域（LAP))的非 共价相互作用而保持为失活形式。整合素 a v β 8与TGF- β的LAP结合，并且介导TGF- β 1 和3的激活。种系或条件基因缺失研究已经显示整合素 ανβ 8-介导的TGF-β激活对于 TGF-β的体内激活是必要的，因此，ανβ8是TGF-β功能的"守门者"。特别地，整合素 α ν β 8-介导的TGF- β激活可能涉及C0PD、肺纤维化、肾纤维化、炎性大脑自身免疫性疾病 (多发性硬化和脱髓鞘疾病）、神经炎症、肾疾病以及癌症生长和转移的发病机理。总言之， 整合素为粘附分子并且介导细胞与细胞外基质蛋白的连接。克隆37Ε1是不同的，因为其选 择性扰乱α ν β 8-介导的TGF- β激活但未扰乱α ν β 8与固定或分泌的TGF- β的结合。这 提供了在仅扰乱ανβ8_介导的TGF-β激活但未扰乱细胞粘附性质中的高度选择性，细胞 粘附性质可能是不期望被抑制的。此外，TGF-β的总体失活可能具有不期望的副作用，因 为TGF-β是必要的内衡上皮的和免疫的效应器。
[0132] 实施例3.抗体37Ε1Β5
[0133] 我们已经工程化了克隆37Ε1的重链和轻链的可变区域，并且在酵母展示系统中 使用随机诱变和链替换以得到更高亲和力的抗体。我们已鉴定对相同的抗原给予更高亲和 力的特异性氨基酸取代，并且我们已经根据功能广泛地分类了这些突变。这些突变体中的 一种被称为37Ε1Β5。其表现出体外增加的亲和力和在培养细胞中抑制整合素 α νβ 8-介导 的TGF-β激活方面的更强效力。体外37Ε1Β5抗体的有效治疗剂量为皮摩尔范围。为了更 好的诊断和治疗应用，我们建立了 37Ε1Β5的三种版本：小鼠 IgGl、小鼠 IgG2a和部分人源 IgGl。全部在转化的CH0细胞中产生。
[0134] 实施例4. ITGB8BAC转基因小鼠的产生
[0135] 我们已经建立了表达人类β8的人源BAC转基因小鼠，并使其与β8敲除小鼠杂 交以免受鼠科整合素 ανβ 8缺失的致命影响。该人源小鼠将用于检测在肺、脑、肝和肾疾 病模型中的高亲和力克隆的毒性和效力。
[0136] 以细菌穿刺培养物形式（Children' s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA)获得包含ITGB8基因的各个5'和3'侧翼区的723155'和30, 6833' 的克隆RP11-431K20。将平皿（具有氯霉素的LB，12. 5 μ g/ml)划线并使用采用设定为5' 和3' BAC末端的引物的克隆PCR来选择克隆。在5'和3'末端、第一内含子中的5' UTR、 第9内含子与第10外显子/内含子区域之间的第9外显子确定序列。使单独的克隆生长 并且分离BCA质体DNA(Nucleobond)。使用PI-Sce (NEB)线性化质体，在NAP5柱纯化，并 经过脉冲场电泳以确认DNA的浓度和完整性。将DNA注入UCSF癌症中心转基因设备中的 FVB/N胚胎中。从超过两百个的注射胚胎获得24个幼兽，其中使用5'和3'BAC末端引物， 通过尾部DNA PCR，4个被确定为首建者。
[0137] 这些系中的三个（B、C和D)提供了种系传播。系B、C和D已经与被工程化具有一 个itgb8等位基因敲除的itgb8C57B/6小鼠杂交。F2代已经被杂交以获得基于itgb8-/_背 景的ITGB8BAC转基因小鼠。
[0138] 这些小鼠（系B、C和D)在3或6月龄表现出没有总表型畸形。这些结果表明所 有必要的调节元件被限制于BAC RP11-431K20中包含的上游和下游元件，以提供适当的组 织表达，从而拯救itgb8-/_小鼠的致命表型。这些小鼠还提供了测定生物标记物的实验系 统，进一步研究体内降低机制，模拟人类疾病并且测试针对a v β 8-介导的TGF- β激活的 治疗效果。
[0139] 实施例5.中和抗-整合素 β 8降低Coll
