一种抗胰岛素样生长因子受体IGF-1R人源抗体LMAb1的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及通过噬菌体库获得的抗IGF-1R人源功能抗体LMAbl。具体而言，通过 分子生物学方法从全人噬菌体抗体库中筛选到了一株抗人IGF-1R人源抗体LMAbl，通过真 核表达系统获得相应的抗体，最后通过生物学实验对抗体的体外、体内功能进行评价。
【背景技术】
[0002] 胰岛素生长因子IGFs及其受体IGF-1R与肿瘤的关系密切。IGF-1R是跨膜受体， 属于受体酪氨酸激酶（RTK)，基因定位于染色体15q25_26,其前体为一条单链多肽，经剪切 加工去除30个氨基酸的信号肽序列后，肽链被糖基化，并断裂成一条具有706个氨基酸的 胞外A亚单位和626个氨基酸构成的穿膜B亚单位。A和B亚单位通过二硫键形成一个AB 半受体，它与另一个AB半受体构成一个完整受体A2B2。其胞外的A亚单位富含半胱氨酸， 决定配体结合的特异性，B亚单位则穿越细胞膜，传导配基诱导的信号，B链的不同区域可 以介导IGF-1R不同的生物学活性，其中Y950 (第950位酪氨酸残基）为Src同源域2 (She) 和IRS-1的结合位点，K1003(第1003位赖氨酸残基）是ATP结合位点，Y1131、Y1135和 Y1136是酪氨酸激酶活性区域，它能够促使IRS-1等底物发生磷酸化，并可以促进细胞集落 的形成，而位于IGF-1R C端的Y1250和Y1251可以使细胞获得转化功能，Y1316则可以和 PI3激酶结合，发挥抗细胞凋亡及促有丝分裂等生物学功能。当配基与IGF-1R结合后可诱 导其自身及IRS、She、Grb 10等底物磷酸化，同时启动细胞内P13K-PKB/AKT和RAS-RAF-MAPK 等信号级联反应，促进细胞有丝分裂，抑制细胞凋亡。因此，IGF-1R不但对正常组织有增殖 效应，而且也是细胞恶性转化的前提，与肿瘤的发生、发展密切相关。
[0003] IGF-1R在恶性神经系统肿瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝 癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达状态，其酪氨酸激酶活性也有所增强。IGF-1R的激活在 细胞增殖方面有以下重要作用：（1)可促进有丝分裂；（2)是某些类型细胞转化表型建立和 维持的前提及肿瘤发生所必备；（3)可减少肿瘤细胞凋亡，由此导致或加速肿瘤形成和进 展。研究表明，IGF-1R在乳腺癌中高表达，且IGF-1R能够介导乳腺癌细胞的有丝分裂；在 子宫内膜腺癌中IGF-1R的表达显著高于正常组织和良性增生内膜，可能的机制为：IGF-1R 通过与配体结合，激活下游分子如MAPK等的相互作用，通过与细胞癌基因如c-myc、c-src 等的协同表达从而促使胞内蛋白发生磷酸化，诱导核内相关癌基因的表达，最终导致细胞 癌变。
[0004] 总而言之，在大多数肿瘤中IGF-1R表达增加，促进肿瘤细胞的增殖，与恶性肿瘤 的发生、发展、浸润和转移有密切的联系，因此IGF-1R能够作为肿瘤诊断、治疗和预后的重 要参考。IGF-1R是一个极具吸引力的肿瘤靶向治疗的靶点，其拮抗剂如特异性抗体、反义核 酸等能够调节肿瘤细胞表面的IGF-1R的表达，使肿瘤细胞的增殖受到抑制，促进肿瘤细胞 凋亡、影响肿瘤新血管形成从而抑制肿瘤生长，发挥良好的抗肿瘤效应。
[0005] 本项发明利用噬菌体抗体库方法获得了 一株新型抗人IGF-1R人源功能抗体 LMAbl。体外试验显示，LMAbl具有良好的生物学效应，能够特异性识别细胞膜表面的 IGF-1R(图1)，抑制IGF-1R阳性细胞的增殖（图2)、迁移（图3)和克隆形成（图4);体内 试验显示，LMAbl能够抑制移植瘤的生长，降低小鼠的死亡率（图5)。LMAbl为IGF-1R表 达阳性的癌症等相关疾病的预防和治疗提供了选择。
