，相当部分的B细胞对于人或小鼠轻链将是单特异性的，因为重排人κ轻链基因的单拷贝表达会以等位的方式和同种型的方式排除很大部分的B细胞中内源小鼠κ和λ链基因的重排。
优选实施方案中的转基因小鼠会产生相当数量的所有组成成分免疫球蛋白，理想情况下实质上与天然小鼠类似。因此，例如在其中内源Ig基因已失活的实施方案中，总免疫球蛋白水平占血清的约0.1-10mg/ml、优选0.5-5mg/ml、理想情况下至少约1.0mg/ml。当能够实现从IgM向IgG转换的转基因已被引入转基因小鼠时，成体小鼠中血清IgG与IgM之比优选为约10∶1。IgG与IgM之比在非成熟小鼠中会很低。一般来说，高于约10％、优选高于40％至80％的脾脏和淋巴结B细胞专门表达人IgG蛋白质。
所述所有组成成分理想情况下接近非转基因小鼠中出现的所有组成成分，通常至少约占10％，优选占25至50％或更高。一般而言，至少生产出约1千个不同免疫球蛋白(理想情况下是IgG)，优选104至106个或更多的免疫球蛋白，这主要取决于引入到小鼠基因组的不同V、J、和D区的数量。这些免疫球蛋白通常能识别约一半和更多的高度抗原性蛋白质，如树突细胞蛋白质。通常，免疫球蛋白对预先选择的抗原的亲和力至少约107M-1、优选至少约109M-1、更优选至少约1010M-1、1011M-1、1012M-1或更高，例如高达1013M-1或更高。
在一些实施方案中，优选产生具有预先确定的所有组成成分的小鼠，以限制体现在抗体对预定抗原类型应答中的V基因的选择。具有预先确定的所有组成成分的重链转基因可包括例如人VH基因，所述人VH基因优选用于抗体对人体中预定抗原类型的应答。另外，由于多种原因，一些VH基因被排除在确定的所有组成成分之外(例如，编码针对预定抗原的高亲和力V区的可能性小；进行体细胞突变和亲和力强化(sharpening)的倾向低；或对一些人来说是免疫源性的)。因此，在含有各种重链或轻链基因区段的转基因重排之前，可例如通过杂交或DNA测序容易地鉴别出，这样的基因区段是来自转基因动物之外的某生物物种的。
本发明转基因小鼠如上所述用纯化树突细胞制品或富集树突细胞制品和/或树突细胞裂解物免疫。所述小鼠能产生B细胞，后者通过转基因内转换重组(顺式转换)进行类别转换，并表达能与树突细胞反应的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中重链和轻链多肽由人转基因序列编码，所述人转基因序列可包括衍生自体细胞突变和V区重组的序列以及种系编码性序列；这些人序列免疫球蛋白可称作实质上等同于人VL或VH基因区段和人JL和JL区段编码的多肽序列，即使其它非种系序列可由于体细胞突变和差别V-J和V-D-J重组连接而存在。对于这些人序列抗体，各链的可变区通常至少有80％由人种系V、J基因区段编码，在重链情况下由D基因区段编码；常常至少有85％的可变区由存在于转基因的人种系序列编码；经常有90％或95％或更多的可变区序列由存在于转基因的人种系序列编码。但是，因为非种系序列通过体细胞突变及VJ和VDJ连接引入，人序列抗体常常具有一些不是由在小鼠种系的人转基因中存在的人V、D、或J基因区段编码的可变区序列(有时也有恒定区序列)。通常，这样的非种系序列(或单个核苷酸位置)在CDR中或其附近群集，或在其中已知体细胞突变群集的区域群集。
结合预定抗原的人序列抗体可从同种型转换获得，这样包含人序列γ链(例如γ1、γ2a、γ2B或γ3)和人序列轻链(例如K)得以产生。这样的同种型转换的人序列抗体通常在可变区和经常在CDR)或其附近10个残基内经常含有一种或多种体细胞突变，所述突变由于亲和力成熟和抗原对B细胞的选择而发生，尤其在第二(或后续)抗原攻击后发生。这些高亲和力人序列抗体的结合亲和力至少为1×109M-1、通常至少5×109M-1、常常高于1×1010M-1、有时为5×1010M-1至1×1011M-1或更高。
本发明的另一方面涉及来自这样的小鼠的B细胞，所述小鼠可用于产生表达能以高亲和力(例如高于2×109M-1)结合树突细胞的人单克隆抗体的杂交瘤。因此，在本发明的另一个实施方案，这些杂交瘤可用以生产包括免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白结合树突细胞的亲和常数(Ka)至少为2×109M-1，它们包括以下组成的人序列轻链(1)具有实质上与人VL基因区段和人JL区段编码的多肽序列等同的多肽序列的轻链可变区，和(2)具有实质上与人CL基因区段编码的多肽序列等同的多肽序列的轻链恒定区；以下组成的人序列重链(1)具有实质上与人VH基因区段(任选D区)和人JH区段编码的多肽序列等同的多肽序列的重链可变区，和(2)具有实质上与人CL基因区段编码的多肽序列等同的多肽序列的恒定区。
抗树突细胞的高亲和力人单克隆抗体的产生由以下方法推动，所述方法用以增加转基因小鼠(具有包括整合的人免疫球蛋白转基因的基因组)中人可变区基因区段的所有组成成分，所述方法包括在基因组中引入包括V区基因区段(在上述整合的人免疫球蛋白转基因中不存在)的V基因转基因。通常，V区转基因是包括一部分人VH或VL(VK)基因区段阵列的酵母人工染色体，所述基因区段阵列可在人基因组中天然存在，或可通过重组方法分别剪接在一起，且可包括无序的或遗漏的V基因区段。经常有五个或更多的功能性V基因区段包括在YAC上。在这种变异中，有可能造出通过V所有组成成分扩展方法产生的转基因小鼠，其中小鼠表达包括由V区转基因上的V区基因区段编码的可变区序列和在人Ig转基因上编码的C区的免疫球蛋白链。通过V所有组成成分扩展方法，可产生具有至少5个不同V基因的转基因小鼠；也可产生具有至少约24个V基因或更多的转基因小鼠。一些V基因区段可能是非功能性的(例如假基因等)；这些区段可保留，需要时也可通过熟练技术人员公知的重组方法选择性地缺失。
一旦小鼠种系已经过工程改造，含有功能性YAC，所述YAC具有在含J基因区段和C基因区段的人Ig转基因中实质上不存在的扩展的V区段所有组成成分，该性状可增殖并配种到其它遗传背景中，包括其中具有扩展的V区段所有组成成分的功能性YAC被配种到具有不同人Ig转基因的小鼠种系中的遗传背景。具有扩展的V区段所有组成成分的多功能性YAC可配种到种系中，以与某个人Ig转基因(或多种人Ig转基因)一起起作用。虽然在本文中称为YAC转基因，这样的转基因当整合到基因组时，可能基本上没有酵母序列，如酵母自主复制所需的序列；这样的序列在酵母中复制不再有必要之后(即在引入到小鼠ES细胞或小鼠前合子(prozygote)之前)，可任选用遗传工程方法(例如限制酶切消化和脉冲场凝胶电泳或其它合适方法)去除。人序列免疫球蛋白表达的性状的增殖方法包括繁殖具有人Ig转基因、还任选具有带有扩展的V区段所有组成成分的功能性YAC的转基因小鼠。VH和VL基因区段都可能存在于YAC。转基因小鼠可繁殖到专业人员想要的任何遗传背景，包括带有其它人转基因(包括人Ig转基因和/或编码其它人淋巴细胞蛋白质的转基因)的背景。本发明也提供由具有扩展的V区所有组成成分YAC转基因的转基因小鼠产生的高亲和力人序列免疫球蛋白。虽然上文描述了本发明转基因动物的优选实施方案，但也设想了其它实施方案，它们分为四类I.含有非重排重链和重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；II.含有非重排重链和非重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；III.含有重排重链和非重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；IV.含有重排重链和重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
在转基因动物的这些分类中，优选的优先顺序如下在内源轻链基因(或至少K基因)已通过同源重组敲除的情况下为II＞I＞III＞IV，在内源轻链基因未敲除且必须为等位基因排斥所支配的情况下为I＞II＞III＞IV。
III.结合树突细胞的双特异性/多特异性分子在本发明的又一个实施方案中，抗树突细胞人单克隆抗体或其抗原结合部分可被衍生化或连接到另一种功能性分子，如另一种肽、蛋白质或其它结合物质(如抗体、抗体片段或其它配体)，以产生既能结合树突细胞又能结合一种或多种其它结合部位或靶表位的双特异性或多特异性分子。例如，本发明的人抗体或其片段可功能性地连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其它方法)到一种或多种结合树突细胞之外的病原体或细胞(如肿瘤细胞)的其它抗体、抗体片段、肽(如配体，例如肿瘤配体)或结合模拟物，使得病原体或细胞被导向树突细胞。
因此，本发明包括双特异性和多特异性分子，它们包含至少一个针对树突细胞的第一结合特异性和针对第二个靶表位的第二结合特异性。在本发明的优选实施方案中，第二个靶表位是靶细胞上的抗原，如肿瘤细胞抗原、微生物抗原、病毒抗原或自身抗原。这些双特异性和多特异性分子将树突细胞导向靶细胞，使得树突细胞能调节针对这样的靶细胞和靶细胞抗原的免疫应答。在本发明的另一个实施方案中，第二个靶表位是Fc受体，如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括既能结合FcγR、FcαR或FcεR表达效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))又能结合树突细胞的双特异性和多特异性分子。这些双特异性和多特异性分子将树突细胞导向效应细胞，且如同本发明人单克隆抗体一样，可触发Fc受体介导的效应细胞活动，如对树突细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放和过氧化物阴离子的产生。
本发明双特异性和多特异性分子除具有抗Fc结合特异性或抗靶细胞抗原及抗树突细胞结合特异性外，还可进一步包括第三个结合特异性。在一个实施方案中，所述第三个结合特异性是抗增强因子(EF)部分，如结合涉及细胞毒性活性的表面蛋白、从而增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是抗体、功能性抗体片段或配体，其能结合特定分子，如抗原或受体，从而导致结合Fc受体、靶细胞抗原或树突细胞决定簇的效应增强。“抗增强因子部分”可结合Fc受体、靶细胞抗原或树突细胞。另外，抗增强因子部分可结合与第一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体。例如，抗增强因子部分可结合能导致针对靶细胞的免疫应答增强的细胞毒性T细胞(如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1)或其它免疫细胞。
在一个实施方案中，本发明双特异性和多特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体或抗体片段，包括例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其最小片段，如1990年8月7日授于Ladner等的美国专利第4,946,778号中所描述的Fv或单链构建物，其内容通过引用专门结合到本文中。
