随后，包括MMP-2、MMP-9、胞浆 素、钙蛋白酶、胃促胰酶和弹性蛋白酶在内的许多其他蛋白酶已被描述为潜态TGF0激活 剂（Koli 等人（2001))。
[0075] 潜态TGF β激活的第二机制包括在包含TSP-1受体以及⑶36以及在某些情况下 包含胞衆素的多分子复合物中，基质细胞（matricellular)蛋白血小板反应蛋白（TSP-1) 与潜态TGF β的相互作用。潜态TGF β激活包括TSP-1和LAP之间的直接相互作用，并且 包括TSP-1型1重复中得到的三肽序列RFK。该肽认为与LAP氨基端中的保守四肽LSKL 相互作用，分裂LAP和TGF-β之间的非共价关联。四肽KPFK将体外和体内激活TGF-β， 而过量的LAP肽（LSKL)的添加阻断潜态TGF-β激活。对于增强的炎症，TSP-1-/-小鼠 表现出与TGF-β 1-/-小鼠的部分重叠的表型。向野生型小鼠给予LSKL阻断肽诱导与在 TGF- β -/-动物中观察到的类似的胰腺和肺病理学，而向TSP-1-/-小鼠添加 KRFK激活肽使 表型向正常状态返回。然而，TSP-1-/-小鼠的表型既未复制TGF-β 1-/-小鼠的全部表型， 也未使TSP-1-/-表型与TGF- β 2-/-或TGF- β 3-/-小鼠的任何表型相类似。这些差异再 次表明对于激活潜态TGF-β，可以存在多个且同种型特异性机制。
[0076] 潜态TGF- β能通过弱酸（pH 4. 5)激活，所述弱酸可能打破LAP和TGF- β之间的 相互作用。然而，除了特殊的情况，例如在骨吸收期间由破骨细胞形成的细胞外区室，可能 很少在体内的细胞外区室中形成该pH。因此，pH不太可能是TGF-β激活的通用机制。
[0077] TGF- β 1和β 3前肽（而非TGF- β 2前肽）包含整合素识别序列R⑶。TGF- β 1 和TGF- β 3LAP与表达整合素 ανβ1和ανβ5的细胞相互作用。尽管潜态TGF- β与这些 整合素的结合未导致激活，但潜态TGF-β与ανβ6的结合导致激活（Munger等人（1999) Cell 96:319)。由a v β 6激活潜态TGF- β 1或β 3需要RGD序列作为包含不能被激活的 RGE的TGF-β 1或β 3的突变形式。
[0078] 与ΜΤ1-ΜΜΡ结合的整合素 α ν β 8激活潜态TGF MMu等人（2002) J. Cell Biol. 159:493)。整合素 ανβ8主要在正常的上皮细胞（例如，气道上皮细胞）、间质细胞 和神经元组织中表达。所要考虑的独特机制是，在细胞表面上表达的ανβ 8与细胞基质中 的潜态TGF0相互作用，并且向复合物募集ΜΤ1-ΜΜΡ，其中蛋白酶切割潜态TGF0并释放活 性的成熟TGF0肽。
[0079] TGF0生物测定
[0080] 为测定共培养物分析中的TGF β激活，表达α ν β 8的试验细胞与TMLC细胞共培 养，所述TMLC细胞为由驱动荧光素酶基因的血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-1启动子 的TGF-β反应片段稳定转染的貂肺上皮细胞（Abe等人（1994)Annal Biochem 216:276)。 TMLC细胞与TGFi3高度反应，并产生非常低的TGFi3激活背景。因此，TMLC细胞能在与 其他细胞系或无细胞馏分的共培养中使用以利用荧光作为读出检测活性TGF0的存在。 在存在或不存在抗_了6?0阻断剂抗体（1〇以8/1111，1〇11;1?&〇35^丨61118)、抗-0 8(2〇4区/ ml, 37E1B5)或抗-β 6 (150 μ g/ml，10D5)的情况下进行测定，如（Abe (1994) ;Munger (1999) 所述。
[0081] 为了测量肿瘤组织中的活性TGFi3，切等重量的肿瘤组织，并在4°C下，在无菌DME 中孵育30分钟。在4°C离心（20g)之后，收集包含活性TGF0的上清液。然后，在80°C下， 在无血清DME中孵育小球20分钟以激活SLC，然后收集上清液。然后，将包含活性或热激活 (潜态）TGFi3的上清液添加至具有或不具有1D11的预接种的TMLC细胞。对于蛋白酶抑制 剂测定，在开始共培养时添加抑制剂。每一抑制剂的最大剂量被限定为不抑制TMLC细胞对 重组活性TGF0反应能力的最高浓度。为了由培养的细胞测量可溶TGF0活性，在37°C下， 将细胞在100 μ 1的具有或不具有37E1或10D5的完全培养基中孵育1小时，并且缓和地旋 转。在4°C通过离心（20g) 5分钟来收集无细胞的上清液，然后，添加至存在或不存在1D11 的预接种的TMLC细胞。对于可溶受体测定，使用从过夜培养的细胞中获得的条件培养基。 相对荧光素酶单位被定义为活性减TMLC受体细胞的背景活性。
[0082] 本发明的抗体
[0083] 本发明提供给了与整合素 ανβ 8特异性结合但不显著与其他整合素（例如， ανβ 6，ανβ3等）结合的抗体。本发明的抗体能与α ν β 8内的特定表位或表位区域结 合。表位能为构象（非线性）或非构象表位。这类抗体能仅与β 8结合，即位于β 8内的 表位。本发明的抗体的结合可能需要β8外的表位区域，例如，构象表位或依赖于αν内和 β 8内的元件的表位。
