专利名称：能够中和乙型肝炎病毒的人抗体在预防或治疗乙型肝炎病毒感染中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中和HBV的人抗体在预防或治疗HBV感染或由此引起的疾病中的用途。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)引起肝炎和肝癌。WHO已经透露约1/3的慢性HBV患者发生 肝硬化或肝癌，每年约一百万人死于HBV相关的疾病。针对HBV的疫苗的开发使得预防乙型肝炎成为可能，但是还有许多人通过HBV感 染而患有慢性肝炎。另外，有日益增加的肝移植需要，这需要开发有效的可以在肝移植中抑 制HBV感染的抗体。病毒复制抑制剂如拉米夫定被广泛用作慢性乙型肝炎的治疗性药物，但是仅使用 病毒复制抑制剂不可能治疗慢性乙型肝炎。病毒复制抑制剂与具有与病毒复制抑制剂不 同作用机制的抗体的组合预期可以产生对于慢性乙型肝炎增加的治疗效果。这样的抗体 可以包括从具有高的抗HBV抗体滴度的血中纯化的乙型肝炎抗体(乙型肝炎免疫球蛋白； HBIG)。但是，由于现在可获得的HBIG的有限可用性、低特异性和可能的传染性病原体的污 染，所述HBIG不是理想的治疗性抗体的来源。因此，已经尝试使用重组抗体而解决上述问题。没有血浆供应是可能的，稳定地提 供安全的产品也是可能的。已经发现，这样的重组抗体的活性是常规的源自血浆的抗体的 活性的3000倍或更高，其可以用于预防肝移植过程中的病毒感染和治疗慢性乙型肝炎。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种中和HBV的人抗体在预防或治疗HBV感染或由此 引起的疾病中的用途。本发明的另一个目的是提供一种使用中和HBV的人抗体而预防或治疗HBV感染或 由此引起的疾病的方法。根据本发明的一个方面，提供了人抗体在预防或治疗哺乳动物中的HBV感染或由 此引起的疾病中的用途，所述抗体包含具有SEQ IDN0:1的氨基酸序列的重链可变区(VH) 和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的轻链可变区。根据本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗哺乳动物中的HBV感染或由此 引起的疾病的方法，所述方法包括给予治疗上有效量的人抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的轻链可变区 (VL)。
从下列本发明的描述结合下列附图，本发明上述的和其它的目的和特征将变得显而易见，其分别显示图1从未经本发明的抗体处理的黑猩猩中收集的血样中的HBVDNA、HBsAg和抗HBs 的量的改变；图2用于水动力学动物模型的HBV基因组和质粒pHBVl. 3-MBRI的结构特征；图3向注射了 pHBVl. 3-MBRI质粒的小鼠给予本发明的抗体和/或HBV复制抑制 剂后，血HBsAg浓度的改变；图4向注射了 pHBVl. 3-MBRI质粒的小鼠给予本发明的抗体和/或HBV复制抑制 剂后，血抗体浓度的改变；图5(a)免疫沉淀分析结果显示根据使用的本发明的抗体量的本发明的抗体对患 者血中HBV的结合程度；图5(b)免疫沉淀分析结果显示根据使用的本发明的抗体量的患者血中HBV DNA 量的改变；图5(c)比较性免疫沉淀分析结果显示本发明的抗体或常规抗体对患者血中HBV 的结合程度；图6(a)免疫组织化学染色结果显示本发明的抗体对HBV感染的人肝组织的结合； 和图6(b)免疫组织化学染色结果显示具有与本发明的抗体相同的同种型的阴性对 照抗体对HBV感染的人肝组织的结合。
