乙型肝炎病毒特异抗体和其应用的制作方法

专利名称：乙型肝炎病毒特异抗体和其应用的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及免疫介导疗法用于检测和治疗乙肝病毒(HBV)和HBV相关疾病的领域和制备这些疗法的方法。具体地，所述免疫介导疗法可为HBV特异T细胞受体(TCR)样抗体的形式。
背景技术：
乙肝病毒(HBV)感染是全世界主要的公众健康问题，造成慢性肝病的严重发病率和死亡率。估计全球有3. 5-4亿HBV携带者。75%的慢性HBV患者在亚洲，且美国约有150万人感染。而且，尽管可获得有效疫苗，每年美国约报道50000-100000个新病例。感染更常见于某些风险人群中，如与男人发生性行为的男人、肾透析患者和血友病患者，慢性乙肝影响10-15%的第一代亚裔美国人且约5%的收养自俄罗斯、亚洲和东欧的儿童患有慢性肝炎。慢性HBV还导致包括肝硬化和肝癌(肝细胞癌)在内的严重肝脏疾病，每年造成多 于100万例死亡。治疗这样大量的慢性感染对象存在问题，因为现有药物抑制但不消除HBV。这些药物控制病毒的能力有限且造成严重的副作用，导致许多HBV患者过早中断使用。感染的肝细胞的清除需要存在能分泌抗病毒细胞因子的病毒特异性T细胞。然而，这些病毒特异性T细胞在慢性HBV感染的患者中功能性受损。这些患者中HBV特异性T细胞免疫缺陷被认为是治疗停止后大多数患者经历HBV复发的原因。80%的肝细胞癌(HCC)与慢性HBV感染有关，使3. 5亿慢性感染HBV的人成为有发展HCC风险的最大人群。慢性HBV患者中发展的HCC通常具有整合到肿瘤细胞染色体中的部分HBV基因组，导致所述肿瘤表达病毒抗原。因此HBC抗原可在HCC细胞上表达。这些病毒感染的细胞被人体免疫系统识别，因为所述细胞在其表面暴露的小肽衍生自与主要组织相容性复合抗体(MHC)I类分子相关的病毒蛋白。TCR样单克隆抗体已用标准杂交瘤方法或通过使用噬菌体抗体库生产。但是，这些抗体与其相应抗原HBV或肿瘤相关抗原有较低的结合亲合力。发明概述本发明解决上述问题，且具体提供对至少一种HBV和/或HBV感染细胞特异的至少一种新抗体。根据第一方面，本发明提供至少一种分离的T细胞受体(TCR)样抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能特异性结合至少一种HBV衍生的肽。所述HBV衍生肽可包括至少一种乙肝核心抗原和/或至少一种乙肝包被抗原。所述HBV衍生肽可与主要组织相容性复合物(MHC) I类分子有关。所述抗体可选自下组(a)杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068生产的抗体；(b)具有杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的结合特征的抗体；(c)与能结合杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的抗原结合的抗体；(d)结合包含SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :24、其变体、突变或片段的氨基酸序列的抗原的抗体；和(e)包含至少一种轻链和至少一种重链的抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :32、其变体、突变或片段的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :33、其变体、突变或片段的氨基酸序列。根据另一方面，本发明提供至少一种分离的杂交瘤细胞系，其于2009年7月2日以登录号PTA-10167和2010年6月18日以登录号PTA-11068保藏于ATCC(弗吉尼亚州20110马纳萨斯的大学大道10801)。根据另一方面，本发明提供生产至少一种杂交瘤、乙肝病毒(HBV)特异抗体或其中片段的方法，所述方法包括以下步骤
a.用至少一种与MHC I类分子关联的HBV衍生肽免疫至少一种非人哺乳动物，形成至少一种对与MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；b.选择至少一种对与MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；和c.将所选B细胞与至少一种永生细胞融合以产生至少一种杂交瘤，其中所述杂交瘤能生产至少一种对与MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的HBV特异抗体或其片段；和任选地从所述杂交瘤中分离所述HBV特异抗体。