[0140] 增加的ECM产生和增加的纤维原细胞收缩性是在气道壁增厚中所观察到的纤维 化反应的特点，并且增加的I型胶原（Col I)和增加的SMA(a SMA)是该反应的关键生物化 学标记物。为了评价自分泌ανβ8_介导的TGF-β激活对促纤维化纤维原细胞表型的贡 献，我们使用中和抗-β8。TGF-β的自分泌ανβ8-介导的激活影响成肌纤维细胞表型， 因为使用β 8阻断抗体处理气道纤维原细胞抑制了 a SMA表达和Col I分泌。气道纤维原 细胞与鳞状化生人类支气管上皮细胞的共培养导致由气道纤维原细胞引起的Col I转录和 蛋白产生增加。胶原的增加的产生为IL-Ιβ-和纤维原细胞β 8-依赖的。通过与鳞状化 生人类支气管上皮细胞的共培养而诱导的Col I表达的增加能通过与IL-1RA的共培养处 理或通过由β 8siRNA转染气道纤维原细胞而几乎完全被抑制。
[0141] 实施例6. 37E1B5表位的表征
[0142] 将小鼠序列交换入人类ITGB8的嵌合整合素 β 8结构被用于定位37E1B5结合表 位。通过抗体结合、细胞表面染色以及流式细胞仪的测定来定位表位。37Ε1Β5表位被包括 在人类整合素 β 8的氨基酸74-180内。37Ε1Β5与人类β 8结合，而不与小鼠 β 8结合。因 此，9个非保守氨基酸差异或7个较小的氨基酸差异（由序列中线的+来表示）中的至少一 个包括在结合表位中。这些结构域反映的部分在本领域中已知为整合素 β 8亚基的β-Ι 结构域的η、混合型和a 1螺旋，并在分子表面上发现。
[0143] M itgb8 74 VSGGSGSERCDTVSSLISKGCPVDSIEYLSVHVVTSSENEINTQVTP 120
[0144] +SGGS SERCD VS+LISKGC VDSIEY SVHV+ +ENEINTQVTP
[0145] H ITGB8 74 ISGGSRSERCDIVSNLISKGCSVDSIEYPSVHVIIPTENEINTQVTP 120
[0146] M itgb8 GEVSVQLHPGAEANFMLKVRPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSKKMALY 180
[0147] GEVS+QL PGAEANFMLKV PLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLS+KMA+
[0148] H ITGB8 GEVSIQLRPGAEANFMLKVHPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSRKMAFF 180
[0149] SEQIDN0:ll表示人类整合素 β8的区域，其包括37ElB5表位（氨基酸74-180)。 SEQ ID NO: 12表示同源鼠科序列，其不与37E1B5抗体结合。在鼠科序列的位置140的R为 多态的，并且还能为H。
[0150] 我们在该区域内进行了进一步的结构域替换研究，将鼠科序列替换为人类，以测 定哪一个氨基酸包括在37E1B5表位中。我们发现替换整合素 β 8的氨基酸125-180显著 降低了 37Ε1Β5结合。因此，在人类整合素 β8上的表位包括选自1125、1?128、1?175、？179和 F180的至少一个氨基酸。
[0151] 实施例7 :coro纤维原细胞中的整合素 β 8表达
[0152] 我们发现在来自人类coro患者的肺部的纤维原细胞中增加整合素 β 8表达，如通 过组织染色和原代培养所示。此外，与来自正常患者的纤维原细胞相比，从患有特发性肺纤 维化的患者分离的纤维原细胞中显著增加了整合素 β8表达。我们还已经发现与正常肺纤 维原细胞相比，C(PD纤维原细胞已增加了 IL-1 β -依赖性整合素 α ν β 8蛋白表达。这些 数据表明在ανβ8是IL-Ιβ的下游靶标和病理学调节剂的效果。