具体实施例方式用于预防或治疗HBV感染或由此引起的疾病的方法中的人抗体包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重链可变区(VH)和具有SEQ IDN0 2的氨基酸序列的轻链可变区 (VL)。本发明人已经在试验中使用黑猩猩证明了本发明的抗体中和HBV的效率。特别 地，输入了 HBV和本发明的抗体的混合物的黑猩猩在随后的一年中没有被HBV感染。另外， 当向被HBV感染的黑猩猩给予本发明的抗体时，HBV表面抗原(HBsAg)的量开始减少，但 是随着本发明的抗体量的减少而增加。免疫沉淀分析显示本发明的抗体与患者血样中的 HBV强烈结合，免疫组织化学染色分析显示本发明的抗体还与被HBV感染的人肝组织强烈
纟口口。用于本发明方法的人抗体在韩国专利号467706中公开，并且可以通过细胞系 HBAb-49 (KCLRF-BP-00054)产生。如在本发明的实施例中所述的，在动物实验中抗体显示了出色的针对HBV的中和 活性。因此，抗体可以用于预防或治疗HBV感染，例如，在肝移植过程中的HBV感染，和由此 引起的疾病例如慢性肝炎。因此，本发明还提供了用于预防或治疗HBV感染或由此引起的疾病的药物组合 物，其含有带有药学上可接受载体的作为活性成分的人抗体，所述抗体由具有SEQ ID N0:1 的氨基酸序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的轻链可变区(yL)组 成。药物制剂可以根据任何常规的过程制成各种药物制剂。为了制备药物制剂，优选地使用载体混合或稀释抗体，或将抗体包埋在容器类载体中。当载体用作稀释剂时，其可以 是作为抗体的载体、赋形剂或介质的固体、半固体或液体的材料。因此，制剂可以是片、丸、 粉末、囊、酏、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶、软的或硬的明胶胶囊、无菌的可注射溶液、 无菌的粉末等的形式。合适的载体、赋形剂和稀释剂的例子是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸 钙、纤维素、甲基纤维素、微晶体纤维素、聚乙烯吡咯酮、水、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸 丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。药物组合物可以另外包括填充剂、抗凝集剂、润滑剂、浸 湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。药物组合物还可以通过使用任何本领域熟知的方法在将 其给予哺乳动物后提供快速的、持续的或延迟的抗体释放。本发明的抗体可以与抗病毒药物如干扰素、抗HBV单克隆抗体、抗HBV多克隆抗 体、核苷同系物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA药物或治疗性疫苗一起使用。可以给予哺乳动物(包括人)本发明的抗体从而预防或治疗HBV感染或由此引起 的疾病。抗体的剂量可以根据各种相关的因素如要治疗的个体的状况、疾病的类型和严重 程度、给药的速率和医生的意见而调整。本发明的抗体可以在单一剂量中或分开剂量中范 围为约0. 001-10mg/kg(体重)/剂，优选0. 005-lmg/kg/剂的有效量肠道外给药。在某些 情况下，上述剂量以下的量可以是更恰当的。可以使用比上述剂量大的量，只要其不造成严 重的副作用，每日可以在分开剂量中给予这样的大剂量。下列实施例是为了说明本发明而不限制其范围。实施例1 对黑猩猩中中和HBV能力的评估为了确认本发明的人抗体显示出体内中和HBV的能力，进行了下列实验。将获自！fepatitisResearch Foundation (New York, USA)的 HBV 100CID50(50% 黑猩猩感染剂量)放入三个管中。将0. Img和IOmg的本发明的抗体Ofepabig-Gene，Green Cross, Korea)分别加入两个管中，另一个管中不加抗体。将PBS (磷酸盐缓冲的盐水)加 入管中至最终体积为3ml，将混合物在37°C孵育1小时，然后在4°C过夜，并用液氮冷冻以制 备测试样品。