在另一个实施方案中，本发明双特异性和多特异性分子包含针对靶细胞上的抗原，如肿瘤细胞抗原、微生物抗原、病毒抗原和自身抗原的结合特异性，以及针对树突细胞的第二个结合特异性。
在另一个实施方案中，本发明双特异性和多特异性分子包含针对位于效应细胞表面的FcαR或FcγR的结合特异性，以及针对树突细胞的第二个结合特异性。针对Fc受体的结合特异性可例如通过另一个单克隆抗体，包括另一个人抗体来提供。例如，抗体能结合Fcγ受体，优选在不被人免疫球蛋白G(IgG)封闭的位点结合。本文所用的术语“IgG受体”指位于染色体1上的八个γ链基因之任何一个。这些基因共编码十二种跨膜或可溶性受体同种型，所述同种型可分为三类Fcγ受体FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是一种72kDa分子，对单体IgG显示出高亲和力(108-109M-1)。
这样的抗FcγR单克隆抗体的生产和鉴定由Fanger等在PCT申请WO 88/00052和美国专利号4,954,617中描述，其内容通过引用全部结合到本文中。这些抗体在与受体的Fcγ结合位点不同的位点结合到FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位，因此，它们的结合基本上不受生理水平的IgG阻断。适用于本发明的具体的抗FcγRI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。生产mAb32的杂交瘤获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，ATCC保藏号为HB9469。抗FcγRI mAb22和mAb22的F(ab′)2片段可获自Medarex，Inc.(Annandale，N.J.)。在其它实施方案中，抗Fcγ受体抗体为单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的生产和鉴定在Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol 155(10)4996-5002和PCT/US93/10384中描述。产H22抗体细胞系于1992年11月4日保藏于在美国典型培养物保藏中心，名称为HA022CL1，保藏号为CRL11177。
在又一个特定实施方案中，对Fc受体的结合特异性由结合人IgA受体如Fc-α受体(FcαRI(CD89))的抗体提供。术语“IgA受体”包括位于染色体19上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码几个可变剪接的55-110kDa的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜曙红粒细胞和嗜中性粒细胞上进行组成型表达，但不在非效应细胞群体上进行组成型表达。FcαRI对IgA1和IgA2均具有中等亲和力(≈5×107M-1)，当暴露于细胞因子如G-CSF和GM-CSF时所述亲和力提高(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews inImmunology 16423-440)。已描述了四个能在IgA配体结合结构域外结合FcαRI的FcαRI特异性单克隆抗体，它们分别被标示为A3、A59、A62和A77(Monteiro，R.C.等，1992，J.Immunol.1481764)。
FcαRI和FcγRI是优选用于本发明的触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞，如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞上表达；(2)表达水平高(如5,000-100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性(如ADCC、吞噬作用)的中介体；(4)介导针对它们的抗原，包括自身抗原的增强的抗原递呈。
在所有的实施方案中，本发明双特异性和多特异性分子包括至少一种识别(如结合)树突细胞的结合特异性。
本文所用的“效应细胞特异性抗体”是指结合效应细胞的Fc受体的抗体或功能性抗体片段。优选用于本主题发明的抗体在不被内源免疫球蛋白结合的位点上结合效应细胞的Fc受体。
本文所用的术语“效应细胞”是指涉及免疫应答的效应阶段而不是识别和激活阶段的免疫细胞。示例性免疫细胞包括源自骨髓或淋巴的细胞，如淋巴细胞(如B细胞和T细胞，包括溶细胞T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜曙红细胞、嗜中性细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱细胞。一些效应细胞表达特异性Fc受体并发挥特异性免疫功能。在优选的实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，如嗜中性细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞对靶细胞进行特异性杀伤和将抗原递呈到免疫系统的其它成分，或结合递呈抗原的细胞。在其它实施方案中，效应细胞能吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。效应细胞上特殊FcR的表达能被体液因素如细胞因子调节。例如，已发现FcγRI的表达被干扰素γ(IFN-γ)正调节。这种增强的表达提高携有FcγRI的细胞针对靶标的细胞毒性活性。效应细胞能吞噬或溶解靶抗原或靶细胞。
“靶细胞”是指主体(如人或动物)内不需要的细胞，其为本发明组合物(如人单克隆抗体、双特异性或多特异性分子)靶。在一个实施方案中，靶细胞是树突细胞。在其它实施方案中，靶细胞包括肿瘤细胞、微生物病原体、病毒或病毒感染的细胞。
虽然优选人单克隆抗体，能用于本发明双特异性或多特异性分子的其它抗体是鼠抗体、嵌合抗体和人源化单克隆抗体。
嵌合小鼠-人单克隆抗体(即嵌合抗体)可通过本领域公知的重组DNA技术生产。例如，编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因用限制酶消化，以除去编码鼠Fc的区，且编码人Fc恒定区的基因的相应部分取代。(参见Robinson等，国际专利公开PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988 Science 2401041-1043)；Liu等(1987)PNAS 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；和Shaw等，1988，J.Natl Cancer Inst.801553-1559)。
嵌合抗体可如下进一步人源化将不直接涉及抗原结合的Fv可变区序列用等价的人Fv可变区序列取代。有关人源化嵌合抗体的综述由Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207和Oi等，1986，BioTechniques 4214提供。有关方法包括分离、操纵和表达编码免疫球蛋白至少一条重链或轻链的Fv可变区的全部或部分的核酸序列。这样的核酸的来源对于本领域技术人员来说是公知的，例如获自7E3(一种抗GPIIbIIIa抗体产生杂交瘤)。然后编码嵌合抗体或其片段的重组DNA可克隆到适当的表达载体。合适的人源化抗体可另外通过CDR取代生产，参见美国专利第5,225,539号；Jones等1986 Nature321552-525；Verhoeyan等1988 Science 2391534；和Beidler等1988 J.Immunol.1414053-4060。
特定的人抗体的所有CDR可用至少一部分非人CDR置换，或只有一些CDR可用非人CDR置换。只需要置换人源化抗体结合到Fc受体所需的CDR的数目。
抗体可通过能够用衍生自非人抗体的CDR替换至少一部分人抗体CDR的任何方法进行人源化。Winter描述了一种可用于制备本发明人源化抗体的方法(英国专利申请GB2188638A，1987年3月26日申请)，该专利的内容通过引用专门结合到本文中。人CDR可采用寡核苷酸定点诱变用非人CDR替换，这描述于标题为HumanizedAntibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on HumanMononuclear Phagocytes(结合人单核吞噬细胞上的免疫球蛋白G的Fc受体的人源化抗体)的国际申请WO 94/10332。
其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加的嵌合抗体和人源化抗体也在本发明的范围内。尤其，优选的人源化抗体在框架区具有氨基酸取代，以改进对抗原的结合。例如，在具有鼠CDR的人源化抗体中，位于人框架区的氨基酸可用位于小鼠抗体相应位置的氨基酸替换。已知在一些情况下，这样的取代可改进人源化抗体对抗原的结合。其中氨基酸已被添加、缺失或取代的抗体在本文称为修饰抗体或改变的抗体。
术语修饰抗体也包括已通过如缺失、添加或取代抗体的某些部分而被修饰的抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，抗体可如下修饰缺失恒定区，并用另一用以提高抗体的半寿期如血清半寿期、稳定性和亲和力的恒定区替换。只要双特异性和多特异性分子具有至少一个对FcR特异的抗原结合区且触发至少一种效应分子功能，则任何修饰都在本发明的范围内。
本发明的双特异性和多特异性分子可用多种已知技术制备，包括但不限于化学技术(参见如D.M.Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 785807)、“polydoma”技术(参见Reading的美国专利4,474,893)和重组DNA技术。
尤其，可使用本领域公知方法和以下提供的实施例所描述的方法，通过缀合组分结合特异性如抗FcR和抗树突细胞结合特异性，可制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，双特异性和多特异性分子的各结合特异性可单独产生，然后互相缀合。当结合特异性为蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828648)。其它方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(Science(1985)22981-83)和Glennie等(J.Immunol.(1987)1392367-2375)描述的那些方法。优选的缀合剂为SATA和磺基-SMCC，两者均可获自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
