整合素αVβ8中和抗体的制作方法

整合素αVβ8中和抗体的制作方法
【专利说明】整合素 α νβ 8中和抗体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2010年2月18日提交的第61/305, 749号美国临时申请以及2010年 12月30日提交的第61/428, 814号美国临时申请的优先权，上述申请的公开内容以其整体 并入本文作为参考。
[0003] 对于在联邦政府资助的研究和开发下完成的发明的权益声明
[0004] 在国立卫生研究院授予的批准号HL63993、NS-44155、U01AI075443下，通过政府 的支持完成本发明。政府具有本发明的某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] 多功能细胞因子转化生长因子(TGF-β )在无脊椎动物和脊椎动物物种的发 育和成年生活期间的免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞和间质细胞的生物学中起到重要作用。 在哺乳动物中，这些功能通过三种异构体，即TGF-β 1、2和3来介导，所述三种异构体各自 被广泛地表达。所有三种异构体与相同的细胞表面受体（TGFBR2和ALK5)相互作用，并通过 相同的细胞内信号转导通路而信号转导，所述通路包括规范的（即SMAD)或非规范的（即 MAPK、JUN、PI3K、PP2A、Rho、PAR6)信号转导效应器。已经非常集中地研究了规范TGF-β信 号转导通路，借此通过细胞质SMAD-2/3的磷酸化、与SMAD-4的复合物形成、SMAD-2/3/4复 合物的核转运以及与位于纤维发生反应所涉及的许多基因的启动子区域的SMAD反应元件 结合，从TGF-β受体装置传播TGF-β信号转导。然而，尽管具有相似的信号转导伙伴，但 每一异构体提供单独的生物功能，可能归因于与TGF-β受体的结合亲和力、激活机制、信 号转导强度或持续时间、或者空间和/或时间分布的差异。
[0007] TGF-β异构体、受体和信号转导介体以及靶向所有TGF-β异构体的功能阻断剂 的敲除和条件缺失模型已经揭露了 T细胞、心脏、肺、血管和腭部发育中的TGF-β的重要作 用。例如，在TGF-β 1中存在缺陷的小鼠由于卵黄囊血管形成而在子宫内死亡，或者出生并 存活为成年寿命，但出现严重的多器官自身免疫。TGF-β信号转导介体的基因缺失已表现 出在早期模式形成（patterning)和中胚层形成中Smad2的重要作用，并且缺少Smad3的小 鼠是有生命力并可育的，但表现出肢体畸形、免疫调节异常、结肠炎、结肠癌和齿槽肥大。在 成年组织中，TGF-β通路被认为调节免疫细胞、间质细胞和上皮细胞的动态相互作用以保 持对环境胁迫的内稳态。
[0008] 由TGF-β介导的正常内稳通路在对长期重复损伤的反应中受到扰乱。对于损伤， TGF- β变为主要的促纤维化细胞因子，通过抑制上皮增殖和迀移并且促进细胞死亡来延迟 上皮创伤康复，以及通过诱导纤维原细胞补充、纤维原细胞收缩和细胞外基质沉积来扩张 间质室。实际上，腺病毒重组TGF-βΙ向啮齿动物肺部的气管内转移显著增加了气道周围 和肺间质中的纤维原细胞积聚以及I型和III型胶原的表达，并且中和抗-TGF-β抗体能 阻断实验性博来霉素或辐射诱导的肺纤维化。
[0009] TGF-β通路的增加的活性还涉及纤维化肺病、肾小球硬化症和心血管再狭窄。大 多数TGF-β介导的病理学变化可能归因于TGF-β 1异构体。由具有在TGF-β 1自身或其信 号转导效应器中广泛的或细胞类型特异性的增强或缺陷的遗传病症来说明人类的TGF-β 1 功能的复杂性。增加 TGF-β通路活性的突变导致骨代谢（即，Camurati-Engelmann疾病） 和结缔组织（即，Marfan综合征）以及主动脉瘤（即Loeys-Dietz综合征）的缺陷，而导 致TGF-β通路的降低活性的突变与癌症发生和预后相关。然而，TGF-β作为癌症的肿瘤 抑制剂的作用并非明确的，因为TGF-β也能通过其在免疫抑制、细胞侵袭、上皮-间质转化 或血管生成中的作用而增强肿瘤生长和转移。
[0010] 尽管TGF-β的多种重要功能，但单一剂量或短期给药泛-TGF-β中和抗体已被报 道在抑制器官纤维化或实验性癌细胞生长和转移的剂量下完全耐受，并且未报道在成年小 鼠和大鼠中的副作用。该治疗已表明在抑制实验性纤维化中的治疗效能。由于这些有希望 的结果，对于转移性肾细胞癌、黑素瘤、局灶性节段性肾小球硬化和特发性肺纤维化，已经 进行或者正在进行使用中和泛-TGF-β抗体的单剂量I/II期临床试验（Genzyme Corpora tion, genzymeclinicalresearch. com,最近的访问于 2009 年 8 月 27 号）。TGF-β 通路对 最小化全身作用的仔细靶向是高度期望的目标。
[0011] 发明简述
[0012] 本发明涉及通过向有需要的个体给予整合素 ανβ 8的拮抗剂而降低个体、例如 人类或非人类中TGF0激活的方法，由此降低个体中的TGF0激活。在一些实施方案中， 拮抗剂降低TGF0激活（例如，切割潜态TGF0由此释放成熟的活性TGF0肽的蛋白酶募 集），但未显著抑制α ν β 8对TGF β的粘附（例如，在细胞表面上表达的α ν β 8对与细胞 基质相关的潜态TGF β的粘附）。
