专利名称：一种抗sftsv的人源抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体，具体而言涉及一种抗SFTSV的人源抗体。
背景技术：
2010年中国中东部部分地区，包括安徽、江苏、湖北、河南、山东等省先后暴发多起由蜱虫叮咬而致人死亡的公共卫生事件，造成社会恐慌，严重影响当地群众健康安全和经济发展。经包括国家和相关省疾控中心多家单位的联合攻关，查明引起该传染病的病原为一新型的出血热病毒，在分类学上属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae),目前命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenic Syndrome Virus,SFTSV)[Xuej ie Yu,Mifang Liang,Shouyin Zhang,et al. Fever with thrombocytopeniaassociated with a novel bunyavirus in China. N Engl Med 2011 ；364 (16)1523-1532]。随着全国监测力度的加强，目前在我国浙江也发现该病毒的存在。另外，中东阿联酋最近也有疑似该病例的报道；在美国密苏里州发现的一种被称为Heartland的病毒[McMu 11 an, Laura K. , Folk, Scott Μ. , Kelly, Aubree J. et. al. A New PhlebovirusAssociated with S evere Febrile Illness in Missouri. New England Journal ofMedicine, 2012，367 (9) :834-841]，其与SFTSV基因组的同源性很高，说明SFTSV或许呈现世界性分布，或者能被生物媒介携带快速传播。布尼亚病毒科现分为5个属,其中有4个属对人致病，分别为正布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属和白蛉病毒属。该科成员大多由媒介生物，如蜱、螨、蚊、鼠等传播，引起地区或全球性流行。在我国主要有汉坦病毒(汉坦病毒属)和新疆出血热病毒(内罗病毒属)引起地方性流行，而新发现的SFTSV则为白蛉病毒属的新成员。SFTSV基因组由大(L)、中(M)、小(S)三个单股负链RNA片段组成，与布尼亚病毒科其他病毒相似，病毒基因组3'末端和5'末端序列互补，形成非共价闭环RNA。L片段编码由2084个氨基酸组成的RNA依赖的RNA聚合酶;M片段编码具有1073个氨基酸的膜蛋白前体，翻译后经宿主细胞内蛋白酶的修饰形成Gn和Ge两个糖蛋白；S片段属双义RNA，分别编码核衣壳蛋白NP和非结构蛋白NSs。该病毒引起人感染的典型症状为，病人起病急，高热伴全身乏力、头痛、肌肉关节酸痛，其典型临床特征为白细胞和血小板明显降低，转氨酶升高，血清乳酸脱氢酶明显升高，凝血酶原时间延长，钠、钾、氯等电解质偏低。病例大都生活于丘陵地区，首发病例多为有野外工作经历的中老年人，病死率较高(可高达30% )，死亡原因主要是多脏器功能衰竭。该病例多为散发，亦可引起家庭聚集性暴发，人传人现象严重[Bao CJ, Guo XL, Qi X，et. al. A family cluster of infections by a newly recognized bunyavirus in easternChina, 2007 further evidence of person-to-person transmission. Clin InfectDis.2011,53(12) 1208-1214 ；Yan Liu, Qun Li, Wanfu Hu, et.al.Person-to-PersonTransmission of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus. Vector-Borneand Zoonotic Diseases. February 2012,12 (2) : 156—160 ;Zhongtao Gai, MifangLiang, Ying Zhang, et.al. Person-to-Person Transmission of Severe Fever WithThrombocytopenia Syndrome Bunyavirus ThroughBlood Contact. Clinical InfectiousDiseases2012 ;54(2) :249-252] 由于该病是一新发自然疫源性传染病，疫情不可能短期内消失；目前临床尚无有效治疗策略，无疫苗供应；该病临床始发症状与普通流感无异，且病人多集中在农村地区，交通不便，卫生医疗水平薄弱，等到确诊，病情大多发展到病毒血症、多脏器衰竭，此时临床只能采取对症治疗手段。