根据其他方面，本发明提供检测和/或定量存在的HBV的方法，治疗HBV和/或至少一种HBV关联疾病的方法，用作药物的本发明的抗体或其片段，就制备药物、药盒、核酸和其用途而言本发明的抗体或其片段的应用。附图简要说明图I (A)是cl8/A2mAb特异性的图，其中用cl8_27肽脉冲细胞观察特异染色。图I⑶显示cl8/A2mAb的结合/识别能力没有受到HBeAg抑制。图2 (A)显示用cl8/A2mAb检测所需的cl8_27肽的最小浓度。低至IpM的cl8_27肽足以实现显著的染色。图2⑶证实C18/A2特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的cl8/A2mAb方法的灵敏度。图2 (C)取自Gehring A. J等，2007，显示用不同c 18-27肽浓度激活cl8/A2特异CTL。图3为cl8/A2mAb的BIAcore分析结果。单体和cl8_A2mAb的结合分别以I. IXlO5M' S-1和2. 5X10^. S-1的结合和解离速率发生，产生的Kd (Koff/KJ为22. 6nM。图4是细胞内加工产生的C18/A2复合物的识别结果。(A)使用EBVB-核心细胞(组成型表达转移的HBV核心蛋白)、EBV-pol细胞(对照)或DMS0(同种型对照)。用EBVB-核心细胞观察到EBVB-pol细胞或同种型对照上方的显著染色。(B)使用IFN-Y处理的表达HBV的IfepG2-117细胞。IfepG2-117细胞中观察到cl8/A2mAb的显著染色。这些结果证实了细胞内加工产生的C18/A2复合物被cl8/A2mAb识别。图5是C18-27-MHC复合物的免疫细胞化学染色结果。cl8/A2mAb能识别通过核心抗原HBcl8-27的天然胞内加工呈递的C18/A2复合物。图6显示cl8/A2mAb识别天然产生的具有逃逸CTL识别的HBcl8_27突变的能力。除了 E22和P21，cl8/A2mAb能识别数种CTL不能识别的突变肽。图7是TCR样抗体生产的示意图。⑷如实施例所述的HLA-A2复合物合成、小鼠免疫、B细胞选择和特异抗体生产的特征。表格报道筛选的杂交瘤的总数量；(B)代表B细胞杂交瘤上清的不同染色分布的柱状图。染色的细胞为用I PM各Flu Mp58-66或HBVC18-27肽脉冲处理的T2细胞。用50 ill杂交瘤上清或无关的IgGl小鼠抗体孵育细胞，然后清洗并用抗小鼠IgG_AF488孵育30分钟。在流式细胞仪上清洗并分析细胞。示出三种不同分布(阴性、对HLA-A2分子特异和对核心18-27/HLA-A2复合物(c 18/A2)特异)。图8是TCR样抗体表征的结果。⑷评估选择的TCR样抗体的特异性用I U M各所述肽孵育T2细胞I小时、清洗3次并用0. 5 ii g的cl8/A2mAb或E183/A2mAb染色并如上分析。绘出平均荧光强度(MFI) ;(B)TCR样抗体不受到循环HBV抗原的抑制cl8/A2Ab或el83/A2Ab用100 所述血清和产生HBV的H印G2-11细胞培养物上清预孵育。该预孵育的mAb-血清混合物用于染色加载C18-27或E183-91肽(I u M)的T2细胞。绘制用流式细胞分析和MFI分析的细胞。mAb的识别能力不受患者血清的循环抗原抑制；(C)两种TCR样Ab的结合特征。所述两种TCR样Ab的滴定浓度用肽脉冲的T2细胞测试。柱代表TCR样 Ab的所述浓度下获得的MFI值。图9显示TCR样Ab特异性的精细作图结果。(A)显示核心18_27内的AA突变和env 183-91表位对TCR样Ab和⑶8T细胞识别的影响。在所述位置含有或不含(wt)丙氨酸取代时，用I U M核心18-27或env 183-91脉冲处理T2细胞。柱状图显示WT核心18-27 (左四分之一)和env 183-91(右四分之一)肽上的丙氨酸取代诱发的TCR样Ab结合(上四分之一)和CD8T细胞活化(下四分之一)的抑制。用下式计算抑制百分数丙氨酸取代肽获得的MFI (或⑶107表达)值除以WT肽所得值XlOO ；⑶天然产生的核心18-27突变的cl8/A2 Ab识别。T2细胞用Iii M的wt cl8_27或氨基酸取代肽脉冲处理，然后用cl8/A2 Ab染色。柱代表流式细胞分析获得的MFI值；(C)E183/A2 Ab专一特异于HBV gen A/C/D的envl83-91肽。T2细胞用I y M的187位置有所述取代的env 183-91肽脉冲处理。187R是HBV gen A/C/D分离物的特征，K 187是HBV基因型B/E/F的特征。