【发明内容】
[0006] 为了提供新的抗IGF-1R抗体分子，本发明公开了一种抗IGF-1R人源抗体LMAbl 可变区氨基酸序列，其特征在于重链可变区氨基酸序列为序列1，轻链可变区氨基酸序列为 序列2。
[0007] 本发明还公开了一种抗IGF-1R人源抗体LMAbl可变区基因序列，重链可变区基因 为序列3,轻链可变区基因为序列4。
[0008] 本发明公开的抗体LMAbl的特征之一是能够识别细胞膜表面靶抗原IGF-1R。
[0009] 本发明公开的抗体LMAbl的特征之一是能够特异性地抑制IGF-1R阳性细胞的增 殖。
[0010] 本发明公开的抗体LMAbl的特征之一是能够特异性地抑制IGF-1R阳性细胞的迁 移。
[0011] 本发明公开的抗体LMAbl的特征之一是能够特异性地抑制IGF-1R阳性细胞的体 外克隆形成。
[0012] 本发明公开的抗体LMAbl的特征之一是能够在动物体内发挥抑制肿瘤增殖的功 能，降低小鼠死亡率。
[0013] 具体实施过程如下：
[0014] 1)利用全人源天然抗体库筛选获得抗IGF-1R抗体LMAbl基因序列；
[0015] 2)设计相应的引物，构建抗IGF-1R抗体LMAbl真核表达载体；
[0016] 3)抗IGF-1R抗体LMAbl的真核表达及纯化；
[0017] 4)抗IGF-1R抗体LMAbl体外生物学活性的鉴定，包括抗原结合及抑制细胞增殖、 迁移和克隆形成；
[0018] 5)抗IGF-1R抗体LMAbl体内抑瘤活性的鉴定。
[0019] 下面参照上述步骤详细描述抗IGF-1R人源抗体LMAbl的设计及制备过程。设计 及制备本发明抗体的方法仅仅是说明相关方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的 方法，或者采用修改的方法。
[0020] 1)利用全人源天然抗体库筛选获得抗IGF-1R抗体LMAbl基因序列。
[0021 ] 基于已建立的大容量全人源抗体库，利用细胞筛选方法筛选阳性结合的克隆，并 经测序获得抗IGF-1R人源抗体序列。
[0022] 2)设计相应的引物，构建抗IGF-1R抗体LMAbl真核表达载体。
[0023] 根据获得的抗体LMAbl轻重链可变区基因序列，设计相应的突变引物，在重链可 变区基因两端分别引入Pvu II和BstE II位点，轻链可变区基因两端分别引入EcoRV和 Xho I位点，利用PCR技术合成LMAbl轻重链可变区基因；经酶切、链接构建抗IGF-1R抗体 LMAbl真核表达载体，进行序列测定。
[0024] 3)抗IGF-1R抗体LMAbl的真核表达及纯化；
[0025] a)抗体LMAbl的表达：大量制备克隆了抗体LMAbl轻重链基因的真核表达质粒， 通过脂质体转染方法瞬时转染真核表达细胞，培养足够长时间候后收获上清，上清中含有 目的抗体。
[0026] b)LMAbl的纯化：利用Protein A/G亲和层析法获得纯化抗体LMAbl。
[0027] 4)抗IGF-1R抗体LMAbl体外生物学活性的鉴定，包括抗原结合及抑制细胞增殖、 迁移和克隆形成。
[0028] a)体外LMAbl结合IGF-1R细胞：收集膜IGF-1R阳性的细胞，加入梯度稀释的 LMAbl抗体，冰上孵育0. 5h，洗涤后再加入PE标记的荧光标记的羊抗人二抗，以确定抗体 LMAbl的膜抗原结合能力。
[0029] b)细胞增殖抑制试验：收集细胞，重悬计数，调整细胞浓度至2X104/ml，96孔板 中加入细胞，每孔50 μ 1，同时加入梯度稀释的LMAbl抗体50 μ 1，继续37°C培养72h。每孔 加 10 μ 1CCK-8,测 0D450 值。