当结合特异性为几种抗体(如两种人源化抗体)时，它们通过两条重链的C末端铰链区的巯基键合缀合。在特别优选的实施方案中，铰链区被修饰，以在缀合前包含奇数个巯基残基，优选一个巯基残基。
另外，两个结合特异性可在同一载体中编码，在同一宿主细胞中表达装配。这种方法特别适用于当双特异性和多特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab′)2或配体×Fab融合蛋白时。本发明双特异性和多特异性分子，双特异性分子可为单链分子，如单链双特异性抗体、包括一单链抗体和结合决定簇的单链双特异性分子、或包括两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可为单链分子或可包括至少两个单链分子。制备双和多特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858。
双特异性和多特异性分子结合到其特异性靶标可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物检定(如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确证。每一个方法通常通过应用对特定蛋白质-抗体复合体特异的标记试剂(如抗体)，来检测所述目的复合体的存在。例如，可使用如识别并特异性地结合抗体-FcR复合体的酶联抗体和抗体片段检测FcR-抗体复合体。另外，可用多种其它免疫测定法之任一种检测所述复合体。例如，抗体可进行放射性标记并用于放射免疫测定(RIA)中(参见例如Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，1986年3月，其内容通过引用结合到本文中)。可通过使用γ计数器和闪烁计数器之类的方法，或通过放射自显影术检测放射性同位素。
IV.抗体疫苗缀合物/免疫毒素在另一方面，本发明提供多种治疗性缀合物，其包括一种或多种连接到第二种物质的人抗树突细胞抗体(或其片段)。可连接到抗体的特定物质包括但不限于抗原(从而形成疫苗)、放射性同位素、细胞毒素(从而形成免疫毒性)和其它药物。细胞毒素和细胞毒性剂包括任何对细胞有害(如杀灭细胞)的物质。其实例包括泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾丸甾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、四卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-颈基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶decarbazine)、烷基化剂(如二氯甲基二乙胺、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、百消安、二澳甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氨铬二氯铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(如柔红霉素(以前称道诺霉素)、多柔比星)、抗生素(如放线菌素D(以前称放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC)及抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。本发明的抗体也可缀合到放射性同位素，如放射性碘，以产生细胞毒性的放射性药物，用以治疗树突细胞相关疾病，如自体免疫病或炎症疾病，或移植物抗宿主病。
因此，本发明抗体缀合物可用来改变特定的生物应答，其药物部分不能理解为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可为具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可包括例如具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思子毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子或干扰素；或生物反应调节物，如淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
将这些治疗性部分缀合到抗体的技术是公知的，参见如Arnon等“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy(癌症治疗中用以对药物进行免疫导向的单克隆抗体)”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等“Antibodies For DrugDelivery(用于药物递送的抗体)”，Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编辑)，第623-53页(Macel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyAReview(癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体综述)”，MonoclonalAntibodies′84Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy(放射性标记抗体在癌症治疗中的治疗性应用的分析、结果和未来前景)”，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性性质)”，Immunol.Rev.62119-58(1982)。
本发明人抗树突细胞抗体(及其片段)也可连接到一种或多种抗原，如肿瘤或病毒抗原，以形成疫苗缀合物。这使得可以将很多种抗原导向树突细胞，以增强对抗原的加工和递呈，并最终增强对抗原的免疫应答。
本发明抗体-抗原疫苗缀合物也可用遗传方法或化学方法制备。在任何一种情况下，缀合物的抗体部分可由整个抗体或抗体的一部分组成，如Fab片段或单链Fv。此外，可将多于一种抗原加到单抗体构建物。
用遗传方法构建的抗树突细胞抗体-抗原疫苗缀合物(如那些表达为单一重组融合蛋白的缀合物)可通过在多个位置上将选择的抗原连接到抗体来制备。本发明的特定的用遗传法生产的缀合物(融合构建物)包括例如在本文中称为MMV4的构建物，其在图14中显示。融合构建物MMV4包括融合到Pmel17(一种肿瘤相关抗原)的人抗树突细胞抗体B11。编码MMV4的核苷酸序列在SEQ ID NO8中显示。
如遗传融合构建物MMV4所例示，抗原(如Pmel17)可融合到人抗体重链的CH3结构域的末端。在Fab融合构建物中，抗原也可在抗体重链的铰链区融合，或在单链融合构建物(ScFv构建物)中，抗原也可在可变区轻链和重链(VH和VL)的序列融合。另外，抗原可融合到抗体轻链而不是抗体重链。
化学法构建的抗体-抗原缀合物可用多种公知易得的交联剂制备。这些交联剂可为同功能型化合物或异功能型化合物，如SPDP、SATA、SMCC、DTNB，其可与抗树突细胞抗体和选择的抗原上不同反应性氨基酸或碳水化合物侧链形成共价键。
任何可被克隆、表达或纯化的抗原可选用于本发明抗体-抗原疫苗缀合物。获得这样的抗原的技术在本领域是公知的。例如，肿瘤相关抗原可直接从癌细胞纯化，用生理化学技术如串连质谱仪进行鉴定。另外，用已通过用质粒DNA克隆转染获得抗原的抗原阴性细胞，来检测肿瘤特异性T细胞克隆，可分离表达抗原的克隆。然后可构建合成的肽，以精确地鉴别抗原位点和表位。
本发明抗体-抗原缀合物的一个显著优点是，它们能够快速地引起疫苗的强烈免疫应答，从而改进预防接种的效力。因此，传染病抗原和肿瘤抗原(针对其的免疫应答是保护性的和治疗性的)可缀合到本发明人抗树突细胞抗体，如抗体B11，以形成高效的疫苗。传染病抗原的实例包括但不限于病毒蛋白、细菌蛋白和碳水化合物、真菌蛋白和碳水化合物。
本发明抗体-抗原缀合物也可用以提高针对旅游或生物战中可能遇到的传染性生物体及其毒素的预防接种的效力。这样的抗原的实例包括例如炭疽抗原、肉毒中毒毒素、疟疾抗原、马脑炎和鼠疫耶尔森氏菌抗原。
用于本发明抗体-抗原缀合物的其它合适的抗原包括用以预防和治疗癌症的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于HER2/neu、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、酪氨酸酶、端粒酶和MUC-1抗原。肿瘤相关抗原也包括血型抗原，如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。在另一个优选的实施方案中，多于一种抗原被融合到单抗树突细胞抗体构建物。例如，MAGE抗原可与其它抗原如黑色素A、酪氨酸酶和gp100，以及佐剂如GM-CSF或IL-12结合，并融合到抗树突细胞抗体构建物，如B11。
其它合适的抗原包括用以预防和治疗病毒性疾病的病毒抗原。病毒抗原的实例包括但不限于HIV-1gag、HIV-1env、HIV-1nef、HBV核心抗原、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。在另一个优选的实施方案中，选择的抗原为黑素瘤特异性抗原，包括但不限于gp100或Pmel17。在另一个优选的实施方案中，选择的抗原为前列腺特异性癌抗原，如PSMA。在又一个实施方案中，选择的抗原为细菌抗原，包括但不限于鼠弓形体(Toxoplasma gondii)抗原和苍白密螺旋体(Treponema pallidum)抗原。本发明的抗体-细菌抗原缀合物可用于治疗或预防各种细菌性疾病，如炭疽、肉毒中毒、破伤风、衣原体、霍乱、白喉、莱姆病、梅毒和结核。
另一方面，对树突细胞特异的人抗体也可用来直接将完整细胞，如肿瘤细胞、效应细胞和微生物病原体导向树突细胞。抗树突细胞抗体和其抗原结合部分可直接在细胞的表面上表达，例如通过用包括编码本发明人树突细胞特异性抗体或其抗原结合片段的核酸序列的载体转染或转导细胞来表达。这可通过例如用编码包含跨膜结构域和人抗树突细胞抗体或其抗原结合片段的融合蛋白的核酸转染靶细胞来实现。制备这样的核酸、融合蛋白及能表达这样的融合蛋白的细胞的方法在例如美国专利申请系列号09/203,958中描述，其内容通过引用全部结合到本文中。另外，抗树突细胞抗体或其抗原结合片段可通过使用化学接头、脂质标记或其它有关方法结合到细胞或病原体上(deKruif，J.等(2000)Nat.Med.6223-227；Nizard，P.等(1998)FEBS Lett.43383-88)。其表面锚着抗树突细胞抗体或其抗原结合片段的细胞可用以诱导针对细胞如肿瘤细胞或微生物病原体的特异性免疫应答。
V.药用组合物另一方面，本发明提供治疗性组合物，如药用组合物，其包含本发明一种人单克隆抗体或其抗原结合部分，或多种单克隆抗体或其抗原结合部分的组合，并与药学上可接受的载体一起配制。这样的组合物还可另外包括其它治疗剂，如其它抗体、细胞毒素或药物(如免疫抑制剂)，并可单独应用或与其它疗法如放射疗法组合应用。