[0013] 在一些实施方案中，拮抗剂为抗体。因此，本发明提供了分离的抗体，其抑制活 性的成熟TGF0肽的释放（TGFi3激活），但未显著抑制TGF0对在ανβ8表达细胞上的 ανβ8的粘附。在一些实施方案中，抗体特异结合至ανβ8,例如特异结合至β8。在一 些实施方案中，抗体结合至在SEQ ID Ν0:11内的β 8上的表位。在一些实施方案中，表位 包括至少一个选自以下的氨基酸：人类β 8的氨基酸1125、R128、R175、F179和F180。在 一些实施方案中，抗体结合至少一个选自以下的氨基酸：人类β 8的氨基酸R79、185、S95、 Ρ100、1108、Ρ109、R128、Η140和F179。在一些实施方案中，抗体结合至少一个选自以下的 氨基酸：人类0 8的氨基酸174、呢8、11〇7、111〇、1125、1?175和？18〇。在一些实施方案中， 抗体结合人类β 8,而非小鼠 β 8。在一些实施方案中，抗体降低TGF0激活，但未显著抑制 α ν β 8-介导的细胞对TGF β的粘附。
[0014] 在一些实施方案中，抗体与具有轻链可变区域和重链可变区域的抗体竞争与 ανβ8的结合，其中所述重链可变区域包括SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6和SEQ ID Ν0:7的 三个重链CDR，所述轻链可变区域包括SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID Ν0:10的三个轻 链CDR。在一些实施方案中，抗体具有轻链可变区域和重链可变区域，其中所述重链可变区 域包括SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7的三个重链CDR，所述轻链可变区域包 括SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10的三个轻链CDR。例如，在一些实施方案中， 抗体具有SEQ ID N0:3或4的轻链可变区域和SEQ ID N0:1或2的重链可变区域。本发明 的抗体的具体实例包括具有SEQ ID N0:3轻链可变区域和SEQ ID NO: 1重链可变区域的抗 体，并且抗体具有SEQ ID N0:4轻链可变区域和SEQ ID N0:2重链可变区域。
[0015] 抗体能具有多种同种型，例如IgGl、IgG2、IgG2a、IgG3或IgG4。能使用单克隆或 多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为人类、人源或嵌合抗体。
[0016] 本发明还提供了适于编码本发明抗体的分离的核酸、一个载体或多个载体以及宿 主细胞。
[0017] 本发明还涉及包含本发明抗体和药物可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施 方案中，药物组合物为用于诊断的，例如包含标记抗体。在一些实施方案中，药物组合物为 用于治疗的。
[0018] 在一些实施方案中，抗体用于检测，例如体内或体外测定的β 8的存在。在这类 实施方案中，抗体由可检测部分直接或间接地标记。因此，在一些实施方案中，本发明提供 给了测定生物样本（体外或体内）中整合素 β 8存在的方法，其包括使生物样本与本发明 的标记抗体接触，并且测定标记抗体的存在，由此测定整合素 β 8的存在。在一些实施方 案中，所述方法用于诊断疾病状态，所述疾病状态选自关节炎、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、 哮喘、纤维化病症、炎性大脑自身免疫性疾病、多发性硬化、脱髓鞘疾病（例如，横贯性脊髓 炎、德维克病、格林-巴利综合征）、神经炎症、肾疾病、腺癌、鳞状细胞癌、胶质瘤、乳腺癌以 及癌症生长和转移。
[0019] 本发明还涉及表达人类整合素 β 8的转基因小鼠。在一些实施方案中，本发明的 转基因小鼠不表达小鼠整合素 β 8。
[0020] 本发明的组合物和方法能用于降低个体中TGFi3激活，所述个体患有选自以下的 一种或多种疾病状态：关节炎、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、哮喘、纤维化病症、炎性大脑自 身免疫性疾病、多发性硬化、脱髓鞘疾病（例如，横贯性脊髓炎、德维克病、格林-巴利综合 征）、神经炎症、肾疾病、腺癌、鳞状细胞癌、胶质瘤、乳腺癌以及癌症生长和转移，并且其中 TGF0降低导致疾病状态的改善。在一些实施方案中，纤维化病症为气道纤维化、特发性肺 纤维化、非特异性间质性肺炎、感染后肺纤维化、弥漫性肺泡损伤、胶原血管疾病相关的肺 纤维化、药物诱导的肺纤维化、矽肺、石棉相关的肺纤维化、呼吸性细支气管炎、呼吸性细支 气管炎性间质性肺炎、脱肩性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、慢性过敏性肺炎、药物相关 的肺纤维化、肾纤维化或肝纤维化。
[0021] 发明详述
[0022] 简介
[0023] 本发明部分基于下述发现，即某些抗-α v β 8拮抗剂、抗-α v β 8抗体或免疫结合 物选择性地扰乱α ν β 8介导的TGF- β激活，但未扰乱α ν β 8-表达细胞对固定的TGF- β 的粘附。因此，本发明提供给了通过向有需要的个体给予ανβ 8拮抗剂（例如，小分子、 抗-α ν β 8抗体或免疫结合物）而降低个体中TGF β激活的方法，由此降低个体中TGF β 激活。本发明还提供了新的具有轻链可变区域和重链可变区域的抗体，其中所述重链可变 区域包括SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6和SEQ ID Ν0:7的三个重链CDR，所述轻链可变区域 包括 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID 勵：10的三个轻链〇?。