图10显示TCR样抗体检测pMHC复合物，与HBV特异性⑶8T细胞的灵敏度相似。T2细胞与所述浓度的C18-27或E183-91肽孵育I小时，并用于结合各抗体(柱)-或⑶8T细胞活化(线)。通过流式细胞分析检测抗体结合。CD8 T细胞活化用与靶细胞孵育5小时后的表达CD107的CD8 T细胞百分数计算。平行并重复进行实验。标记表示两次实验的均值。图11描述细胞内加工产生的pMHC复合物的检测HepG2细胞为转导有慢病毒载体的HBcAg(A)或HBsAg(B)。空载体转导细胞用作对照。存在或没有多西环素条件下培养H印G2-117细胞并用cl8/A2 Ab(C)或el83/A2 Ab(D)染色。(E)观察pMHC复合物。HepG2-117+Dox (无 HBV)和-Dox (HBV)细胞用 I % PFA 固定，并用 cl8/A2 Ab 和 el83/A2 Ab染色。Alexa Fluor-647-酪胺信号放大试剂盒用于观察抗体结合(红色，图11中的亮灰色)。用DAPI染色核(蓝色，图11中的暗灰色)。图12显示纯化自CHB肝活检的细胞上pMHC的识别。点图显示衍生自CHB患者肝活检的悬浮细胞的正面和侧面散射。门控细胞上Ck-18(肝细胞特异性蛋白)的表达显示于柱状图。超过90%的有所示形态的细胞表达Ck-18。为了检测衍生自肝活检的细胞上的特异性pMHC，机械加工的细胞用所述TCR样抗体染色。显示HLA-A2阳性和不同患者的临床
/病毒学特征。图13是pMHC和CTL活化的定量结果。为了获得pMHC精确数量，等分细胞(用C18-27肽和el83-191肽浓度孵育)的MFI内插到用校准珠生成的显示已知量小鼠IgG mAb的校准曲线中。图14是杂交瘤上清的筛选结果。T2细胞用IiiM的各envl83_91或无关的Ml肽脉冲处理I小时，清洗3次并用50 Ul杂交瘤培养物上清孵育，然后清洗并用抗小鼠IgG-AF488孵育30分钟。在流式细胞仪上清洗并分析细胞。培养物上清特异性染色用env183-91而不是Ml肽脉冲处理的靶细胞。图15A显示E183/A2mAb的特异性。T2细胞与I ii M各所列肽孵育一小时，清洗3次并用0. 5 ii g mAb染色。清洗3次后，用抗小鼠IgG-PE abs孵育细胞30分钟，清洗并在流式细胞仪上获得。仅在envl83-91肽脉冲细胞中观察到特异性染色。 图15 (B)显示E183/A2mAb的结合能力没有受到HBeAg抑制。E183/A2mAb用单独来自两个不同患者的100 u I HBsAg+ve血清、产HBV的H印G2细胞的培养物上清和健康个体血清(AB血清)预孵育。该预孵育的mAb-血清混合物用于染色envl83-91脉冲处理的T2细胞。E183/A2mAb的识别能力不受到患者血清的HBsAg抑制。图16显示用E183/A2mAb检测所需的最小envl83_91肽浓度。T2细胞用滴定量的envl83-91肽脉冲处理I小时并用TCR样mAb染色。低至pM的肽足以实现显著染色。图17显示肽图。用I U M所述肽脉冲处理T2细胞I小时且细胞用E183/A2mAb孵育I小时。通过流式细胞分析检测E183/A2抗体结合。氨基酸186和188是抗体用于识别复合物的残基。图18表示细胞内加工产生的pMHC复合物的识别。用HBsAg(A)慢病毒载体转导HepG2细胞。空载体转导细胞用作对照。细胞用E183/A2抗体孵育，然后用山羊抗小鼠IgG-APC孵育并用流式细胞仪分析。能清楚看到比空载体转导细胞显著的染色。⑶存在或没有多西环素和IFN- y条件下培养产生HBV的HepG2-117细胞并如上所述用E183/A2mAb染色。两种情况中均能清楚地看到比空载体对照细胞显著的染色。图19是E183/A2复合物的免疫细胞化学染色的照片。表达HBV的IfepG2细胞(HepG2-117)和载体对照IfepG2细胞用DMSO和IFN-Y处理并用I % PFA固定，用E183/A2mAb染色。采用酪胺信号放大试剂盒检测所述结合。用DAPI染色核(蓝色，图19中的亮灰色)。E183/A2mAb能呈现HBV生产细胞内由HBsAg的天然细胞内加工呈递的E183/A2复合物(红色，图19中的暗灰色)。图20显示E183/A2mAb识别含天然HBV整合的HCC细胞的能力。用表达HLA-A2的载体0fep3B-A2)转导Ifep3B (表达HBV包被抗原的天然HCC细胞系)。如前所述细胞用或不用1000IU/ml IFN-y处理2天并用E183/A2mAb染色，且细胞在流式细胞仪上分析。图21显示免疫荧光物的靶向递送的照片。IfepG2细胞用E183-91肽脉冲处理且且抗体-荧光物偶联物孵育I小时，清洗并在盖玻片上37°C孵育。孵育后的不同时间点，收集盖玻片并与DiI红孵育(图21中所示的中等灰色)以标记质膜或与用LysoTracker染料以示踪细胞中的溶酶体。用DAPI染色细胞核(蓝色，图21中的暗灰色)。盖玻片上的细胞用1% PFA固定并装配用于共聚焦成像。图21中的绿/亮灰色显示E183/A2mAb-荧光物。