而作为化学治疗的补充，由抗体介导的预防和治疗病毒感染的措施已显现良好的效果，其应用前景得到专家的认同。事实上，国内首个用于治疗汉坦病毒感染的抗体药物已完成III期临床试验，准备上市。抗体作为人体内一种最重要的抗病毒免疫介质，抗体分子可以通过阻断病毒颗粒与其受体的结合、激活巨噬细胞、NK细胞等杀伤细胞、激活补体等多种机制来杀伤、清除病毒颗粒及受感染细胞。抗体制剂不仅可以中和病人体内大量的病毒，降低荷载，转归病情，对病人的密切接触者，如陪护、医护人员进行紧急被动免疫，防止二代、三代感染者的出现。研究表明，临床上使用病毒特异性的康复人血浆，可有效中和病毒，防止病毒在体内各器官扩散，避免发生致死性的多脏器衰竭，对病人病程的转归也起了重要作用。但多抗血浆不仅来源有限，同时其临床应用也受到诸如难以质控、供受体血型不匹配、潜在的传染性因子等条件的限制。鼠源单抗制备简单，治疗机理明确，但是其异源性阻碍了在人体内的应用。而人源单克隆抗体可有效克服上述问题。本研究采用噬菌体展示抗体文库技术，以纯化的SFTSV病毒为靶标，筛选人源抗体单链抗体片段(single chain variable fragment, scFv),获得一株具有广谱中和活性的人源单克隆抗体分子，MAb4-5。应用分子生物学手段对该抗体片段进行全分子化基因构建，真核表达了 MAb4-5IgGl。进一步的研究表明，该抗体分子结合的抗原决定簇位于病毒颗粒外膜Gn糖蛋白N末端的一个结构域,该决定簇呈线性排列。另外,对MAb4-5中和机制的研究结果表明，该抗体通过阻碍病毒糖蛋白与其易感细胞膜上受体的结合而发挥作用。
发明内容
本发明采用噬菌体展示抗体文库技术，以纯化的发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenic Syndrome Virus, SFTSV)为祀标，筛选人源抗体单链抗体片段(single chain variable fragment, scFv),获得一株具有广谱中和活性的人源单克隆抗体分子，MAb4-5,并应用分子生物学手段对该抗体片段进行全分子化基因构建，真核表达了 MAb4-5 IgGl0进一步的研究表明，该抗体分子结合的抗原决定簇位于病毒颗粒外膜GTn糖蛋白N末端的一个结构域，该决定簇呈线性排列。另外，对MAb 4_5中和机制的研究结果表明，该抗体通过阻碍病毒糖蛋白与其易感细胞膜上受体的结合而发挥作用。本发明公开了一种抗SFTSV的人源单链抗体MAb4_5，所述单链抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID N0U SEQ ID NO :2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4所示。本发明所述的单链抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7所示。所述单链抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10 所示。本发明还公开了上述单链抗体MAb4-5及其全分子抗体MAb4_5IgG的制备方法，主要包括如下I.抗SFTSV scFv人源抗体文库构建和筛选首先，获取5名SFTSV感染康复者的外周血(经专利申请者所在单位伦理委员会、及相关献血者书面同意)，分离外周淋巴细胞，抽提总RNA，使用oligo (dT)引物反转合成cDNA，PCR分别扩增抗体的重、轻链可变区基因Vh和\，连接成scFv后克隆入载体pComb3Xss,电转化大肠杆菌XLl-Blue。以纯化的SFTSV颗粒包板进行亲和筛库，经过3轮的筛选(吸附-洗脱-扩增)，将第3轮洗脱的重组噬菌体感染大肠杆菌XLl-Blue后铺板，随机挑取90个单菌落，制备重组噬菌体，用ELISA筛选SFTSV特异性噬菌体克隆，共获得14个阳性克隆，经测序、去除重复序列，共获得6个特异性抗体克隆，分别是4-5、A5、A9、Al I、B2和D6。2.中和实验对于上述的6个scFv片段在大肠杆菌中进行了表达、纯化，并用纯化的scFv片段做中和实验。将浓度为100 μ g/nL的scFv片段50 μ L与等体积的SFTSV毒株JS-2010-003 (含有100TCID50)混合，37°C作用Ih后，该混合物加入到培养有Vero细胞单层的96孔板中，于37°C、5% CO2的培养箱中培养6d，每天观察细胞病变(Cytopathic effect, CPE)。对于能抑制大于90% CPE的单抗被认为具有中和活性。结果发现6个抗体中只有4-5具有中和活性。3. MAb4-5抗体克隆全分子化构建和真核表达将MAb4_5抗体的重、轻链可变区基因分别克隆入载体pAc-K_CH3中，应用杆状病毒表达系统表达全分子抗体(MAb4-5IgGl)并纯化。