[0030] C)细胞迁移试验：重悬计数，调整细胞浓度至3 X 105/ml，取250 μ 1细胞加入迁移 板上室，板下部加750 μ 1含不同浓度LMAbl抗体的培养基。37°C培养24h，用棉签擦净上室 底部细胞，固定并染色，水洗晾干，小心取下室膜，镜检计数。
[0031] d)细胞克隆形成试验：依次配制0.6%上层胶、1.2%下层胶、2XDMEM，下层胶 1. 5ml/孔加入6孔板，4°C放置15min使其凝固。细胞消化、计数并稀释为IX 104/ml。配 制上层胶液（含细胞液0. 4ml)，铺入之前的6孔板，lml/孔，4°C 20min，每孔再加500 μ 1培 养基，需要加 LMAbl的样品，每层胶层及培养基均加抗体。37°C培养2周，加200 μ 1/孔ΜΤΤ 染色并计数。
[0032] 5)抗IGF-1R抗体LMAbl体内抑瘤活性的鉴定。
[0033] 收集细胞，计数并调整至lXl〇7ml。BALb/c裸鼠脂肪垫注射细胞悬液100μ 1/ 点，1周后可见肿瘤。尾静脉注射不同量的LMAbl抗体，对照组给予生理盐水。每周两次测 量并计算小鼠瘤体积，记录体重和死亡率。
【附图说明】
[0034] 图1流式细胞术鉴定LMAbl的膜抗原结合能力。LMAbl稀释后（0. 12ng/ml~2 μ g/ ml)，与膜IGF-1R阳性的卵巢癌细胞系SK0V3及SK0V3-T(IGF-1R阳性率略强于SK0V3)孵 育。结果显示，LMAbl能够与细胞特异性结合，且这一结合呈剂量依赖性。
[0035] 图2CCK-8法鉴定LMAbl体外抑制IGF-1R阳性细胞系增殖的功能。A :LMAbl抑制 乳腺癌细胞系MCF-7细胞的增殖。结果显示，LMAbl能够抑制MCF-7细胞的增殖，且抑制 效应呈一定的剂量依赖性。当抗体浓度为50 μ g/ml时，细胞活率为正常细胞的约60% ;B :LMAbl抑制SK0V3-T细胞的增殖。结果显示，LMAbl能够抑制SK0V3-T细胞的增殖，且抑制 效应呈一定的剂量依赖性。当抗体浓度为2 μ g/ml以上时，细胞活率即降至正常细胞的约 75%。
[0036] 图3Transwe 11法鉴定LMAb 1抗体抑制SK0V3-T细胞迁移的功能。细胞加入 Transwell板上室，板底加750 μ 1含LMAbl的培养基。染色后取随机取3个视野镜检计 数。结果显示，LMAbl能够抑制细胞的迁移，当抗体浓度为100 μ g/ml时，迁移细胞数降低 约 75%。
[0037] 图4软琼脂克隆形成法鉴定LMAbl抗体抑制SK0V3-T细胞克隆形成的能力。上层 胶中的细胞会形成肉眼可见的克隆，而加入LMAbl的样品孔中克隆明显减少。当抗体浓度 为50 μ g/ml时，形成的克隆数较少了约25%。
[0038] 图5体内移植瘤试验鉴定LMAbl的抑瘤能力。A :裸鼠移植瘤体积；B :小鼠存活率。 裸鼠脂肪垫注射细胞后1周成瘤，尾静脉给予LMAbl抗体治疗，可见抗体与Herceptin联 用能够抑制小鼠移植瘤的生长（A)，并且可以降低小鼠死亡率（B)。Tras :trastuzumab (即 Herceptin) ;N. C :对照组，即用生理盐水治疗组。
【具体实施方式】
[0039] 实施例一抗IGF-1R抗体LMAbl的真核表达、纯化及初步鉴定
[0040] 一、材料
[0041] 抗体真核表达载体pTGS-FRT-DHFR由本室构建并申请国家专利（专利授权号： ZL200510064335. 0);引物应用biosun软件设计，由上海英骏生物技术有限公司合成；脂质 体lipofectamin2000购自Invitrogen ;ProteinA/G亲和纯化柱购自GE公司；羊抗人IgG、 辣根酶标记的羊抗人IgG、人IgG等购自中杉金桥；内切酶为NEB公司产品；其他试剂为市 购产品。
[0042] 二、方法
[0043] 1、抗体的表达
[0044] 1. 1抗体真核表达载体的构建
[0045] 选择能够获得的含有人IgGl抗体恒定区基因