发明详述本说明书提及的参考书目为了方便以参考文献的列表形式列出并加在实施例后。所述参考书目的全部内容通过引用纳入本文。定义方便起见，将本说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语收集在此。本文所用的术语“抗体”指结合特定表位的任何免疫球蛋白或完整分子以及其片段。所述抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、完整抗体的Fab、Fab ’、F (ab) ’片段和/或F (v)部分。例如，抗体“ c 18/A2mAb ”可与“ HBc 18_27抗体”、“针对HBcl8-27的抗体”和“抗cl8/A2 TCR样抗体”互换使用，其能特异性结合至少一种HBV衍生肽，包括但不限于HBcl8-27 (SEQ ID NO 3),或结合其变体或片段，且包括保留亲本抗体的抗原结合能力的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和其片段。相似地，抗体“E183/A2mAb” 可与“HBel83-191 抗体”、“针对 HBel83_191 的抗体”和“抗 el83/A2mAb T CR样抗体”互换使用，其能特异结合至少一种HBV衍生肽，包括但不限于HBel83-191 (SEQ IDNO :24)，或结合其变体或片段，且包括保留亲本抗体的抗原结合能力的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和其片段。本文所用的术语“抗体片段”指保留亲本抗体的抗原结合功能的抗体完整序列的不完整或分离部分。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和抗体片段形成的多特异性抗体。cl8/A2mAb和E183/A2mAb的片段包括在本发明中，只要其保留与全长抗体的所需亲合力。具体地，其可缩短至少一个氨基酸。例如，cl8/A2mAb抗体片段包含能使其结合HBcl8_27 (SEQ ID NO :3)、或其变体或片段的抗原结合功能且E183/A2mAb抗体片段包含能使其结合HBel83_191 (SEQ ID NO :24)、或其变体或片段的抗原结合功能。本文所用的术语“抗原”指促使抗体生成并引起免疫应答的物质。本发明中其可与术语“免疫原”互换使用。严格意义上，免疫原是引发免疫系统响应的物质，而抗原定义为结合特异抗体的物质。抗原或其片段可为接触具体抗体的分子(即表位)。蛋白或蛋白片段用于免疫宿主动物时，大量蛋白区域可诱导抗体生成(即引发免疫应答)，其特异性结合所述抗原(蛋白上的给定区域或三维结构)。所述抗原可包括但不限于与“HBcl8-27肽”和“C18/A2 互换使用的 HBcl8-27、与“HBel83-191 肽”和“E183/A2 互换使用的 HBel83_191及其片段。本文术语“包含”定义为各种组分、成分或步骤可联用于实施本发明。因此，术语“包含”涵盖了限定性更强的术语“主要由组成”和“由组成”。术语“主要由组成”理解为本发明的表位/抗原“主要”包含所述序列作为“基本”元件。额外序列可包括在5端和/或3端。因此，鉴于已知多肽偶然包含序列X，“主要由序列X组成”的多肽可为新的。术语“由组成”理解为按照本发明的多肽、多核苷酸和/或抗原对应于至少一种所述序列(例如SEQID编号所示的具体序列或其同源序列或片段)。本文所用的术语“衍生物”指至少一种HBV衍生肽、或编码至少一种HBV衍生肽的多核苷酸序列、或与编码至少一种HBV衍生肽的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列的化学修饰。多核苷酸的化学修饰包括例如，用烷基、酰基或氨基取代氢。衍生多核苷酸编码的多肽保留天然分子的至少一种生物学或免疫学功能。衍生多肽是通过糖基化、聚乙二醇化或任何相似过程修饰的多肽，它保留了其来源多肽的至少一种生物学功能或免疫学功能。短语“HBV衍生肽”指衍生自HBV的蛋白/肽。具体地，HBV衍生肽可包括但不限于核心抗原、包被抗原、表面抗原和/或其突变体。更具体地，HBV衍生肽可为HBcl8-27和/ 或 HBel83-191。本文术语“HBcl8_27定义为能刺激HLA I类限制性T细胞且和“cl8/A2互换使用的表位。所述表位的序列可为"FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO :3)。本发明中，除非另有说明，术语HBcl8-27用于指白种人常见的基因型A/D的序列为SEQ ID NO 3的HBcl8_27表位。本文术语“HBel83-191定义为能刺激HLA I类限制性T细胞且和“E183/A2互换使用的表位。所述表位的序列可为"FLLTRILTI，，(SEQ ID NO :24)。本文所用的术语“片段”指至少一种HBV衍生肽的完整序列的不完整或分离部分，其包含赋予所述序列所述肽的特征和功能的活性位置。