[0024] 定义
[0025] 术语"整合素 β 8"与itgb8、ITGB8、β 8等术语可交换地使用。ITGB8通常用于指 人类序列，而itgb8是指小鼠序列。人类蛋白序列能在Uniprot登记号Ρ26012中找到，而 小鼠序列具有Uniprot登记号Q0VBD0。
[0026] "拮抗剂"所指的作用剂具有抑制本发明的多肽或多核苷酸的表达或与本发明多 肽或多核苷酸结合，部分或全部阻断本发明多肽或多核苷酸的刺激，降低、防止、延迟本发 明多肽或多核苷酸的激活，失活、脱敏或下调本发明多肽或多核苷酸的活性。拮抗剂能中和 活性（例如，通过天然配体来防止结合和激活）或积极地降低活性。
[0027] 在两个或多个核酸或多肽序列的语境中的术语"同一的"或"同一性"是指相同 的或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸（即，当在比较窗口或指定区域上比较或 比对最大对应时，为约60%同一性，优选65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99 %或更高的同一性）的两个或多个序列或子列，如使 用具有下述缺省参数的BLAST或BLAST 2. 0序列比较算法或通过人工算法和目测（参见， 例如NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等）所测量的。那么，将这类序列称为"基本 同一的"。本发明提供了例如具有多核苷酸或多肽序列的抗体，所述序列与对照序列（例 如 SEQ ID N0s:l-10)相比具有至少 80% 同一性，优选 85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。该定义还指测试序列的补体或可以用于测试 序列的补体。定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些。如下所述，优 选的算法能解释缺口等。优选地，在至少约25个氨基酸或核苷酸长的区域内存在同一性， 或者更优选地在50-100个氨基酸或核苷酸长的区域内存在同一1性。
[0028] 对于序列比较，通常，一个序列用作参照序列，测试序列与其比较。当使用序列比 较算法时，将测试和对照序列输入计算机，然后指定坐标（若需要），并且指定序列算法程 序参数。优选地，能使用缺省程序参数，或者能指定可替换的参数。然后，序列比较算法基 于程序参数计算测试序列相对于对照序列的序列同一性百分数。
[0029] 如本文所用，"比较窗口"包括与连续位置数的任一个的片段的对照，所述连续 位置数选自20至600,通常约50至约200,更通常约100至约150,其中序列可以在将 两个序列最佳比对之后与相同的连续位置数的对照序列比较。用于比较的序列比对方 法在本领域中公知。能例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl. Math. 2:482(1981)的局部 同源算法、通过Needleman&Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源比对算法、通过 Pearson&Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)的对于相似性方法的研究、 通过这些算法的电脑化实施（在Wisconsin Genetics软件包中的GAP, BESTFIT, FASTA和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Dr·, Madison, WI)或者通过人工比对和目 测（参见，例如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人编辑，1995 增 刊））来进行用于比较的最佳序列比对。
[0030] 适于测定序列同一性百分数的算法和序列相似性为BLAST和BLAST 2. 0算法，其 分别在 Altschul 等人，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)中描述。使用具有本文所述参数的BLAST和BLAST 2.0以测定本 发明的核酸和蛋白的序列同一性百分数。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中 心（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)而为公开可得的。该算法包括通过确定查询序列中 长度W的短字段来首先确定高分序列对（HSP)，所述查询序列当与数据库序列的相同长度 的字段比对时匹配或满足某些正-阀值分数T。T称为邻域字段分数阀（Altschul等人，同 上）。这些初始的邻域字段匹配用作开始搜索的种子以找到包含它们的更长的HSP。字段匹 配在沿每一序列的两个方向上延伸，直到能增加累积比对分数。对于核苷酸序列，使用参数 M(匹配残基的对的奖励分数；通常>0)和