[0153] 在其中表达整合素 β 8的疾病中，能治疗地和诊断地使用37Ε1Β5抗体，并且 IL-1 β和/或TGF- β起到病理学作用。
[0154] 实施例8 :整合素 β 8中和抗体降低诱导的气道炎症
[0155] 我们使用人类BAC克隆RP11-431Κ20,生产三系的BAC转基因小鼠。这些小鼠繁衍 具有小鼠 itgb8的一种功能等位基因的小鼠，以产生具有人类ITGB8和小鼠 itgb8的一个 功能拷贝的F1代小鼠。这些小鼠杂交繁衍以产生F2代，其导致可存活的BAC ITGB8,即具 有基因的人类拷贝的itgb8-/_小鼠，表明itgb8-/_致命性的拯救。
[0156] 使用气管内腺病毒-IL-Ιβ递送模型，将这些小鼠用于诱导气道重塑。在该腺病 毒-IL-1 β -诱导的气道壁炎症模型中，具有与人类慢性阻塞性肺疾病类似的免疫学谱的 强烈的气道重塑被可再生地诱导。
[0157] 我们发现37Ε1Β5抗体在7mg/kg剂量下显著阻断气道炎症，并且显著降低支气管 肺泡灌洗中的中性粒细胞。在组织结构上，由37E1B5显著降低气道壁炎症和纤维化。这些 数据补充了表明itgb8的纤维原细胞-特异性缺失能显著抑制腺病毒-IL-1 β -诱导的气 道重塑的其他数据。
[0158] 我们还发现过敏性气道重塑（卵清蛋白-诱导的气道炎症、纤维化和粘液化生） 在具有itgb8的纤维原细胞-特异性缺失的小鼠中被显著减少。过敏模型还依赖于IL-1 β 和TGF-β。这些数据表示itgb8在放大其中IL-Ιβ和TGF-β发挥作用的病理学固有性和 适应性免疫反应中的一般作用。IL-Ιβ导致多细胞类型中的整合素 β 8的增加，包括来自 气道和肺部的纤维原细胞以及星形胶质细胞。在小鼠和人类中观察到该IL-Ιβ诱导的整 合素 β 8表达。
[0159] 实施例9 :人类关节软骨细胞表达整合素 α ν β 8
[0160] 从进行慢性骨关节炎的膝盖选择性修复的患者的膝盖关节间隙收集成年关节软 骨。原生软骨细胞生长至70 %的汇合，并且通过细胞染色和流式细胞仪检测整合素受体 表达。使用的抗体为抗-β8(37Ε1Β5)和抗-β6(Ε7Ρ6)。用37Ε1Β5检测到强烈的染色， 而用Ε7Ρ6观察到没有染色。在存在和不存在抗-β8(37Ε1Β5)或中和抗-β6的情况下， 在TGF-β生物分析中用TMLC TGF-β受体细胞共培养原生软骨细胞（Annes等人（2004) J. Cell Biol. 165:723)。抗-β 8产生TGF-β激活的强烈阻断，同时抗-β 6没有产生这类 效果。
[0161] 结果表明不仅在软骨细胞中表达ανβ8,而且该表达导致TGF0激活。因此， α νβ 8的抑制能用于治疗与激活的TGF0相关的软骨病症，例如关节炎和滑膜纤维化（参 见，例如 Bakker 等人（2001)Osteoarthritis and Cartilage 9:128)〇
[0162] 应理解本文所述的实施例和实施方案仅为例示目的，并且基于它们的各种修改或 改变将启发本领域技术人员，并且包括在本申请的精神和范围以及随附的说明书的范围 内。本文引用的所有公开、专利和专利公开以它们整体形式通过参考并入本文，以用于所有 目的。
【主权项】
1. 特异性结合ανβ8的分离的抗体，其中所述抗体抑制活性的成熟TGF0肽的释放， 但未显著抑制潜态TGFβ与ανβ8-表达细胞上的ανβ8的粘附，其中所述抗体结合SEQ IDNO: 11内的表位，以及所述抗体对人整合素β8的亲和力高于具有包含SEQIDNO: 1的 重链可变区和包含SEQIDN0:3的轻链可变区的抗体对人整合素β8的亲和力。2. 如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体的同种型为IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4〇3. 