具体地，其可缩短至少一个核苷酸或氨基酸且可为免疫原性片段。例如HBcl8-27片段包含使cl8/A2mAb或其片段识别的活 性位置和/或HBel83-191的片段包含使E183/A2mAb或其片段识别的活性位置。片段还可指本发明任何方面的抗体的片段，其中所述抗体包含识别相应抗原的活性位置。所述片段长度可至少为10氨基酸。本文所用的术语“人源化抗体”指至少一种抗体分子，其中非抗原结合区的氨基酸序列已改变从而所述抗体与人抗体更紧密相似，且仍保留其原始结合能力。如本文所用，术语“杂交瘤”指已工程改造成大量生产所需抗体的细胞。例如为了生产至少一种杂交瘤，B细胞从已用相关抗原刺激的动物脾中移出并与至少一种永生细胞融合。该融合通过使细胞膜更通透来实现。融合杂交细胞(成为杂交瘤)会快速和无限地增加且会产生至少一种抗体。按照本发明的方法产生的杂交瘤细胞系示例包括但不限于产生 HBcl8-27、cl8/A2mAb 的单抗的 cl8/A2mAb#l。本文所用的“永生细胞”还称为转化细胞即生长特性被改变的细胞。这并不一定表示这些是“癌”或“肿瘤”细胞(即引入实验动物时能形成肿瘤)，尽管在一些情况中它们可能是。永生细胞系包括但不限于NS1、Jurkat> HeLa、HepG2、SP2/0、Hep_3b等。本文术语“分离的”定义为与生物体细胞中其他生物组分充分隔离、分开产生或从中纯化出的生物组分(如核酸、肽或蛋白)，其中所述组分天然产生即其他染色体和染色体外的DNA和RNA和蛋白。因此已分离的核酸、肽和蛋白包括由标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白以及化学合成的核酸。本文所用的术语“单体”包含至少一种抗原、重链和/或轻链。例如，本发明中，实施例I所用的单体包含HBcl8-27和至少一种HLA重链和轻链。具体地，所述单体可包含SEQ ID NO :3或其片段、重链和轻链。本发明中术语“单体”可与术语“C18/A2复合物”和“C18/A2单体”互换使用。术语HBV衍生肽的“突变体”在本文定义为具有通过取代、缺失或添加至少一种氨基酸而与至少一种参考病毒编码序列不同的至少一种氨基酸序列的肽，但其保留结合和活化本发明抗体且可被非突变肽活化的能力。HBcl8-27的例子包括但不限于表2提供的SEQID NO :4-16。本文所用的术语“样品”在本文中以最广义使用。疑似含编码至少一种HBV衍生肽或其片段的核酸的生物样品，或至少一种HBV衍生肽自身可包含体液、细胞提取物、染色体、细胞器官、或分离自细胞的膜、细胞；基因组DNA、RNA、或cDNA(溶于溶液或结合于固体支持物)、组织、组织印迹等。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异地结合”指蛋白或肽和激动剂、抗体或拮抗剂之间的相互作用。具体地，所述结合在抗原和抗体之间。该相互作用依赖于结合分子(即抗原或表位)识别的蛋白质特定结构的存在。例如，若抗体对表位“A”特异，则含游离标记A和抗体的溶液中存在的含表位A的多肽或存在的游离未标记A会降低结合所述抗体的标记A的量。例如，cl8/A2mAb可特异性结合抗原HBcl8_27且E183/A2mAb可特异性结合抗原 HBel83-191。本文所用的术语“对象”定义为脊椎动物，具体是哺乳动物，更具体是人。为了研究目的，所述对象可具体为至少一种动物模型，如小鼠、大鼠等。本文所用的术语“TCR样单克隆抗体”指至少一种与T细胞受体(TCR)抗体性能相似的抗体。具体地，所述TCR样单克隆抗体可指能识别MHC结合肽的抗体。TCR样单克隆抗体的示例可包括但不限于cl8/A2mAb和E183/A2mAb。 如本文所用的至少一种HBV衍生肽的“变体”指一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。所述变体可有“保守性”改变，其中取代的氨基酸具有相似结构或化学特性(如用异亮氨酸取代亮氨酸)。更少见的，变体可有“非保守性”变化(如用色氨酸替换甘氨酸)。类似的小变化还可包括氨基酸缺失或插入或两者均有。使用本领域熟知计算机程序如DNASTAR软件可发现确定可对哪一氨基酸残基进行取代、插入或缺失而不破坏生物学或免疫学活性的指南。本领域技术人员会理解本发明可实施而不需按照本文提供的方法进行过度实验。所述方法、技术和化学品如给定参考文献所述或来自标准生物技术和分子生物学教科书中的实验方案。本发明第一方面，提供至少一种分离的T细胞受体(TCR)样抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能特异性结合至少一种HBV衍生的肽。所述HBV衍生肽可包括至少一种乙肝核心抗原和/或至少一种乙肝包被抗原。