向三只黑猩猩 Ofepatitis Research Foundation, New York, USA)静脉给予测试 样品，上述黑猩猩以前未感染HBV。每只黑猩猩的抗体剂量列在表1中。表 1 从给予抗体的一周前至给予抗体后8周每周收集血样，从给予抗体后8周起每2 周测定与HBV感染相关的标志物如HBV DNA、HBsAg(HBV表面抗原)，抗_HBs (HBsAg的抗 体)，抗-HBc (HBV核心抗体)，ALT和AST。另外，通过血和尿的测试评价抗体的体内安全 性，黑猩猩1至3的结果分别显示于表2-4中。另外，测定了黑猩猩1的HBVDNA，HBsAg和 抗-HBs的量的改变，结果显示于图1中。表2 (黑猩猩1) 表3 (黑猩猩2) 表4(黑猩猩3) 如在表2至4中显示的，在作为对照的黑猩猩1中观察到HBV感染，而在给予了本 发明的抗体和HBV的黑猩猩2和3中未观察到病毒感染。这些结果显示本发明的抗体具有 优异的HBV中和能力。另外，在肝功能、血和尿的测试中未发现异常值，显示抗体在体内是 安全的。实施例2 对小鼠模型中HBV中和能力的评价2-1)含有HBV DNA的质粒的构建将HBV (adr 亚型)基因的 1. 3 序列(Gene Bank accession No. DQ683578) (从HBV基因组的增强子I的上游至多聚腺苷酸化区的下游的HBV基因；见图2)插入 pcDNA3. 1 (Invitrogen, USA)的PmeI限制位点中，得到的质粒pHBVl. 3-MBRI通过使用 EndoFree PlasmidKit (Qiagen, Germany)而制备。2-2)质粒注射将2-1)中制备的20μ g pHBVl. 3-MBRI质粒溶于生理盐水溶液中至对应于 小鼠重量9%的体积，并以0. 3ml/秒的速率(水动力学注射)注射进入免疫缺陷的 C57BL/6J-Prkdcscid/SzJ 雌性小鼠(8 周大，Jacksonlaboratory, USA)的尾静脉中。2-3)给予本发明的抗体和HBV复制抑制剂每次HBsAg水平达到最高水平，将本发明的抗体以基于20g小鼠体重的5mg/ kg的浓度注射进入小鼠的尾静脉中。在早期只将100 μ IPBS注射进入对照小鼠的尾静 脉中，80天后，如上述注射本发明的抗体。作为比较的组，将1片Zeffix(Lamivudine，GlaxoSmithKline PLC) (HBV治疗性药物)稀释于蒸馏水中，每天以基于20g小鼠体重的 5mg/kg的浓度口服给予100 μ 1混合物100天，从第101天开始给予50mg/kg的浓度口服给 予100 μ 1混合物，从第124天至第160天给予500mg/kg的浓度口服给予100 μ 1混合物。2-4)分析HBsAg水平的改变在实验中，每3至4天进行眼出血，通过使用GENEDIA HBsAgELISA 3. 0试剂盒 (Greencross MS, Korea)分析血中HBsAg水平和残余的抗体量。收集血样并稀释。测定ELISA吸收度，在10倍稀释的血样中测定的吸收度显示于 图3中。如图3中显示的，Zeffix处理的组中HBsAg水平维持恒定，而在本发明的抗体处 理的组中重复出现增加和减少HBsAg水平的循环。这一结果显示本发明的抗体具有优异的 中和HBsAg的效力。据信未观察到Zeffix的影响，因为这种类型动物模型对于聚合酶抑制 剂可能不适合。另外，本发明的抗体和Zeffix共处理的组显示了与本发明的抗体处理的组 相似的吸收度式样。在PBS处理的组中，HBsAg水平维持恒定，但是在第80天注射本发明 的抗体后降低，这也显示本发明的抗体具有优异的中和HBsAg的效力。同时，使用标准的ELISA方法测定血中抗体的量。特别地，将纯化的重组HBsAg溶 液稀释于PBS中至5 μ g/ml的浓度，将100 μ 1所得溶液的等份加载至Nunc immuno module 的每个孔中并在2至8°C孵育过夜，去掉溶液。然后将300μ1 1%BSA/PBS封闭缓冲液加 入每个孔中并在室温孵育1小时。