如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。4. 如权利要求1所述的分离的抗体，所述抗体是人源抗体或嵌合抗体。5. 药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体以及药物可接受的赋形剂。6. 分离的核酸，其编码权利要求1所述的抗体。7. 分离的表达载体，其包含权利要求6所述的核酸。8. 分离的宿主细胞，其包含权利要求7所述的载体。9. 权利要求1-4中任一项所述的抗体在制备用于降低有需要的个体的TGFβ激活的药 物中的用途。10. 如权利要求9所述的用途，其中所述个体为人类。11. 如权利要求9所述的用途，其中所述个体患有选自以下的至少一种疾病状态：慢性 阻塞性肺疾病（C0PD)、哮喘、关节炎、纤维化病症、炎性大脑自身免疫性疾病、多发性硬化、 脱髓鞘疾病、神经炎症、肾疾病、以及癌症生长和转移，并且其中TGF0降低导致所述疾病 状态的改善。12. 如权利要求9所述的用途，其中所述个体患有选自以下的至少一种疾病状态：腺 癌、鳞状细胞癌、胶质瘤和乳腺癌。13. 如权利要求11所述的用途，其中所述脱髓鞘疾病选自横贯性脊髓炎、德维克病和 格林-巴利综合征。14. 如权利要求11所述的用途，其中所述纤维化病症选自气道纤维化、特发性肺纤维 化、非特异性间质性肺炎、感染后肺纤维化、弥漫性肺泡损伤、胶原血管疾病相关的肺纤维 化、砂肺、石棉相关的肺纤维化、呼吸性细支气管炎、呼吸性细支气管炎性间质性肺炎、脱肩 性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、慢性过敏性肺炎、药物相关的肺纤维化、肾纤维化和肝 纤维化。15. 如权利要求11所述的用途，其中所述纤维化病症为药物诱导的肺纤维化。16. 连接于可检测标记的权利要求1-4中任一项所述的抗体用于形成标记抗体的用 途，其中所述标记抗体用于测定来自个体的生物样品中整合素β8的存在。17. 如权利要求16所述的用途，其中所述标记抗体用于检测选自以下的疾病状态：慢 性阻塞性肺疾病（C0PD)、哮喘、关节炎、纤维化病症、炎性大脑自身免疫性疾病、多发性硬 化、脱髓鞘疾病、神经炎症、肾疾病、以及癌症生长和转移。18. 如权利要求16所述的用途，其中所述标记抗体用于检测选自以下的疾病状态：腺 癌、鳞状细胞癌、胶质瘤和乳腺癌。19. 如权利要求17所述的用途，其中所述脱髓鞘疾病选自横贯性脊髓炎、德维克病和 格林-巴利综合征。
【专利摘要】本发明涉及用于降低个体中TGFβ激活的αvβ8拮抗剂、抗-αvβ8抗体或免疫结合物。还提供了组合物，其包含αvβ8拮抗剂、抗-αvβ8抗体或免疫结合物中的一种，使用所述组合物的方法以及相关内容。
【IPC分类】A61P13/12, A61P35/00, A61P11/06, G01N33/574, A61P19/02, A61K39/395, A61P37/02, C07K16/22, A61P25/00, G01N33/68, A61P11/00, A61P1/16, A61P37/08
【公开号】CN105315370
【申请号】CN201510810531
【发明人】斯蒂芬·尼什穆拉, 楼建龙, 乔迪·林恩·巴荣, 詹姆士·D·马可斯
【申请人】加利福尼亚大学董事会
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2011年2月18日
【公告号】CA2790488A1, CN102834412A, CN102834412B, EP2536762A2, EP2536762A4, US9290572, US20130064837, US20160137737, WO2011103490A2, WO2011103490A3