在一个实施方案中，几种具有互补活性的人抗树突细胞单克隆抗体可组合使用，如作为包括两种或多种人抗树突细胞单克隆抗体的药用组合物。例如，在效应细胞存在下介导对树突细胞的高效杀灭作用的人单克隆抗体可与另一种抑制树突细胞生长的人单克隆抗体组合。在另一个实施方案中，被树突细胞快速内化的人单克隆抗体可与另一种诱导树突细胞的抗原递呈细胞活性(如免疫刺激细胞因子的释放)的人单克隆抗体组合。
在另一个实施方案中，组合物包括一种本发明双特异性或多特异性分子或几种双特异性或多特异性分子的组合(例如包含至少一种针对Fc受体的结合特异性和至少一种针对树突细胞的结合特异性)。
在又一个实施方案中，组合物包括至少一种针对功能性地连接到另一分子实体如细胞毒素或抗原(如靶细胞上的抗原)的树突细胞的结合特异性。
本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上兼容的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选载体适用于静脉、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(如通过注射或输注)。取决于给药途径，活性化合物(即抗体、双特异性和多特异性分子)可包被以某种材料，以包括所述化合物免受可能使其失去活性的酸和其它条件的作用。
“药学上可接受的盐”指保留所需的母体化合物的生物活性且不会引入任何不需要的毒理效应的盐(参见例如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。这样的盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸以及无毒有机酸的盐，其中无毒无机酸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，无毒有机酸如脂族一元羧酸和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括衍生自碱土金属以及衍生自无毒有机胺的盐，其中碱土金属如钠、钾、镁、钙等，无毒有机胺如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
本发明组合物可通过本领域公知的多种方法给药。技术人员会懂的，给药途径和/或方式将根据所需的结果而改变。活性化合物可与能保护其不被快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂、和微囊化递药系统。可使用生物可降解、生物兼容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。有许多制备这样的制剂的方法都已申请专利，通常对本领域技术人员是公知的。参见例如Sustained and ControlledRelease Delivery Systems(缓释和控释递药系统)，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为通过某些给药途径给予本发明化合物，可能有必要使所述化合物包被以某种材料，或使所述化合物与某种材料一起给药，以防止其失去活性。例如，所述化合物可在适当的载体如脂质体或稀释剂中给予患者。药学上可接受的稀释剂包括盐水缓冲溶液和含水缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.727)。
药学上可接受的载体包括无菌含水溶液或分散剂和供临时制备无菌注射用溶液或分散液的无菌粉末。在药学活性物质上使用这样的媒介和介质在本领域是公知的。除非任何常规媒介或介质真的与活性化合物不兼容，否则可以考虑在本发明药用组合物中使用它们。辅助的活性化合物也可包括在组合物中。
治疗性组合物通常在生产和储藏条件下必须无菌和稳定。组合物可配制成溶液、微乳、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物的溶剂和分散媒介。可例如通过使用如卵磷脂的包衣、通过维持在分散剂情况下需要的粒子大小和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂介质，如糖类、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括能延迟吸收作用的介质，如单硬脂酸盐和明胶，实现对注射用组合物的延长吸收。
无菌注射用溶液可如下制备将所需量的活性化合物加入到适当的溶剂中，必要时与以上列举的一种成分或多种成分的组合一起加入到适当的溶剂中，然后进行微过滤除菌。通常，如下制备分散剂将活性化合物加入到包含基本分散媒介和所需的以上列举的其它成分的无菌介质。在用以制备无菌注射用溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，以从经预先无菌过滤的溶液中得到活性成分及任何另外所需的成分的粉末。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(如治疗性反应)。例如，可给予单个大丸剂，可随时间推移给予几个分开的剂量，或可按照治疗的紧急情况的需要按比例减少或增加剂量。将用于胃肠外的组合物配制成单位剂型以使给药方便和剂量均匀，这是特别有利的。本文所用的单位剂型是指在物理上分立的单位，适合作为单位剂量给予需治疗的患者；各单位含有经计算而预先确定量的活性化合物，以与所需的药用载体联合产生所需的治疗效果。本发明单位剂型的规格服从于和直接取决于(a)活性化合物的独特性质和需要达到的特别治疗效果，和(b)调剂领域固有限制性，例如活性化合物在不同个体的治疗敏感性不同。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如十六烷抗坏血酸、丁化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗性组合物，本发明制剂包括适于经口给药、鼻内给药、局部给药(包括口腔内给药和舌下给药)、直肠给药、阴道给药和/或胃肠外给药的那些剂型。所述制剂可方便地以单位剂型的形式提供，且可通过药物技术领域公知的任何方法制备。能与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量根据待治疗的主体和给药的特殊方式而变化。能与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的组分量。通常，以总共百分之百计，这个量为约0.01％至约99％活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％。
适于通过阴道给药的本发明制剂也包括阴道栓剂、卫生栓、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，它们含有本领域公知为适当的载体。用于本发明组分的局部给药或透皮给药的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，需要时也可与任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
本文所用的术语“胃肠外给药”是指除肠内和局部给药之外的给药方式，通常为注射方式，且非限制性包括静脉、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内注射和输注。
可应用于本发明药用组合物的合适的水性和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油如橄榄油和注射用有机酯如油酸乙酯。可例如通过使用如卵磷脂的包衣、通过维持在分散剂情况下需要的粒子大小和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。
这些组合物也可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过如上所述的灭菌程序和通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂，如尼泊金酯类、氯丁醇、苯酚山梨酸等，确保防止存在微生物。也可能适合在组合物中包括等渗剂，如糖类、氯化钠等。此外，可通过加入能延迟吸收的介质，如单硬脂酸铝和明胶来实现注射用药物形式的延迟吸收。
当本发明化合物作为药物给予人和动物时，可单独给予和作为药用组合物给予，组合物中包含例如0.01-99.9％(优选0.1-90％)的活性成分及与其组合的药学上可接受的载体。
不管所选择的给药方式，本发明化合物(可以水合形式使用)和/或本发明药用组合物可通过本领域技术人员公知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
本发明药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可加以变化，以得到能有效实现针对特定患者、组合物和给药方式所需的治疗应答作用的活性成分的量，而又不对患者产生毒性。选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所用的特定化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状况和既往病史以及医学领域公知的类似因素。
在本领域具有普通技术水平的医师或兽医可容易地确定和开出所需的有效量的药用组合物。例如，医师或兽医开始开出的所用本发明化合物的剂量水平低于为达到所要求治疗效果所而需要的剂量水平，然后逐渐增加剂量，直至达到所要求的效果。通常，合适的本发明组合物的日剂量为有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这个有效剂量通常取决于上述因素。优选给药方式为静脉、肌内、腹膜内或皮下给药，优选在最接近靶标位点处给药。如需要，治疗性组合物的有效日剂量可以两个、三个、四个、五个、六个或更多分剂量的形式在一天中的合适间隔时间内分开给药，且任选以单位剂型形式给药。虽然本发明化合物有可能单独给药，优选将所述化合物作为药用制剂(组合物)来给药。
治疗性组合物可用本领域公知的医疗装置给予。例如，在优选的实施方案中，本发明治疗性化合物可用无针皮下注射装置给药，如在以下专利公开的注射装置美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556。适用于本发明的众所周知的植入体和存储体的实例包括美国专利第4,487,603号，其中公开了用以按可控速率分配药物的植入式微灌注泵；美国专利第4,486,194号，其中公开了通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利第4,447,233号，其中公开了按精确的灌注速率递送药物的药物灌注泵；美国专利第4,447,224号，其中公开了用以连续递药的可变流速植入式灌注装置；美国专利第4,439,196号，其中公开了具有多室容器的渗透性递药系统；和美国专利第4,475,196号，其中公开了一种渗透性递药系统。这些专利通过引用结合到本文中。许多这样的其它植入物、递药系统和存储体为本领域技术人员所公知。