4.MAb4_5IgGl中和活性的测定利用分离自不同地区、不同时间的SFTSV株与MAb4_5IgGl做交叉保护实验，测定该抗体分子的广谱中和能力。结果表明，MAb4-5从scFv片段转化成全分子IgGl其亲和力大约提高了 20倍，具有较高的中和活性；同时MAb4-5IgGl对2010-2012年度分离自不同疫区的病毒株均表现出较强的中和能力，显示出MAb4-5 IgGl具有较广的中和谱。5.单克隆抗体MAb 4-5轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定用www. expasy. org在线软件将编码抗SFTSV抗体MAb 4-5的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列。MAb 4-5的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2所示。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ IDNO 7所示。重链可变区序列中的互补决定区⑶R1、CDR2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 所示。本发明采用噬菌体展示抗体文库技术，成功地筛选出一株对SFTSV具有中和能力的人源抗体片段，MAb4-5。并阐明了该抗体分子所结合的抗原决定簇和其对病毒中和作用的机制。全分子化的MAb4-5 IgGl表现出了对SFTSV广谱性的中和能力，利用该抗体与对SFTSV的中和作用，将其制成特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由SFTSV感染引起的疾病，具有很强的临床应用和经济价值。
图I分离得到的6株scFv抗体对JS-2010-003病毒株中和活性的测定结果，PC为康复期病人血清，NC为阴性对照；图2 纯化后的 MAb4_5IgGl SDS-PAGE 图；图3MAb4-5、MAb4_5 IgGl的中和滴度测定结果，阴性对照为抗肠道病毒71的人抗体 IgGl ；图45 μ g/mL MAb4_5IgGl对不同SFTSV病毒株的中和活性测定结果；图5Western blot检测MAb4_5IgGl与JS-2010-003病毒株的Gn糖蛋白的结合；图6免疫荧光检测MAb4_5IgGl与JS-2010-003病毒株感染Vero细胞的结合，图A显示MAb4_5IgGl能结合JS-2010-003感染的Vero细胞，图B为阴性对照图7免疫电镜检测MAb 4-5 IgGl与JS-2010-003的结合，图A显示MAb 4-5IgGI能与JS-2010-003，图B为阴性对照；图8Western blot检测MAb4_5IgGl与Gn糖蛋白膜外结构域结合；图9Western blot检测MAb 4-5对Gnl与Vero细胞膜上的受体结合的阻断,对照为无中和活性的抗体MAb A5。
具体实施例方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一 JS-2010-003病毒颗粒的纯化I.材料病毒株JS-2010-003 :为专利申请者于2010年从江苏一 SFTSV感染病人血清中分
离获得。2.方法和结果将病毒接种Vero细胞后，于37°C、5% CO2培养箱中培养10d，无菌吸取病毒培养上清液；使用I : 4000稀释的β_丙内酯(β-propiolactone)于4 灭活24h,5000rpm离心30min去除细胞碎片；30000rpm，4 °C超速离心2h ;用少量磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)重悬病毒颗粒,用分子筛层析柱 Sepharose 4FF 进一步纯化病毒。通过上述步骤收集到了纯度较高的JS-2010-003病毒颗粒。所有的病毒操作均在生物安全2级(BSL-2)实验室中进行。实施例二噬菌体展示scFv人源抗体文库的构建和筛选I.材料引物Vh基因扩增引物