[0084] 在一些实施方案中，例如，与不存在抗体的TGF0激活相比，抗体与β 8结合并抑 制TGF0激活。在一些实施方案中，抗体不降低表达ανβ 8的细胞与TGF0的粘附，即，抗 体不降低ανβ 8-介导的与TGF0的细胞粘附。在一些实施方案中，与不存在抗体的ανβ 8 结合相比，抗体能降低可溶ανβ8与TGFP的结合。在一些实施方案中，抗体能与在SEQ ID Ν0:11内的β 8上的表位结合。在一些实施方案中，表位包括至少一个选自以下的氨基 酸：人类0 8的氨基酸1?79、185、595、？1〇〇、11〇8、？1〇9、1?128、!114〇和？179。在一些实施方 案中，表位包括至少一个选自以下的氨基酸：人类β 8的氨基酸Ι74、Ν88、Ι107、Τ110、Ι125、 R175和F180。在一些实施方案中，表位包括至少一个选自以下的氨基酸：人类β 8的氨基 酸1125、R128、R175、F179和F180。在一些实施方案中，抗体结合人类β 8而不结合小鼠 β8〇
[0085] 能使用本领域已知的方法测定针对给定抗原产生的抗体的结合位点，即表位。例 如，使用具有已知表位的抗体，能进行竞争试验（例如，竞争性ELISA)。如果试验抗体竞争 抗原结合，则其可能共享至少一部分的相同表位。使用抗原的域交换或选择性诱变，还能定 位表位。即，抗原的每一区域或每一氨基酸能被"交换"出，或由氨基酸或已知不与试验抗 体相互作用的组分取代。如果与非取代的抗体相比，给定区域或氨基酸的取代降低试验抗 体与取代的抗原的结合，则该区域或氨基酸可能包括在表位中。
[0086] 本发明提供给了选择性扰乱ανβ8_介导的TGF-β激活（例如，在细胞表面，成 熟的活性TGF β从潜态TGF β释放），但在一些实施方案中，抗体不显著干扰α ν β 8 (例如， 在α νβ 8-表达细胞上）与潜态TGFi3的粘附。通过在仅扰乱整合素 α νβ 8-介导的TGF-β 激活而不扰乱细胞粘附特性的高度选择性来表征这些抗体，其可能为不期望的抑制。一些 抗体阻断其中局部表达整合素 α νβ 8的TGF0激活。
[0087] 本发明的示例性抗体具有轻链可变区域和重链可变区域，其中所述重链可变区域 包括SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6和SEQ ID Ν0:7的三个重链CDR，所述轻链可变区域包括 SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10的三个轻链CDR。本发明的抗体还包括与具有 轻链可变区域和重链可变区域的抗体竞争与α ν β 8结合的抗体，其中所述重链可变区域 包括SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6和SEQ ID Ν0:7的三个重链CDR，所述轻链可变区域包括 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID Ν0:10 的三个轻链 CDR。SEQ ID Ν0:9 的第一残基能为 R或Υ。预期还进行R或Υ的其他保守取代。抗体的同种型能为IgGl、IgG2、IgG2a、IgG3S IgG4〇
[0088] 因此，本发明的抗体能为具有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的轻链可变区域和SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的重链可变区域的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体具有 SEQ ID N0:3轻链可变区域和SEQ ID N0:1重链可变区域。在一些实施方案中，本发明的 抗体具有SEQ ID N0:4轻链可变区域和SEQ ID N0:2重链可变区域。两个示例性的抗体为 37E1 和 37E1B5。
[0089] 本发明的抗体能为多克隆的或单克隆的。多克隆血清通常包含沿ανβ8长 度特异性结合至几个表位的抗体的混合群。然而，多克隆血清能针对ανβ 8的特定 片段。示例性的抗体为嵌合的、人源的（参见Queen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)和 TO 90/07861，US 5, 693, 762, US 5, 693, 761，US 5, 585, 089, US 5, 530, 101 以及 Winter, US 5, 225, 539)、或人类的（Lonberg 等人，TO93/12227 (1993); US 5, 877, 397, US 5, 874, 299, US 5, 814, 318, US 5, 789, 650, US 5, 770, 429, US 5, 661, 016, US 5, 633, 425, US 5, 625, 126, US 5, 569, 825, US 5, 545, 806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14,826 (1996),Kucherlapati, W0 91/10741(1991))EP1481008,Bleck，Bioprocessing Journal 1(九月 / 十月，2005),US 2004132066, US2005008625, W02004072266, W02005065348,W02005069970 以及 TO2006055778)。在一些实施方案中，抗体为37E1或37E1B5的人源或嵌合形式。人类同种 型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4能用于人源或嵌合抗体。一些抗体特以大于或等于约107M \ 10SM \ 109M \ 101QM \ 10nM 1或10 12M 1的结合亲和力异性地结合至a v β 8。