在某些实施方案中，配制本发明人单克隆抗体，以确保所述抗体在体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水性化合物。为确保本发明治疗性化合物能通过BBB(如果需要)，可将它们配制在例如脂质体中。有关制备脂质体的方法，参见例如美国专利第4,522,811号、第5,374,548号和第5,399,331号。脂质体可包括一个和多个被选择性地转运到特定细胞或器官的部分，从而增强靶向递药(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。示例性的导向部分包括叶酸和生物素(参见例如Low等的美国专利第5,416,016号)；甘露糖苷(Umezawa等，(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233134)，不同种类均可包括本发明制剂以及本发明的分子组分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；另参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4273。在本发明的一个实施方案中，本发明治疗性化合物配制于脂质体中，；在更优选的实施方案中，所述脂质体包括导向部分。在最优选的实施方案中，脂质体中的治疗性化合物通过大剂量注射(bolus injection)递送到最接近肿瘤或感染的位点。组合物的流动性必须达到易于注射的程度。它在生产和储藏的条件下必须稳定，必须防止微生物如细菌和真菌的污染。
相对于未接受治疗的主体，“治疗有效剂量”优选调节树突细胞的生长和/或活性至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，还更优选至少约80％。化合物调节树突细胞的生长和/或活性的能力可在可用预测抗原递呈和/或免疫调节有效的动物模型系统评估。
另外，可通过检验化合物调节树突细胞的免疫细胞刺激作用的能力，例如在体外用本文描述的测试法和熟练从业人员公知的测试法来检验，以评估组合物的这种性质。在一个实施方案中，治疗有效量的治疗性化合物可抑制树突细胞生长和/或活性，或通过其它方式减轻主体的症状，如自身免疫症状。在另一个实施方案中，治疗有效量的治疗性化合物可增强树突细胞对抗原的加工和递呈，从而增强针对免疫原或靶抗原的免疫应答。本领域普通技术人员可根据以下因素，即患者的体型、患者症状的严重程度、患者体内的免疫活动以及选择的特定组合物或给药途径，来确定所述化合物的量。
组合物必须无菌，其流动性必须达到能使组合物可通过注射递药的程度。除水之外，载体可为等渗缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可例如通过使用如卵磷脂的包衣、通过维持在分散剂情况下需要的粒子大小和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，如糖类、多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇以及氯化钠。可通过在组合物中加入能延迟吸收的介质，如单硬脂酸铝或明胶来实现注射用组合物的长期吸收。
当活性化合物如上所述被适当地保护时，它可经口给药，如与惰性稀释剂或可同化的食用载体一起给药。
VI.本发明的用途和方法本发明组合物(即抗树突细胞人单克隆抗体及其衍生物/缀合物)具有体外和体内诊断和治疗效用。
例如，这些分子可给予培养物(如体外或来自体内的培养物)中的细胞，或给予主体(如体内)中的细胞，以治疗、预防或诊断多种疾病。本文所用的术语“主体、生物个体或患者”有意包括人和非人动物。术语本发明“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
在特定的实施方案中，人抗体及其衍生物在体内使用，以治疗、预防或诊断多种树突细胞介导的或树突细胞相关的疾病。
在一个实施方案中，优选的人类动物包括患有树突细胞介导的或树突细胞相关的疾病的人类患者。例如，本发明的方法和组合物可用以治疗患有自身免疫疾病、免疫系统疾病或炎症疾病的主体，所述疾病例如具有与树突细胞免疫调节有关的异常或不需要的免疫活性特征的疾病。用本发明人抗树突细胞抗体可得以治疗的自身免疫疾病、免疫系统疾病或炎症疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、重症肌无力、恶性贫血、爱迪生氏病、红斑狼疮、莱特尔综合征和甲状腺机能亢进。例如，患有自身免疫疾病的主体可受益于对树突细胞介导的自体抗原递呈的抑制。
可用本发明人抗树突细胞抗体治疗的其它疾病实例包括移植排斥和移植物抗宿主病。
移植排斥近年来，在用以移植组织和器官，如皮肤、肾脏、肝脏、心脏、肺、脾脏和骨髓的手术技术的疗效方面有相当大的进步。也许还没解决的主要问题是缺少令人满意的药物，以在移植接受者中诱导对所移植的同种异体移植物或器官的免疫耐受性。当同种异体细胞或器官移植到宿主(即供体和受体为同物种的不同个体)时，宿主免疫细胞很可能发起针对移植物中的外来抗原的免疫应答(宿主抗移植物病)，导致移植的组织被破坏。CD8+细胞、CD+细胞、和单核细胞都参与对移植的组织的排斥。本发明的治疗剂适用于抑制受体中树突细胞介导的、同种抗原诱导的免疫应答，从而防止这些树突细胞参与对移植的组织或器官的破坏。
移植物抗宿主病本发明治疗剂的一个相关用途在于调节参与移植物抗宿主病(GVHD)的免疫应答。GVHD是一种潜在的致命疾病，具有免疫能力的细胞被转移到同种异体接受者时会发生该疾病。在这种情况下，供体中具有免疫能力的细胞会攻击接受者中的组织。皮肤、内脏上皮和肝脏中的组织是常见的攻击目标，它们在GVHD发病过程中会被破坏。当移植免疫组织时，如骨髓移植，该疾病会造成特别严重的问题；但在其它情况下(包括心脏和肝脏移植物情况)较不严重的GVHD也有报道。本发明治疗剂可用于抑制宿主抗原递呈细胞如树突细胞的活性。
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用以调节主体针对抗原的免疫应答。本发明的人抗树突细胞抗体可用以将抗原导向树突细胞，从而调节抗原递呈和加工，这样可诱导针对抗原的免疫应答。抗原可以是肿瘤抗原和病原体(如微生物病原体)抗原。病原体可以是病毒(如HIV)、细菌、真菌或寄生虫。抗原也可以是患者(如患有早老性痴呆的患者)中淀粉样蛋白沉积物的一种成分，且抗原是Aβ肽。
例如，以下分子复合体可给予主体，以诱导或增强针对抗原的免疫应答，所述分子复合体包括至少一种对连接到抗原的树突细胞的表面上的某种成分的结合特异性，其中所述分子复合体对树突细胞的结合能介导分子复合体的内化。产生的针对抗原的免疫应答包括作为MHC-I或MHC-II复合体成分的抗体(能结合抗原)和T细胞(能结合抗原)。因此，本发明的人抗树突细胞抗原也可用以介导主体中导向树突细胞的免疫作用。例如，主体可用以下分子复合体免疫，所述分子复合体包括至少一种对连接到抗原的树突细胞的表面上的某种成分的结合特异性，其中所述分子复合体对树突细胞的结合能介导分子复合体的内化，且例如增强对抗原的加工和递呈。
在另一方面，对树突细胞特异的人抗体可用以直接将完整细胞，如肿瘤细胞、效应细胞或微生物病原体导向树突细胞。抗树突细胞抗体或其抗原结合片段可如通过用以下载体转染或转导细胞，直接在细胞的表面上表达，所述载体含有编码本发明人树突细胞特异性抗体的核酸序列。另外，抗树突细胞抗原或其抗原结合片段可通过使用化学接头、或脂质标记或其它相关方法结合到细胞或病原体。具有锚着于表面的抗树突细胞抗体或其抗原结合片段的细胞可用以诱导针对细胞(如肿瘤细胞或微生物病原体)的特定免疫应答。
因此，本发明抗体可用以刺激针对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。特别适合采用这种治疗手段的病原体的实例包括目前还没有针对其的特效疫苗的病原体，或常规疫苗对其不能完全有效的病原体。它们包括但不限于HIV、肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、流行性感冒病毒、疱疹病毒、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌。
可首先测定本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)与其体外治疗或诊断用途有关的结合活性。例如，本发明组合物可用以下实施例描述的流式细胞术和内化测试法进行测试。此外，可测试这些分子触发至少一种效应分子介导的效应细胞活性(包括树突细胞的细胞溶解作用)的活性。测试效应细胞介导的吞噬作用和细胞溶解作用的方案为本领域所公知。
本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)在治疗和诊断树突细胞介导的或树突细胞相关的疾病方面具有另外的效用。例如，人单克隆抗体、多特异性或双特异性分子可用以例如在体内或体外引起一种或多种以下生物活性调理树突细胞；在人效应细胞存在下介导对树突细胞的吞噬作用或细胞溶解作用；抑制树突细胞生长；自身被树突细胞内化；或将抗原导向树突细胞。
本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)的给药方法为本领域所公知。所用分子的合适剂量取决于主体的年龄和体重以及所用的特定药物。所述分子可偶联到放射性核素，如□□□I、90Y、105Rh等，这在Goldenberg，D.M.等(1981)Cancer Res.414354-4360和EP0365 997中描述。本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可偶联到免疫调节剂。
靶标特异性效应细胞，如连接到本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)的效应细胞也可用作治疗剂。用以导向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、嗜中性细胞或单核细胞。其它细胞包括嗜曙红细胞、自然杀伤细胞和其它携有IgG或IgA受体的细胞。如需要，效应细胞可得自待治疗主体。靶标特异性效应细胞可在生理上可接受的溶液中作为细胞悬液来给予。所给予的细胞的数目约108-109，但可根据治疗目的加以改变。在一个实施方案中，其数量足以在例如树突细胞获得定位，且足以如通过吞噬作用实现细胞杀灭。在另一个实施方案中，靶标特异性树突细胞，如连接到本发明组合物的树突细胞可用作治疗剂，用以在靶细胞如肿瘤细胞、微生物病原体、病毒或病毒感染细胞定位，或用以导向抗原，且用以通过如抗原加工和递呈实现针对靶细胞或靶抗原的免疫应答。给药途径也可以不同。