所述新抗体可具有靶向HBV感染细胞和HBV衍生的肝细胞癌(HCC)细胞的能力，这基于这些细胞胞内表达重要抗原和其与人MHC I类的关联(在称为人白细胞抗原-HLA-A201的形式上特异)。所述HBV衍生肽可与主要组织相容性复合物(MHC) I类分子结合，尤其是HLA I类分子。所述HLA I类分子可为HLA-A2。更具体地，所述HBV衍生肽可为MHC-I肽复合物的部分，所述复合物包含HBV衍生肽和HLA I类分子。人类中MHC I类蛋白统称为HLA且在人体几乎全部有核细胞表面表达，其结合衍生自内源产生的病毒的小肽(通常9-10氨基酸长)或内质网中自身改变(肿瘤)的蛋白以产生复合物。HLA I类蛋白和其结合肽的复合物转运到感染细胞的表面，这里其能被细胞毒性⑶8T淋巴细胞上呈递的T细胞受体识别。不同HLA类型包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPAl、HLA-DPBl、HLA-DQAl、HLA-DQBU HLA-DRA、和 HLA-DRB1。细胞毒性⑶8T淋巴细胞上呈递的T细胞受体和HLA I类分子呈递的病毒肽之间的特异相互作用活化能破坏病毒感染细胞或产生抗病毒细胞因子(TNF-a和IFN-y)的CD8T细胞，所述细胞因子能清除非细胞病变病毒感染的细胞。所述感染细胞内产生的病毒蛋白不易为典型抗体进入，但免疫系统通过CD8T淋巴细胞上呈递的T细胞受体识别病毒感染细胞。因为产生病毒特异性CD8T细胞需要高度熟练的技术且该细胞体外极其不稳，所以生成特异性识别病毒感染细胞表面上HLA限制性病毒肽配体的抗体可在体内检测人中的病毒感染细胞然后能递送有治疗或诊断效力的部分。因为HLA I类/病毒肽复合物通常在不同个体中有差异，所以不同的TCR样抗体仅在携带所定义HLA I类分子的选定人群中作用。定位于人染色体6上的基因复合物产生的HLA I类分子和这些基因在更大的程度上多样化，因此各单一个体可呈递不同HLA I类蛋白的具体组合。针对不同病毒肽选择不同HLA I类分子的分子结构且因此感染细胞上呈递的HLA I类病毒肽复合物有极度的多样性。约50 %的人群表达HLA I类分子HLA-A2，其代表许多HLA_A*02等位基因的基因产物产生的HLA I类分子家族，所述基因产物包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206和*0207基因产物。白种人和亚洲人群之间的亚型中有显著差异。超过95%的HLA-A2阳性白种人群为 HLA-A0201，HLA-A2 阳性，中国人群可分为 23% HLA-A0201 ；45% HLA-A0207 ；8%HLA-A0206 ；23% HLA-A0203。 按照本发明的任何方面的TCR样抗体可靶向HLA-A2分子不同等位基因呈递的HBV衍生肽，且因此其可靶向约50%的HBV感染人群。按照本发明的任何方面的TCR样抗体具有与病毒特异性CD8T淋巴细胞天然产生的T细胞受体相似的特异性，其能识别病毒感染的细胞且因此能被称为T细胞受体(TCR)样抗体。按照本发明的任何方面的TCR样抗体具有与其相应MHC肽复合物相当高的结合亲和性，且因此能识别天然产生的通常在其表面显示极低量病毒肽/HLA I类配体的病毒感染细胞。这些TCR样抗体还能识别HBV感染的人肝细胞。HBV衍生肽可包括但不限于乙肝核心抗原、包被抗原、表面抗原和/或其突变体。具体地，所述HBV衍生肽可包括至少一种乙肝核心抗原和/或乙肝包被抗原。具体地，所述HBV衍生肽可包括以下组分、由其组成或主要由其组成HBc 18-27和/或HBe 183-19、其变体、突变或片段。更具体地，HBcl8-27包括以下组分、由其组成或主要由其组成SEQ ID NO:3、其变体、突变体或片段，且HBel83-191包括以下组分、由其组成或主要由其组成SEQ IDNO :24、其变体、突变或片段。本发明的抗体可结合HBV感染细胞和肿瘤细胞表面的C18/A2和/或E183/A2单体且靶向它们用于免疫介导的裂解(即天然杀伤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。所述抗体可选自下组(a)杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068生产的抗体；(b)具有杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的结合特征的抗体；(c)与能结合杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的抗原结合的抗体；(d)结合包含SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :24、其变体、突变或片段的氨基酸序列的抗原的抗体；和(e)包含至少一种轻链和至少一种重链的抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :32、其变体、突变或片段的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :33、其变体、突变或片段的氨基酸序列。