[0090] 整合素 α V β 8的拮抗剂
[0091] 还预期能使用天然或合成的整合素 α ν β 8的各种拮抗剂。这类拮抗剂包括例如 肽或小分子。拮抗剂能包括例如药物、治疗剂、环境因素、农业作用剂或工业作用剂、污染 物、药妆品、药品、有机化合物、脂质、糖皮质激素、抗生素、肽、蛋白、糖、碳水化合物和嵌合 分子。在一些实施方案中，整合素 a v β 8的拮抗剂为TGF β -特异性肽，例如TGF β 1-特异 性肽或TGF β 3-特异性肽。TGF β -特异性肽的实例包括但不限于包含GRRGDLATIH (Mu等人 (2002) Journal of Cell Biology 157:493-507)的肽和包含 HGRGDLGRLK 的肽。在一些实 施方案中，拮抗剂降低TGF β激活，但未显著抑制β v β 8-介导的对TGF α的细胞粘附。
[0092] 指征
[0093] 预期本发明的抗-α ν β 8拮抗剂、抗-α ν β 8抗体或免疫结合物、组合物和方法能 用于检测、治疗或预防慢性阻塞性肺疾病（C0PD)和哮喘。
[0094] 还预期本发明的抗-α ν β 8拮抗剂、抗-α ν β 8抗体或免疫结合物、组合物和方法 能用于检测、治疗或预防炎性大脑自身免疫性疾病、多发性硬化、脱髓鞘疾病（例如，横贯 性脊髓炎、德维克病、格林-巴利综合征）、神经炎症、肾疾病或胶质瘤。
[0095] 还预期本发明的抗-α ν β 8拮抗剂、抗-α ν β 8抗体或免疫结合物、组合物和方法 能用于检测、治疗或预防关节炎。
[0096] 还预期本发明的抗-α ν β 8拮抗剂、抗-α ν β 8抗体或免疫结合物、组合物和方法 能用于检测、治疗或预防多种纤维化疾病，例如气道纤维化、特发性肺纤维化、非特异性间 质性肺炎、感染后肺纤维化、弥漫性肺泡损伤、胶原血管疾病相关的肺纤维化、药物诱导的 肺纤维化、矽肺、石棉相关的肺纤维化、呼吸性细支气管炎、呼吸性细支气管炎性间质性肺 炎、脱肩性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、慢性过敏性肺炎、药物相关的肺纤维化、肾纤维 化、肝纤维化。
[0097] 还预期本发明的抗-α ν β 8拮抗剂、抗-α ν β 8抗体或免疫结合物、组合物和方法 能用于检测、治疗或预防腺癌、鳞状细胞癌、乳腺癌以及癌生长和转移。
[0098] 诊断组合物
[0099] 可检测的部分能与本发明的抗体通过例如螯合剂或连接物直接或间接地相关联。 那么，向个体提供标记抗体以测定预期治疗的适用性。例如，标记抗体可以用于测定在患病 区域内的整合素 β 8密度，其中所述密度通常与非患病组织高度相关。标记抗体还能指示 患病区域对治疗的可及性。因此，能基于成像结果选择患者的治疗。使用标准成像技术（例 如，CT扫描、MRI、PET扫描等）完成解剖特征，例如确定癌症的精确界限。
[0100] 包括本发明抗体的诊断剂能包括本领域已知的诊断剂，例如在下列文献中所提 供的：Armstrong 等人，Diagnostic Imaging,第五版，Blackwell Publishing(2004); Torchilin, V.P. , Ed. , Targeted Delivery of Imaging Agents,CRC Press (1995)； Vallabhajosula, S. , Molecular Imaging : Radiopharmaceuticals for PET and SPECT，Springer (2009)。能通过多种方法，包括提供和/或增加可检测的信号的作用剂来 检测诊断剂。可检测的信号包括但不限于γ发射信号、放射性信号、回波信号、光学信号、 荧光信号、吸收性信号、磁信号或断层摄影信号。用于成像诊断剂的技术能包括但不限于 单光子发射计算机断层扫描（SPECT)、磁共振成像（MRI)、光学成像、正电子发射断层扫描 (PET)、计算机断层扫描（CT)、x射线成像、γ射线成像等。术语"可检测的作用剂"、"可检 测的部分"、"标记"、"成像剂"等在本文同义地使用。
[0101] 能将放射性同位素并入本文所述的诊断剂，并能包括发射γ射线、正电子、β和 α粒子以及X射线的发射性核素。合适的放射性核素包括但不限于225AC、 72As、211At、nB、128Ba,212Bi,75Br,77Br, 14C,109Cd,62Cu,64Cu,67Cu, 18F,67Ga,68Ga,3H,166H 〇,123I,124I,125I,130I, 131I,111 In、mLu、13N、150、3