采用靶标特异性效应细胞或靶标特异性树突细胞的疗法可与其它用以除去导向细胞的技术一起施用。例如，使用本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)和/或携有这些组合物的效应细胞的抗树突细胞疗法，可与化学疗法或免疫调节疗法(如抗炎或免疫抑制疗法)一起使用。此外，组合免疫疗法可用以将两种不同的细胞毒性效应细胞群体导向例如树突细胞。例如，连接到抗FcγRI或抗CD3的抗树突细胞抗体可与IgG或IgA受体特异性结合剂一起使用。
在另一个实施方案中，用例如本发明人抗体、多特异性和双特异性分子导向的树突细胞可与免疫调节疗法(如免疫刺激)一起使用，以增强针对靶细胞和靶抗原的免疫应答。树突细胞导向疗法可与其它形式的免疫疗法如细胞因子治疗(如干扰素、TNFα、GM-CSF、G-CSF、IL-2)联合使用。
本发明的双特异性和多特异性分子也可用以调节树突细胞活性，如抗原加工和递呈，以及如通过对细胞表面上的受体进行帽化和消除来调节树突细胞上的关联抗原的水平。
具有补体结合位点(如能结合补体的IgG1、2或3或IgM的各部分)的本发明组合物(如人抗体，多特异性和双特异性分子)在补体存在的情况下也可使用。在一个实施方案中，用本发明的结合剂和适当的效应细胞对包括靶细胞的细胞群体进行活体外(ex vivo)处理时，可添加补体或含有补体的血清。对包被有本发明结合剂的靶细胞的吞噬作用可通过补体蛋白的结合而得到提高。在另一个实施方案中，包被有本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)的靶细胞也可被补体裂解。
本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可与补体一起给药。因此，包含人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物也包括在本发明范围内。这些组合物的有利之处在于补体极其接近人抗体、多特异性或双特异性分子。另外，本发明抗体、多特异性或双特异性分子与补体或血清可分开给药。
在其它实施方案中，主体可另外用能调节(如增强或抑制)免疫细胞的活性和/或Fcα或Fcγ受体的表达或活性的药物来治疗，如通过用细胞因子治疗主体。在用多特异性分子治疗过程中优选给予的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNFα)。
本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可用以导向例如树突细胞，如以对所述细胞进行标记。对于这样的用途，结合剂可连接到能被检测的分子。因此，本发明提供了定位体内或体外的树突细胞的方法。可检测标记可以是例如放射性同位素、荧光化合物、酶和酶的辅因子。
在一个实施方案中，本发明提供检测样品中树突细胞或树突细胞抗原的存在的方法，或测定树突细胞或树突细胞抗原的数量的方法，所述方法包括在容许抗体或其部分与树突细胞或树突细胞抗原之间形成复合体的条件下，将样品和对照样品与能特异性结合树突细胞或树突细胞抗原的人单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后可检测出形成的所述复合体，其中样品与对照样品相比复合体形成的差别说明了样品中树突细胞或树突细胞抗原的存在。
在又一个实施方案中，本发明提供了在体内或体外检测树突细胞的存在或对树突细胞进行定量的方法。所述方法包括(i)将缀合可检测标记物的本发明组合物(如多或双特异性分子)或其片段给予主体；(ii)将主体暴露于用以检测所述可检测标记物的手段中，以鉴别包含树突细胞的区域。
包括本发明组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)的试剂盒及其使用说明也包括在本发明的范围内。所述试剂盒进一步包含至少一种另外的试剂，如细胞因子或补体，或一种或多种另外的本发明人抗体(如与第一种人抗体不同的，具有互补活性且能结合树突细胞上的表位的人抗体)。
本发明可进一步用以下实施例进行说明，这些实施例不能理解为是对本发明的进一步限制。在本申请中引用的所有图表和所有引用文献、专利和出版的专利申请书的内容通过引用专门结合到本文中。
实施例实施例1 抗树突细胞人单克隆抗体的生产抗树突细胞人单克隆抗体通过用树突细胞制品免疫HuMAb小鼠HCO7品系进行生产。HCO7 HuMAb小鼠如美国专利第5,770,429号和第5,545,806号所描述那样培育，所述专利的全部公开内容通过引用结合到本文中。
具体来说，HCO7小鼠用在弗氏佐剂中乳化的人树突细胞通过腹膜内注射免疫四次。简单地说，树突细胞如下制备。通过密度梯度离心全血或Leukopak血小板脱落制品获得人外周血单核细胞(PBMC)。单核细胞通过黏附于组织培养瓶两小时进行分离，然后与2ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4在巨噬细胞无血清培养基(Gibco)中温育5至9天，分化成树突细胞。用于免疫的细胞新鲜使用或在-80℃下冷藏。小鼠每2-3星期免疫一次。最后，在脾切除前静脉注射树突细胞的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。收集相应小鼠的脾脏并将其分散为单细胞。
为产生产抗树突细胞抗体的杂交瘤，鼠脾细胞和含有抗树突细胞抗体的血浆一起与P2X63-Ag8.653骨髓瘤细胞(保藏于ATCC，名称为ATCC CRL 1580非分泌性鼠骨髓瘤细胞)和PEG融合。在含HAT的培养基中生长，以从中选出杂交瘤。杂交瘤长出后(约10至14天)，用抗人IgG ELISA筛选含有产生人IgG的杂交瘤的各孔。
按以下性质筛选和选择阳性杂交瘤(1)人IgG抗体产量，和(2)结合树突细胞。
可通过流式细胞术，测试分泌人IgG的杂交瘤与各种血细胞的反应性。通过在补充GM-CSF和IL-4的培养基中培养贴壁单核细胞5至7天，可制备树突细胞。粒细胞(PMN)、单核细胞和淋巴细胞可获自肝素化全血。这些细胞在4℃下与获自IgG阳性克隆的杂交瘤上清一起温育。用FITC标记的山羊抗人IgG(Fc)探针检测结合情况。通过使用FACScalibur仪器进行分析，可确定细胞相关性荧光。
如下表1所示，筛得的几种杂交瘤产生人IgGκ抗体，所述抗体通过流式细胞术测定显示出与树突细胞的反应性(如A3、A5、A23、A24、A33、B9、B11、B33、B47、C8、C10、C20、C28、C29、C30、C35、E1、E8、E10、E18、E20、E21、E24、10F7、28-6、24-3、25-14、17-6、19-2和19-4)。与其它血细胞类型相比，一些人抗体对树突细胞显示出非常高的优先反应性。
表1对树突细胞具有反应性的人单克隆抗体
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针对炭疽孢子模拟物(枯草芽孢杆菌孢子)的试验证明在暴露于使用氯化乙酰胆碱的DF-200HF 30分钟后99.9999％(7-对数)的杀死。
已经检验其它2种O-乙酰基漂白活化剂，一醋精(甘油一乙酸酯)和二醋精(二乙酸甘油酯)，它们在DF-200制剂中的效力。这两种化合物都也已经证明是极有效的漂白活化剂。这些化合物是水溶性液体。
实验已经显示在DF-200制剂中的过氧化物也被含腈化合物如4-氰基苯甲酸(其是水溶性的)在浓度为例如2％下有效地激活以中和化学试剂和生物试剂模拟物。
使用过乙酸的DF-200将过乙酸而不是过氧化氢用作DF-200中的氧化剂来进行试验。使用下列制剂2％Variquat80MC(阳离子表面活性剂)2％过乙酸(氧化剂)5％碳酸氢钾(缓冲剂和激活剂)91％水用固体KOH将pH调整为9.8并针对模拟物芥子，VX和炭疽孢子检验制剂。该制剂针对化学试剂模拟物的性能在表17中显示。
表17含有2％过乙酸的DF-200的动力学试验的反应速率。
II.纯化的抗树突细胞人抗体的剂量依赖型结合纯化的人抗树突细胞单克隆抗体B11、C20和E21与树突细胞的剂量依赖型反应性通过流式细胞术测试。
如上所述从贴壁单核细胞制备树突细胞。收集所述树突细胞，将其在4℃下与不同浓度的单克隆抗体B11、C20和E21或同种型对照温育。用FITC标记山羊抗人IgG(Fc)探针检测抗体的结合，用带有CellQuest软件的FACScalibur仪器测定细胞相关的荧光。
如图2所示，与同种型匹配对照IgG抗体相比，各单克隆抗体表现出对树突细胞的剂量依赖型结合。这些数据表明，纯化的人单克隆抗体B11、C20和E21以浓度依赖型方式与树突细胞结合。抗树突细胞抗体之间不同的结合强度说明它们识别树突细胞上独特的分子或表位。
III.人抗体B11与CD34+干细胞来源树突细胞的结合从循环血单核细胞分化而来的树突细胞由于容易获得，是研究和临床应用中最常用的树突细胞类型。但是，也可使用衍生自祖干细胞的树突细胞，且能更准确地代表人体组织中的树突细胞。因此，在以下研究中，通过流式细胞术评价从CD34+祖细胞分化而来的树突细胞与人单克隆抗体B11的反应性。
将纯化的人单克隆抗体B11在0.3M碳酸钠缓冲液(pH9.5)中充分透析，以供用荧光异硫氰酸酯(FITC)标记。FITC储液通过在1mlDMSO中溶解1mg固态FITC制备。在持续搅拌下滴加FITC储液，其加入量使得每毫克抗体蛋白得到50μg FITC。加入FITC后，所得溶液在室温下暗处温育1至3小时。在用PBS平衡的Sephadex G-10柱上进行凝胶过滤，分离FITC标记抗体。
CD34+祖细胞和树突细胞分化培养基获自Poetic Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)。按照生产商的说明书使细胞分化。收集树突细胞，在4℃下与不同浓度的B11-FITC或同种型对照抗体(人IgG-FITC)温育。通过用带有CellQuest软件的FACScalibur仪器进行分析，测定细胞相关的荧光。
结果显示于图3且表明，人单克隆抗体B11以剂量依赖型的方式与从CD34+干细胞分化而来的树突细胞结合。因此，B11靶抗原在衍生自单核细胞和衍生自祖干细胞的树突细胞上表达。
IV.人抗体B11与巨噬细胞和树突细胞的结合人抗树突细胞单克隆抗体B11结合巨噬细胞的能力(与结合树突细胞的能力相比)可用流式细胞术评定。
如上所述从贴壁单核细胞制备树突细胞。通过将贴壁单核细胞与M-CSF培养5至7天，从贴壁单核细胞制备巨噬细胞。收集所述细胞，将其在4℃下与10ug/ml单克隆抗体B11或同种型对照抗体温育。用FITC标记山羊抗人IgG(Fc)探针检测人抗体的结合。通过用带有CellQuest软件的FACScalibur仪器进行分析，测定细胞相关的荧光。
结果显示于图4且表明，人抗体B11结合巨噬细胞的程度比其结合树突细胞的程度要低。因此，B11靶抗原也可在巨噬细胞上表达，但其表达水平比在树突细胞上观察到的要低。由于树突细胞和巨噬细胞之间具有相似性，单克隆抗体B11与巨噬细胞的反应性并不令人奇怪。由于这两种细胞类型共有结构性质和功能性质(包括刺激T淋巴细胞应答和B淋巴细胞应答的能力)，抗体B11与巨噬细胞的交叉反应性可能对抗原递呈细胞的导向是有利的。