当反应完成时，去掉封闭缓冲液，加入标准溶液、测试溶 液和掺入的测试溶液的每种100 μ 1并在室温孵育90分钟。然后，去掉反应溶液，用洗涤溶 液(PBS/0. 05%吐温20)洗涤五次。将用1%85々^^5溶液稀释25，000倍的100 μ 1山羊抗 人IgG Fab特异性的过氧化物酶共轭物(Sigma)加至每个孔中并在室温孵育60分钟。用 上述洗涤溶液洗板五次，将100 μ 1底物溶液(1 1的TMB微孔过氧化物酶底物溶液A和 B的混合物，KPL，USA)加至每个孔中并在室温孵育30分钟。然后，将100 μ 1停止溶液(1Ν H2SO4)加至每个孔中，在测量波长450nm和参考波长620 650nm测定吸收度从而确定血 样中抗体的量。结果显示于图4中。如图4中显示的，本发明的抗体处理的组以及抗体和Zeffix共处理的组均显示抗 体浓度的相似式样。参考图4和图3，重复出现通过抗体与HBsAg的反应而增加和降低抗体 水平(降低和增加HBsAg水平)的循环。实施例3 抗体的HBV结合能力的免疫沉淀分析进行了免疫沉淀以检查本发明的抗体是否结合乙型肝炎患者(由Ajou University, School of Medicine, Korea ) i巾白勺 HBV。3-1)乙型肝炎患者血样的制备用山羊抗人IgG (Fe特异性)琼脂糖共轭物(Research DiagnosticsInc.， Flanders, NJ)孵育1000 μ 1乙型肝炎患者的血样(用0. 2% BSA/PBS缓冲溶液稀释10倍) 以去除免疫球蛋白。3-2)本发明的抗体与山羊抗人IgG琼脂糖共轭物的结合反应将10 μ 1本发明的抗体(0. 1，0. 5，1和5μ g)和PBS与50 μ 1山羊抗人IgG琼脂 糖共轭物(Research Diagnostics)混合并在室温搅拌下孵育1小时。向其中加入IOmg人 免疫球蛋白(I. V. -Globulin-S,Green Cross，Korea)，将所得的混合物在室温搅拌下孵育1小时以封闭山羊抗人IgG琼脂糖共轭物的结合区。作为比较组，如上述处理源自血的HBV抗 体(Hepabig, Green Cross, Korea)、TT-F9 (抗破伤风类毒素人抗体，GreenCross, Korea), 和HuS 10 (抗乙型肝炎病毒表面抗原人源化抗体GreenCross，Korea)的每种中的1 μ g。3-3)抗体结合的山羊抗人IgG琼脂糖共轭物和患者血样的混合物的制备将200 μ 1 3-1)中制备的血样与3-2)中制备的抗体结合的山羊抗人IgG琼脂糖 共轭物混合，将所得的混合物在室温搅拌1小时以便使抗体与患者血样中的HBV进行反应。3-4) HBV沉淀的分析将3-3)中所得的溶液离心，用上清液进行Cobas Amplicor HBVMonitor Test, v2. O (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) UflJ胃 HBVDNA。用0. 2% BSA/PBS缓冲溶液洗涤残余琼脂糖10次，并用100 μ 1相同缓冲溶液重 悬，然后加入 5μ1 10% SDS, 2 μ 1 50mM EDTA 和 200 μ g 蛋白酶 K(Sigma-Aldrich)并在 55°C孵育30分钟。然后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)处理上 清液以分离 DNA，使用 LiquiMix GM PCR预混合液(Neurotics，Korea)，引物M3 (SEQ ID N0: 3)和P0L8(SEQ ID NO 4)进行PCR以扩增HBV特异性DNA，PCR在下列条件下进行55°C变 性5分钟；35个循环(950C 1分钟，550C 1分钟和72°C 1分钟)；72°C最后延伸10分钟。在 1.0%琼脂糖凝胶上分析扩增的DNA。结果显示于图5中。在图5的(a)和(c)中，每条泳 道的被分析的样品如下图 5 (a)1 用0. 