上游引物HSCVH1-F，见序列表中SEQ IDNO 11 ;HSCVH2_F，见序列表中 SEQ IDNO 12 ;HSCVH35-F，见序列表中 SEQ IDNO 13 ;HSCVH3a_F 见序列表中 SEQ ID NO :14，HSCVH4_F见序列表中 SEQ ID NO 15 ;HSCVH4a_F，见序列表中 SEQ ID NO 16 ；下游引物HSCG1234_B，见序列表中SEQ ID NO 17 ；Vk基因扩增引物上游引物:HSCK1-F，见序列表中SEQ ID NO 18 ;HSCK24_F，见序列表中 SEQ ID NO 19 ；HSCK3-F 见序列表中 SEQ ID NO 20 ;HSCK5_F，见序列表中 SEQ ID NO 21 ；下游引物HSCJK14o-B，见序列表中SEQ ID NO :22 ;HSCJK2o_B，见序列表中 SEQ IDNO 23 ;HSCJK3o-B，见序列表中 SEQ ID NO 24 ;HSCJK5o_B，见序列表中 SEQ ID NO 25 ；Va基因扩增引物上游引物HSCLamla，见序列表中SEQ ID NO :26 ;HSCLamlb，见序列表中SEQ IDNO 27 ;HSCLam2，见序列表中 SEQ ID NO 28 ;HSCLam3，见序列表中 SEQ ID NO 29 ；HSCLam4,见序列表中SEQ ID NO 30 ;HSCLam6，见序列表中SEQ ID NO :31 ;HSCLam78，见序列表中SEQID NO 32 ;HSCLam9，见序列表中 SEQ ID NO 33 ;HSCLamlO，见序列表中 SEQ ID NO 34 ；下游引物HSCJLaml236，见序列表中SEQ ID NO 35 ;HSCJLam4，见序列表中 SEQ IDNO 36 ;HSCJLam57，见序列表中 SEQ ID NO 37 ；scFv基因扩增引物上游引物RSC_F，见序列表中SEQ ID NO 38 ；下游引物:RSC_B，见序列表中SEQ ID NO 39 ；2.方法和结果2. I抗SFTSV特异性噬菌体抗体构建(I)外周血淋巴细胞的分离。取5名SFTSV感染康复者的外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，4°C，5000rpm离心lOmin，并用生理盐水或PBS洗涤两次。将收集到的淋巴细胞混合后进行总RNA提取。(2)总RNA的提取。参照总RNA提取试剂盒说明书抽提淋巴细胞中的总RNA。并用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。(3)逆转录 cDNA。取含 Ig 总 RNA 的溶液，加入 Oligo (dT) 185 μ L，双蒸水 9 μ L，70。。水浴IOmin ;取出后迅速置于冰上5min后，再置于室温IOmin ;依次加入依次加入IOX缓冲液 5 μ LjMgCl2 O. 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP2 μ L, Inhibitor〗μ L，M_MLV4 μ L,混匀后 42°C水浴60min ;产物为cDNA第一链，_20°C冻存备用。(4) PCR扩增VH、Vk、Va基因。以上述制备的cDNA为模板，利用前述VH、Vk和Va基因引物，分别扩增Vh、Vk和Va基因片段。扩增体系如下所示cDNA O. 5 μ g，上游引物60pmol，下游引物 60pmol，10XPCR 缓冲液 lOyL，dNTP8 μ L, MgCl26 μ L, Ex Taq0.5yL，加水至 100 μ L。PCR 反应条件94°C 5min ；94°C 15s，50°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°CIOmin0 1%琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。切下目的条带，使用DNA片段纯化剂盒回收。(5) scFv基因的扩增等摩尔比混合Vh和Vk，Vh和Va基因片段，利用overlap-PCR扩增scFv基因，扩增体系如下VH I 卩11101，￥1;(￥;^)1 11101，1 (-卩60 11101，1 (-860 11101，10\ 0 缓冲液1(^1^dNTP8y L,MgCl26y L,Ex TaqO. 5 μ L，加水至 100 μ L。PCR 反应条件94°C 5min ；94°C 15s,56°C 30s, 72°C lmin，25个循环；72°C lOmin。I %琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。切下目的条带，使用DNA片段纯化剂盒回收。(6) scFv基因酶切及与载体连接。将上述制备的scFv回收产物及载体质粒pComb3XSS用紫外分光光度计测核酸浓度后进行酶切。取scFv基因或载体pComb3XSS10y g，加入SfiI酶40u，IOX缓冲液Μ40μ L，加水到200yL，50°C酶切20h。I %琼脂糖凝胶电泳切下目的条带，进行胶回收，方法同前。取酶切后的scFvO. 7yg，酶切后的载体pCombSXSSljyg，T4连接酶40u，5X连接缓冲液40μ L，16°C连接过夜。(6)连接产物的转化。将连接产物置于65°C水浴lOmin，灭活T4DNA连接酶。经乙醇沉淀后加入ddH20溶解连接产物。用0. 2cm电转杯，25 μ F，2. 5kV，200Q的电转条件转化感受态大肠杆菌XLl-Blue。