V.人抗体B11靶抗原在THP-1细胞上的诱导在THP-1细胞(一种与单核细胞相类似的细胞系，得自人单核细胞白血病)被诱导分化成树突细胞表现型之前和之后，用流式细胞术测试人单克隆抗体B11与THP-1细胞的结合。
概括地讲，THP-1细胞在标准培养基或补充GM-CSF和IL-4的培养基中生长。在4℃下与10μg/ml单克隆抗体B11-FITC或同种型对照抗体(人IgG-FITC)温育。通过用带有CellQuest软件的FACScalibur仪器进行分析，测定细胞相关的荧光。结果显示于图5。
这些数据表明，在正常生长条件下，THP-1细胞不表达B11靶抗原。但是，当通过在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养THP-1细胞，使其转变成树突细胞表现型时，B11靶抗原的表达随之被诱导。因此，这些结果进一步确证了B11人抗体对与树突细胞特异性相关的靶抗原(B11)的特异性。
VI.人抗体B11与短尾猴树突细胞的结合猕猴短尾猴动物(猴子)模型能提供有关抗体的临床应用的相关信息，条件是靶抗原在灵长类动物中是保守的。因此，可通过流式细胞术评价人单克隆抗体B11与猕猴树突细胞的交叉反应性。
新鲜猕猴血获自Sierra Biomedicals，通过将贴壁单核细胞与GM-CSF和IL-4培养，从贴壁单核细胞制备树突细胞。树突细胞在4℃下与10μg/ml单克隆抗体B11-FITC或同种型对照抗体(人IgG-FITC)温育。通过用FACScalibur仪器进行分析，测定细胞相关的荧光。
如图6所示，人单克隆抗体B11结合得自猕猴短尾猴的树突细胞，表明B11靶抗原在灵长类动物中是保守的。
VII.人抗体B11与人组织树突细胞的结合通过免疫组织化学法，评价人单克隆抗体B11与人组织树突细胞的反应性。这些实验也设计来评价抗体B11与人组织的其它细胞或抗原的潜在交叉反应性。
通过尸体解剖或外科活组织检查获取人组织的低温切片，将其包埋于Tissue-Tek O.C.T.介质中，在-70℃下冻藏。将组织切成5mm切片，用丙酮固定10分钟，干燥过夜。载玻片在着色前用10％中性缓冲的福尔马林固定10秒钟。使用间接免疫过氧化物酶技术。切片首先用溶于含有热集合IgG的PBS的B11-FITC或同种型匹配FITC抗体着色，以封闭Fc依赖型结合。用兔抗FITC抗体检测第一抗体，然后用过氧化物酶标记的抗兔试剂检测。各载玻片由经认证的病理学者审阅，其结合情况按照以下表解符号进行分级±(可疑)、1+(弱)、2+(中)、3+(强)、4+(极强)、Neg.(阴性)。下表2所示结果表明，在所有检查的组织中都存在明显的树突细胞和一些巨噬细胞的着色现象。同种型对照抗体没有观察到特定的着色现象。
这些数据表明人单克隆抗体B11结合人组织树突细胞，以及人组织巨噬细胞，尽管对后者的结合程度较低。B11对脾脏的单核细胞和骨髓的祖细胞的最低结合可反映其对不成熟树突细胞的结合。人抗体B11不与受试样品中的其它细胞类型或组织发生交叉反应，这进一步表明该抗体对树突细胞的特异性及对巨噬细胞的较低程度的特异性。
表2人单克隆抗体B11结合人组织的免疫组织化学检测结果
组织交叉反应性研究在Pathology Associates International，Frederick，MD study# IM598进行。
VIII.人抗体B11的单链Fv(ScFv)片段与人树突细胞的结合人单克隆抗体B11的单链Fv片段与人组织树突细胞的反应性通过流式细胞术进行评价。
如图9所示，通过将人单克隆抗体B11的VL(SEQ ID NO1和2)和VH(SEQ ID NO3和4)结构域连接，构建B11 ScFV。加入EGF序列，以用抗EFG抗体检测ScFv与树突细胞的结合情况。在4℃下将树突细胞与B11 ScFv温育一小时，然后洗涤，再在4℃下与抗-EFG-FITC探针温育1小时。用FACS分析法分析样品。
FACS分析结果表明，人单克隆抗体B11的B11 ScFv片段结合人树突细胞。因此，可通过将ScFv分别连接到选择的抗原或毒素，将其用作疫苗或免疫毒素。
IX.人抗体B11的F(ab’)2片段与人树突细胞的结合人单克隆抗体B11的F(ab’)2片段与人组织树突细胞的反应性通过流式细胞术进行评价。这些实验也设计来鉴定人抗体B11的Fc部分是否明显参与B11对树突细胞的结合。
通过在标准条件下用胃蛋白酶消化纯化的B11 mAb，可制备F(ab’)2片段。可用蛋白质L色谱纯化F(ab’)2片段。通过在GM-CSF和IL-4中培养人单核细胞，可从人单核细胞新鲜制备树突细胞，然后在4℃下将所述树突细胞与完整抗体或F(ab’)2抗体片段温育1小时。将所述细胞洗涤，然后在4℃下与抗人IgG-F(ab’)2-PE探针温育1小时。在此洗涤细胞，然后用FACScalibur仪器和Cellquest软件分析。
如图10所示，FACS分析结果表明，完整人单克隆抗体B11和B11的F(ab’)2片段按类似的动力学方式结合树突细胞，说明完整单克隆抗体的Fc部分对B11结合树突细胞没有显著作用。
实施例3 B11靶抗原的鉴定I.从树突细胞免疫沉淀人单克隆抗体B11-靶抗原人单克隆抗体B11可用来使其相关靶抗原从树突细胞发生免疫沉淀。
概括地讲，制备树突细胞裂解物，将其在4℃下与单克隆抗体B11和同种型对照IgG抗体温育。用抗人IgG-琼脂糖捕获抗体-抗原复合体，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所述复合体。
在来自两个不同的树突细胞裂解物制品的抗体B11免疫沉淀物中，可见对应于分子量约180kd的条带，而在对照样品中却没有。因此，这些免疫沉淀研究表明，人单克隆抗体B11识别树突细胞上的某种靶抗原，所述抗原的分子量用SDS-PAGE分析约为180kd。
II.来自树突细胞的人单克隆抗体B11靶抗原的N末端测序如上进行免疫沉淀后，对所述B11靶抗原进行N末端氨基酸测序，以确定其与已知蛋白质的同源性。
用树突细胞制备细胞裂解物，将所得裂解物在4℃下与单克隆抗体B11温育。用抗人IgG-琼脂糖捕获抗体-抗原复合体，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所述复合体。将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素，然后洗脱对应于单克隆抗体B11的条带，以供N末端氨基酸测序。N末端测序和数据库检索在Midwest Analytical，Inc.(St.Louis，MO)进行。
对单克隆抗体B11靶抗原的N末端15个氨基酸残基的测序揭示其与人巨噬细胞甘露糖受体的蛋白质序列同源性，具体如下DDXXQFLIXXEDXKR(SEQ ID NO5) B11抗原LDTRQFLIYNEDHKR(SEQ ID NO6) 巨噬细胞甘露糖受体对人蛋白质数据库进行计算机检索，没有发现任何其它蛋白质与B11抗原具有显著的同源性。
在进一步的研究中，将树突细胞裂解物与载有抗小鼠IgG的琼脂糖温育过夜，以从树突细胞裂解物中清除非特异性结合蛋白质。离心除去琼脂糖，将清除后所得上清收集并与预先载有抗体B11的抗人IgG-琼脂糖温育过夜。将所述琼脂糖用PBS洗涤并用还原性加样缓冲液煮沸。最后，离心除去所述琼脂糖，将所得上清加载到凝胶上。抗体B11使约150-180kd的蛋白质发生免疫沉淀。将所述蛋白质印迹于PVDF膜上并送至Midwest Analytical，Inc.进行微量测序。
对单克隆抗体B11靶抗原的N末端微量测序结果揭示以下蛋白质序列LLDTR QFLIY LEDTK RCVDA(SEQ ID NO7)。而且这个序列与人巨噬细胞甘露糖受体(GenBank登记号NP_002429)的序列相匹配，在国家生物技术信息中心网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLAST算法测得20多个氨基酸具有100％的同一性。这些数据表明，能被人单克隆抗体B11识别的树突细胞上的靶分子是巨噬细胞甘露糖受体。
III.B11抑制树突细胞摄取FITC-葡聚糖以下试验设计来测试抗体B11是否阻断甘露糖受体，从而可例如将抗体B11用以预防或抑制病原体与甘露糖受体之间的相互作用(如细胞感染)。
将树突细胞与FITC-葡聚糖(500μg/ml)和同种型对照人IgG或B11 HuMAb之一(25μg/ml)在图11所示各温度下温育30分钟。已知葡聚糖分子可被树突细胞通过甘露糖受体特异性地内化(F.Sallusto等J.Exp.Med.1995，185389-400)。通过FACS分析确定标记(FITC)-葡聚糖的摄取量(即用FACScalibur仪器测定树突细胞样品的荧光强度)。FITC-葡聚糖在37℃下的摄取百分比设定为100％，在4℃下的摄取百分比设定为0％。
如图11所示，在上述条件下，抗体B11阻断FITC-葡聚糖摄取达61.5％。这些结果提示人单克隆抗体B11可用来阻断病原体与甘露糖受体的相互作用。
实施例4 人抗树突细胞抗体的活性I.树突细胞对人单克隆抗体B11的内化通过流式细胞术评价人抗体B11结合树突细胞后被内化的程度。
如上所述从贴壁单核细胞制备树突细胞。所得树突细胞在4℃下与饱和浓度的单克隆抗体B11-FITC温育1小时，以使抗体的表面结合最大化，接着用冷PBS洗涤以除去过量的抗体，然后在37℃下温育不同时间，以使抗体内化。然后用冷PBS洗涤样品以停止反应，再进一步用0.1％PBA(pH2.5)洗涤以从细胞表面除去结合的抗体。剩余的荧光为已被内化的抗体B11-FTIC。将对照细胞立即用0.1％PBA(pH2.5)洗涤并保持在4℃，以代表最低内化程度，或只用0.1％PBA(pH7)洗涤，以代表抗体B11-FTIC的最大加载。按照以下公式计算抗体内化百分比。
内化％＝(样品平均荧光强度-酸洗涤4℃对照的平均荧光强度)/(PBS洗涤4℃对照的平均荧光强度-酸洗涤4℃对照的平均荧光强度)图7所示结果表明，人单克隆抗体B11结合树突细胞后被有效内化。人抗树突细胞单克隆抗体B11的这个未曾预料的性质表明，该抗体可用以将物质(如抗原和毒素)通过细胞内方式递送到树突细胞。
II.树突细胞对B11-FITC的内化也采用显微观察确证抗体B11结合树突细胞后被内化。
在非贴壁条件下将单核细胞与GM-CSF(10ng/ml)和IL-13(50ng/ml)温育7天，制备树突细胞。在人IgG(600μg)和抗CD32 mAbIV.3(10μg)存在下，将所得树突细胞与mAb-FITC(1μg)结合，以阻断非特异性摄取，然后在37℃下温育。在整个过程中对照细胞在冰上培育。37℃下15至60分钟后，将树突细胞置于冰上，用抗CD11c-PE(1μg)着色。用BioRad MRC1024激光扫描聚焦显微镜通过聚焦显微镜术检查mAb B11的内化。用15mW Kr/Ar激光器的488nm线和两个光电探测器(522/35nm二色向光电探测器用于FITC荧光，605/32nm二色向光电探测器用于PE荧光)扫描细胞，以检测荧光。用63X Plan-APO 1.4NA物镜(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)，光圈设定为2.1，容许检测厚度约为1.0μm的荧光影像各光学切面。将整个细胞切片后，从通过细胞中央的切片选出代表性影像。