1 μ g本发明的抗体处理的组，2 用0. 5 μ g本发明的抗体处理的组，3 用1 μ g本发明的抗体处理的组，4 用5 μ g本发明的抗体处理的组，5 =PBS图 5 (C)1 =PBS2 用1 μ g TT-F9 (抗破伤风类毒素人抗体)处理的组，3 用1 μ g H印abig处理的组，4 用1 μ g HuS 10 (抗乙型肝炎病毒表面抗原人源化抗体)处理的组，5 用1 μ g本发明的抗体处理的组。如在图5的(a)和(b)中显示的，沉淀的HBV的量与用于免疫沉淀的抗体的量成 比例，免疫沉淀后上清液中HBV的量与用于免疫沉淀的抗体的量成反比。另外，当使用相同 量的抗体时，源自血的HBV抗体Ofepabig)由于其弱的HBV结合能力而不沉淀HBV，而具有 强结合能力的本发明的抗体特异性沉淀HBV(见图5(c))。实施例4 抗体的HBV结合能力的免疫组织化学分析进行免疫组织化学染色以检查本发明的抗体是否结合HBV感染的组织。HBV 感染的人肝组织(Spring Bioscience, Fremont, CA, USA. Catalog No. STS-025)的冷冻片子用丙酮固定并用甲醇稀释的过氧化氢处理。然后，用正常 的兔血清、抗生物素和生物素顺序处理片子。使用Immunoprobe biotinylation kit (Sigma-Aldrich)将本发明的抗体和同种型阴性对照抗体(人IgGl，Sigma-Aldrich)共轭结合至生物素，然后在此处理Str印tABComplex/HRP(Dako，Netherlands)。用3，3' -二 氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)将上面的试剂染色并用苏木精复染。结果显示于图6中。如图6中显示的，同种型阴性对照抗体不结合HBV感染的人肝组织(见(b))，而本 发明的抗体强烈地与其结合(见(a))。虽然已经就上面的特定具体实施方式
描述了本发明，应该认识到可作出各种修饰 和改变，所述修饰和改变也落入本发明的范围内，如接下来的权利要求所限定的。
权利要求
一种用于预防或治疗哺乳动物中乙型肝炎病毒(HBV)感染或由此引起的疾病的人抗体的用途，所述抗体包含具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
2.根据权利要求1所述的用途，其中抗体从细胞系HBAb-49(KCLRF-BP-00054)中制备。
3.根据权利要求1所述的用途，其中抗体中和HBV。
4.根据权利要求1所述的用途，其中抗体与抗病毒药物一起使用。
5.根据权利要求4所述的用途，其中抗病毒的药物选自干扰素、抗HBV单克隆抗体、抗 HBV多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA药物或治疗性疫苗。
6.根据权利要求1所述的用途，其中以范围为0.001-10mg/kg (体重)/剂的量给予哺 乳动物抗体。
7.一种预防或治疗哺乳动物中的HBV感染或由此引起的疾病的方法，所述方法包括以 有效量向其给予人抗体，所述抗体包含具有SEQID N0:1的氨基酸序列的重链可变区(VH) 和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的轻链可变区。
全文摘要
本发明提供针对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)的人抗体的用途。所述抗体显示优异的中和HBV能力，因此，可以用于预防或治疗HBV感染或由此引起的疾病。
文档编号A61K39/395GK101878037SQ200880118406
公开日2010年11月3日 申请日期2008年11月21日 优先权日2007年11月30日
发明者吴宣姃, 奉纪兑, 崔真设, 张基奂, 徐东赫, 柳憬桓, 洪广元, 辛庸源, 辛龙男, 金世镐, 金判劲 申请人:株式会社绿十字