迅速将转化产物加入5mL SOC培养基中，300rpm，37°C振摇培养lh，用预热的SB培养基(含20 μ g/mL Amp和10 μ g/mL四环素)10倍梯度稀释将菌液涂布于LB琼脂平板上，37°C培养过夜。次日计数细菌克隆数计算库容。将电转化后的菌液加入辅助噬菌体VCSM13超感染，加入SB培养基(含20 μ g/mLAmp和10 μ g/mL四环素)37°C振摇培养I. 5h，加卡那霉素到终浓度70 μ g/mL, 37°C振摇培养过夜。离心沉淀菌体，收集上清，加入PEG8000/NaCl冰上沉淀噬菌体lh，15000rpm, 4°C离心15min,弃上清,干燥后用2mL含I % BSA的PBS重悬。15000rpm, 4°C离心5min,将上清用0. 22 μ m过滤，即得到卩遼菌体展示scFv抗体库。2. 2抗SFTSV特异性噬菌体抗体富集筛选(I)用纯化的SFTSV颗粒包被ELISA板I μ f/孔L，洗涤加封闭液，洗涤，加噬菌体抗体库，洗去未结合的噬菌体，感染增殖，加辅助噬菌体VCSM13超感染；重复以上筛选步骤，共进行三轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选；(2)将最后一轮筛选并增殖得到的噬菌体稀释后铺于培养板上，培养过夜，随机挑取90个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5 μ L菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体VCSM13超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜，离心取出上清进行ELISA检测(SFTSV颗粒包被ELISA板浓度为I μ g/孔)，当P/N值(Positive/Negative)大于2. I时,该菌株为阳性单克隆曬菌体株；共得到14株阳性克隆。阳性克隆经核酸序列分析后，发现有6株不同序列scFv，分别是4-5、Α5、Α9、Α11、Β2和D6。实施例三scFv抗体中和活性筛选I.材料用于实验的SFTSV毒株如下表所示。
权利要求
1.一种抗SFTSV的人源单克隆抗体或其片段，包括轻链⑶R1-3和重链⑶R1-3，其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为CDRl :如序列表中SEQ ID NO 5所示；CDR2 :如序列表中SEQ ID NO 6所示；CDR3 :如序列表中SEQ ID NO 7所示；所述重链⑶R1-3的氨基酸序列为CDRl :如序列表中SEQ ID NO 8所示；CDR2 :如序列表中SEQ ID NO 9所示；CDR3 :如序列表中SEQ ID NO 10所示。
2.如权利要求I所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.如权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的核甘酸序列如序列表中SEQ ID NO :3所示，所述重链可变区的核甘酸序列如序列表中SEQ ID NO 4 所示。
4.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测SFTSV病毒的试剂、药剂或试剂盒中的应用。
5.如权利要求4所述的试剂、药剂或试剂盒，其特征在于，所述抗体或其片段带有生物标记或化学标记，所述生物标记或化学标记为突光标记、放射性标记或酶标记。
6.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备治疗和/或预防SFTSV感染药物中的应用。
7.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测SFTSV的抗原或抗体的工具中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗SFTSV的人源抗体，该抗体的核苷酸序列，其中轻链核苷酸序列见SEQ ID NO.5，重链核苷酸序列见SEQ ID NO.6，本发明公开了制备上述抗体的方法。本发明的抗体特异性识别SFTSV病毒颗粒。利用该抗体与对SFTSV的中和作用，将其制成特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由SFTSV感染引起的疾病。
文档编号G01N33/577GK102942629SQ20121047378
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者焦永军, 张黎, 曾晓燕, 郭喜玲, 史智扬, 崔仑标, 周明浩 申请人:江苏省疾病预防控制中心