结果确证B11 mAb结合甘露糖受体后被树突细胞迅速内化，再次提示该抗体可有效递送抗原和毒素到抗原递呈细胞中。与FACS数据相一致的是，内化在15分钟内明显出现，在一个小时内几乎完成。
III.人单克隆抗体B11导向性抗原递送后树突细胞增强抗原递呈为确定人单克隆抗体B11是否可用以增强树突细胞对抗原的加工和递呈作用，用化学交联剂SMCC将B11抗体缀合到破伤风类毒素(TT)抗原。
如上所述从贴壁单核细胞制备树突细胞，不同的是细胞在特氟隆容器中培养。收集树突细胞，分散于具有1％胎牛血清的巨噬细胞无血清培养基，接种于96孔微量滴定板，每孔5000个细胞。将缀合到破伤风类毒素的单克隆抗体B11或单独破伤风类毒素以不同浓度加入到树突细胞。通过将单核细胞与破伤风类毒素温育，然后再与IL-2温育产生的自体破伤风类毒素特异性T细胞加入到各含50,000个树突细胞的各孔。将所混细胞在37℃下一起培养7天，然后用基于MTT的测试法按照生产商的说明书(Promega，Madison，WI)测定活细胞的数量。将所述细胞暴露于破伤风类毒素或抗体B11-破伤风类毒素后，比较它们诱导树突细胞以特异性地刺激破伤风类毒素特异性T淋巴细胞的能力。结果(图8)显示，将破伤风类毒素作为模型抗原缀合到B11导致明显更加有效的抗原递呈作用，这通过测定抗原特异性T细胞增殖得以反映。
在另一个实验中，在将树突细胞载以与破伤风类毒素(TT)缀合的B11或载以与B11混合的破伤风类毒素(非缀合对照)之后，用3H-胸苷反映T细胞的增殖。作为附加对照，将抗FcγRII(CD32)、mAb IV-3的封闭性抗体加入到含有B11-TT缀合物的一些孔中，以确定此Fc受体是否有助于增强B11-TT的抗原加工和递呈作用。第二天起，将细胞与新鲜解冻、预先建立的破伤风类毒素特异性T细胞结合4天。在最后一天将细胞与3H-胸苷在37℃下共温育。测试结合到T细胞的3H的量。
如同前述实验一样，结果(图12)表明，将破伤风类毒素作为模型抗原缀合到B11导致明显更加有效的抗原递呈作用，这可通过测定抗原特异性T细胞的增殖得以反映。加入过量的mAb IV.3并没有明显改变B11-TT缀合物对抗原的增强递呈作用，表明B11-TT与FcγRII的相互作用对此活性来说并不是必需的。
总体而言，图8和图12所示的这些研究结果表明，与只有破伤风类毒素相比，为到达T细胞刺激水平所需的抗体B11缀合的破伤风类毒素的量要低10至100倍。此外，当用抗体B11将破伤风类毒素导向树突细胞时，图8所示的T细胞刺激的绝对程度提高两倍。因此，这些数据表明，抗原可缀合到人单克隆抗体B11，且抗体导向的抗原比非导向的抗原得到更有效的加工和递呈，导致增强的抗原特异性T细胞应答。
实施例5 抗树突细胞人单克隆抗体E21的鉴定I.人抗体E21抗原的分子量分析从培养获得的人树突细胞制备树突细胞裂解物。概括地讲，在4℃下将树突细胞洗涤并重悬于含有裂解缓冲液的Triton X-100。将未进行分部分离的裂解物加载于4-15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，然后将蛋白质转移到硝酸纤维上。所得印迹与10ug/ml E21温育，然后与抗人IgG碱性磷酸酶探针温育并用辣根过氧化物酶显色。
本实验结果表明，人单克隆抗体E21抗原的分子量约为36-40kd。
II.人抗体E21与人真皮和表皮人树突细胞的结合如图1所示，人单克隆Ab E21优先结合树突细胞。本实验设计来通过用E21对冷冻皮肤进行免疫组织化学分析，测试人抗体E21对真皮和表皮树突细胞的反应性。
人皮肤的冷冻切片用FITC-E21和FITC-huIgG对照染色，用兔抗FITC探针检测。
免疫组合化学分析结果表明，人抗体E21与人皮肤切片的真皮树突细胞/巨噬细胞和表皮树突细胞(朗罕氏细胞)均有反应。
III.人抗体E21与短尾猴树突细胞的结合猕猴短尾猴动物(猴子)模型能提供有关抗体的临床应用的相关信息，条件是靶抗原在灵长类动物中是保守的。因此，可通过流式细胞术评价人单克隆抗体E21与猕猴树突细胞的交叉反应性。
用GM-CSF和IL-4处理使猕猴单核细胞分化成树突细胞，并用流式细胞术测试E21结合情况。所述树突细胞在4℃下与E21温育1小时，接着洗涤，然后在4℃下与抗人IgG-FITC探针温育1小时。用FACScalibur仪器分析样品。
实施例6 B11-Pmel-17疫苗缀合物的生产和鉴定I.B11-Pmel-17分子缀合物的重组表达如图14所示，构建含有融合(在重链CH3结构域)到抗体B11的Pmel-17编码序列(黑素瘤抗原)的质粒。然后用标准程序(Qiagen Inc，Valencia，CA)将所得质粒构建物(称为“MMV4”(SEQ ID NO8))转染CHO细胞。在含有抗生素G418的培养基中选出被转染的细胞。在不断增大甲氨蝶呤的浓度下培养细胞，进一步使表达扩增。扩增后，通过有限稀释克隆细胞，用稳定克隆系产生细胞库，以供进一步研究。
为确证B11-Pmel-17的表达，在还原条件下对经SDS-PAGE分离的蛋白质进行蛋白质印迹分析。所述蛋白质用兔抗Pmel血清或用山羊抗人IgG探出。对完整融合构建物的分析也在还原条件下进行。融合构建物在适当的分子量处发生免疫沉淀。因此，实验结果确证被转化的CHO细胞特异性地表达B11-Pmel-17分子缀合物，这从融合产物的适当大小和组成可以得到证明。
II.B11-Pmel-17分子缀合物的结合分析B11-Pmel-17分子缀合物结合树突细胞的能力可通过流式细胞术评定。
如上所述从贴壁单核细胞制备树突细胞。通过将贴壁单核细胞与M-CSF培养5至7天，从贴壁单核细胞制备巨噬细胞。收集所述细胞，将其在4℃下与10ug/ml单克隆抗体B11或同种型对照抗体温育。用FITC标记山羊抗人IgG(Fc)探针检测人抗体的结合。通过用带有CellQuest软件的FACScalibur仪器进行分析，测定细胞相关的荧光。
树突细胞在4℃下与20ug/mL B11-Pmel17分子缀合物和阴性对照温育。用缀合到藻红蛋白的山羊抗人IgG(Fc特异性)检测所述缀合物的B11部分对甘露糖受体的结合(图15)。用兔抗Pmel-17血清，然后用缀合到藻红蛋白的山羊抗兔IgG检测所述缀合物的抗原(Pmel-17)部分对甘露糖受体的间接结合(通过B11)。分别如图15-16所示的结果表明，B11-Pmel-17分子缀合物结合树突细胞且能有效地将Pmel-17抗原导向树突细胞。
结论前述各实施例说明了以高亲和力特异性结合树突细胞的人单克隆抗体的生产方法。
尤其，人单克隆抗体B11能特异性地识别树突细胞上的人巨噬细胞甘露糖受体。此外，人单克隆可变B11能有效被树突细胞内化，且能增强树突细胞对抗原的加工和递呈作用。
人单克隆抗体E21结合人树突细胞上的抗原与B11不同。E21抗体也能与衍生自猕猴短尾猴(猴子)的树突细胞发生交叉反应，提示E21抗原在灵长类动物中是保守的，且因此提供了为进一步开发抗体所需的相关动物模型。
这些结果支持以下结论本发明的全部人单克隆抗体，包括其片段、缀合物和双特异性分子可用于树突细胞相关疾病的诊断和治疗。
等同方案本领域技术人员只使用常规实验方法，就可确认或能够确定本文所述的本发明特定实施方案的许多等同方案。这样的等同方案包括在以下权利要求书中。
序列表&lt;110&gt;Medarex.Inc.et al.
&lt;120&gt;抗树突细胞的人单克隆抗体&lt;130&gt;MXI-166CPPC&lt;150&gt;USSN 10/035,637&lt;151&gt;2001-11-07&lt;150&gt;USSN 09/851,614&lt;151&gt;2001-05-08&lt;150&gt;USSN 60/203,126&lt;151&gt;2000-05-08&lt;150&gt;USSN 60/230,739&lt;151&gt;2000-09-07&lt;160&gt;9&lt;170&gt;FastSEQ for Windows Version 4.0&lt;210&gt;1&lt;211&gt;321&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人(Homo sapiens)&lt;220&gt;
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权利要求
1.一种分子缀合物，所述缀合物包含连接在一起的结合树突细胞的人单克隆抗体和黑素瘤相关抗原。
2.权利要求1的分子缀合物，其中黑素瘤相关抗原选自Gp100和Pmel-17。
3.一种分子缀合物，所述缀合物包含连接在一起的结合树突细胞的人单克隆抗体和前列腺相关抗原。
4.权利要求3的分子缀合物，其中前列腺相关抗原选自PSA和PSMA。
5.任一项前述权利要求的分子缀合物，其中所述抗体包括抗体片段和单链抗体。
6.任一项前述权利要求的分子缀合物，其中树突细胞为人树突细胞。
7.任一项前述权利要求的分子缀合物，其中所述抗体包含的可变区选自包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的重链可变区，包含SEQID NO4所示氨基酸序列的轻链可变区，以及它们的保守修饰序列。
8.任一项前述权利要求的分子缀合物，其中所述抗体包含的可变区选自SEQ ID NO1所示核苷酸序列编码的重链可变区，SEQ IDNO3所示核苷酸序列编码的轻链可变区，以及它们的保守修饰序列。
9.任一项前述权利要求的分子缀合物，所述缀合物由SEQ IDNO8所示核苷酸序列编码。
10.任一项前述权利要求的分子缀合物，所述缀合物包含SEQ IDNO9所示氨基酸序列。
11.一种组合物，所述组合物包含任一项前述权利要求的分子缀合物和药学上可接受的载体。
12.权利要求11的组合物，所述组合物还包含佐剂。
13.一种将抗原导向树突细胞的方法，所述方法包括使细胞与任一项前述权利要求的分子缀合物接触。
14.一种诱导或增强生物个体体内针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述个体任一项前述权利要求的分子缀合物。
15.权利要求14的方法，其中免疫应答包括呈递作为MHC-I或MHC-II缀合物组分的抗原。
16.一种免疫生物个体的方法，所述方法包括给予所述个体任一项前述权利要求的分子缀合物。
17.权利要求16的方法，其中分子缀合物的给予量足以诱导树突细胞释放细胞因子。
全文摘要
本发明公开了特异性结合树突细胞的分离人单克隆抗体及其抗原结合部分。本发明同时公开了包括所述抗体或抗体部分的双特异性分子、免疫毒素和抗原的缀合物。人抗体可由非人转基因动物如转基因小鼠生产，所述非人转基因动物能够通过进行V－D－J重组和同种型转换生产人单克隆抗体的多种同种型。本发明还公开了包含人抗体的药用组合物、生产人抗体的非人转基因动物和杂交瘤以及使用人抗体的治疗方法和诊断方法。
文档编号G01N33/564GK1612934SQ02826794
公开日2005年5月4日 申请日期2002年11月7日 优先权日2001年11月7日
发明者Y·M·德奥, T·凯勒, M·恩德雷斯, J·特雷姆尔 申请人:塞尔德克斯医疗公司