所述抗体可为至少一种人、人源化或嵌合抗体。所述抗体可为能高度特异性靶向HBV感染细胞的小鼠IgGl (含K轻链)，因为其靶向HBV感染细胞表面专有呈递的HLA-A201-HBV 核心 18-27 复合物和 / 或 HLA-A201-HBV 包被 183-191 复合物。可采用通过将有合适抗原特异性的小鼠抗体分子和有合适生物活性的人抗体分子基因一起剪接来产生“嵌合抗体”的开发技术(Morrison,等，1984通过引用全文纳入本文)。例如，对自诱导物特异的小鼠抗体分子基因可与有合适生物活性的人抗体分子的基因一起剪接。嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物种类的分子，如具有衍生自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。此外，已开发用于生产人源化抗体的的技术(参见例如，US 5，585，089和/或US5，225，539，其通过引用全文纳入本文)。免疫球蛋白轻链或重链可变区由三个称为互补决定区(CDR)的高变区中断的“框架”区组成。简要地，人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个CDR以及来自人免疫球蛋白分子的框架区。
所述抗体可标记有至少一种放射性核和/或荧光团从而改善体内HBV感染的肿瘤细胞至少在诊断和/或治疗能力中的靶向。例如，通过正电子发射断层显像(PET)检测HBV感染的HCC细胞。用放射性核标记的抗体可就手术和/或放疗而言更好地靶向疾病细胞。抗体还可用至少一种毒素和/或化疗剂标记。具体地，标记的抗体可用作使这些毒性剂更好靶向肿瘤细胞的“免疫毒素”。本发明任何方面的TCR样抗体还可用于直接定量感染细胞或任何抗原呈递细胞上的肽/HLA I类复合物的数量和位置，因此可用于评估不同细胞类型中HBV抗原的加工和
呈递效率。所述抗体可识别HLA-A201环境中的cl8_27和/或envl83_91肽。该TCR样mAb可代表HBV免疫学的两个主要领域中有价值的新工具。首先，该mAb可用于通过流式细胞分析和免疫组织化学的标准方法检测和直接观察PMHC复合物的存在。通过确定APC、肝细胞癌肿瘤细胞和淋巴细胞上PMHC的表达，其可用于研究和分析抗原呈递。有关抗原呈递期间某些事件如何和在何处发生的问题可被直接解决，且可观察并定量T细胞表位在APC上的表达。根据本发明任何方面的抗体提供了用作各种基于抗体的免疫治疗方法中靶向部分的新可能。TCR样mAb可与药物连接，得到的‘ab-偶联物’可用于递送药物到感染细胞。具体地，所述抗体可与至少一种药物、抗病毒药物、毒素和/或化疗剂相连。具体地，所述抗体可用于递送药物到具有高度特异性的感染肝细胞中以抑制病毒感染和肿瘤。所述药物可包括但不限于IFN-a、TLR-激动剂、阿德福韦、恩替卡韦、拉米夫定、瑞莫夫韦、替比夫定、替诺福韦等。本发明的抗体连接至少一种抗病毒药物，可能增加HBV感染细胞的药物可用性，其可提高对感染细胞的IFN-a效应并同时降低系统性IFN-a暴露，因此降低抗病毒药物通常引起的副作用。这可产生慢性HBV的新治疗，可能阻止肝癌和其他有关HBV的并发症。cl8/A2mAb和/或E183/A2mAb可与至少一种可示踪剂连接且可能用于体外或体内定量HBV感染的肝细胞。所述可示踪剂可为任何可示踪的生物或化学组分。所述可示踪剂包括但不限于环境剂、血液标记、抗原、农药、药物、化学品、毒素、PCBS、PBBS、铅、神经毒素、血液电解质、代谢物、分析物、NA+、K+、CA+、尿素氮、肌酸酐、生化血液标记和组分、ChE,AChE, BuChe、肿瘤标记、PSA、PAP、CA 125、CEA, AFP、HCG, CA 19-9, CA 15-3, CA 27-29、NSE、羟基丁酸盐、乙酸乙酯、抗疟疾药物如阿莫待喹、蒿甲醚、青蒿素、青蒿酯、阿托伐醌、辛可宁、辛可尼定、氯奎、多西环素、卤方特瑞(halofanthne)、甲氟喹、伯氨喹、乙卩密唳、奎宁、奎纳定、和磺胺多辛；抗生素药物如氨苄青霉素、阿奇霉素、多西环素、红霉素、青霉素、和四环素；抗逆转录病毒药物如阿巴卡韦、阿德福韦、地达诺新、恩替卡韦、茚地那韦、拉米夫定、奈韦拉平、瑞莫夫韦、利托那韦、甲磺酸沙奎那韦、替比夫定、替诺福韦、扎西他滨、和齐多夫定。根据本发明任何方面的TCR样mAb可用于肝细胞癌(HCC)患者。HBV基因组整合到感染细胞中是HCC恶性肿瘤中最一致相关的因子。TCR样mAb可用于解决HCC患者肝活检上的抗原呈递研究。连接至少一种药物的TCR样mAb制备的免疫偶联物可具有杀死癌细胞的能力。HBV免疫治疗的方法可产生残余副作用最小的改良HBV患者治疗的临床应用。cl8/A2mAb和E183/A2mAb可用于获得有关病毒感染细胞的表面和专职抗原呈递细胞上pMHC复合物的呈递、表达模式和分布的精确信息。体外和体内的抗原呈递细胞的直接示踪还可用cl8/A2mAb和/或E183/A2mAb进行。cl8/A2mAb和E183/A2mAb还可用于 cl8/A2mAb和E183/A2mAb分别与抗病毒细胞因子或toll样受体或抗病毒药物的偶联，作为新的免疫治疗策略用于靶向递送免疫偶联物到感染细胞中。人源化mAb-药物偶联物能靶向在表达病毒抗原的HBV感染患者中产生的肝细胞癌。mAb还可通过将其连接合适的荧光团或放射性核而用作诊断剂。按照另一方面，本发明提供生产至少一种杂交瘤、乙肝病毒(HBV)特异抗体或其中片段的至少一种方法，所述方法包括以下步骤a.用至少一种MHC I类分子结合的HBV衍生肽免疫至少一种非人哺乳动物，形成至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；b.选择至少一种对MHC I类分子结合的联HBV衍生肽特异的B细胞；和c.将所选B细胞与至少一种永生细胞融合以产生至少一种杂交瘤，其中所述杂交瘤能生产至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的HBV特异抗体或其片段；和任选地从所述杂交瘤中分离所述KW特异抗体。按照本发明方法的步骤(b)可包含将对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的至少一种B细胞和下述一起孵育i.至少一种生物素化抗原，所述抗原能结合对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；和ii.至少一种抗生物素偶联珠。此生产杂交瘤、HBV特异抗体或其片段的新方法可开发TCR样HLA/HBV特异单克隆抗体，其可靠性高于现有可能。为了制备本发明至少一种HBV特异抗体，可使用通过培养连续细胞系生产抗体分子的任何方法，只要选择对所述抗原特异的B细胞的步骤在与永生细胞融合前进行。更具体地，步骤(b)可用新加坡的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)的磁激活细胞分选(MACS)进行。所述HBV衍生肽可包含以下组分、由其组成或主要由其组成SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :24、其变体、突变或片段的氨基酸序列。用于生产本发明抗体的方法示例示于实施例I。实施例I提供用于生产对SEQ IDNO 3的肽特异的单克隆抗体的方法，所述肽衍生自用BALB/c小鼠的HBV核心抗原。按照另一方面，本发明提供按照本发明的任何方法生产的至少一种分离抗体或其片段。按照另一方面，本发明提供检测和定量对象中至少一种HBV感染细胞的存在和分布的方法，所述方法包括a.将本发明任何方面的至少一种抗体或其片段与从至少一个对象获得的至少一种样品接触；和b.检测和定量抗体与所述HBV感染细胞的结合。所述抗体可特异性结合HBcl8-27、HBel83-191、其变体、突变或片段或HBV感染细胞的其片段。所述结合证实所述细胞可被HBV感染、所述样品含至少一种HBV感染细胞和/或所述对象可为HBV阳性。更具体地，本方法可为体外检测和定量的方法。 按照另一方面，本发明提供检测对象中HBV相关的肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包括a.将本发明任何方面的至少一种抗体或其片段与从至少一个对象获得的至少一种样品接触；和b.检测抗体与所述HBV相关的HCC感染细胞的结合。本发明任何方面的检测和定量方法可为诊断的非侵入性方法且还可用于研究HBV的数种免疫学方面。所述方法可通过流式细胞分析和免疫组化的标准方法用于检测和直接观察抗原(PMHC)复合物的表型分析的存在，通过确定APC、HCC肿瘤细胞和淋巴细胞上pMHC的表达用于研究和分析抗原呈递。本方法可用于确定抗原呈递期间某些事件的存在及其背后的原因，且可观察和定量T细胞表位在APC上的表达。按照其他方面，本发明提供至少一种治疗HBV和/或至少一种HBV相关疾病的方法，所述方法包括给予需要的对象至少一种按照本发明任何方面的抗体或其片段。本发明的抗体可与靶向不同HLA型结合的不同HBV肽的其他相似抗体联合给予。因此所述肿瘤细胞和病毒可能没有机会应用于此类治疗中。按照另一方面，本发明提供按照本发明任何方面的至少一种抗体或其片段用于药物应用。按照另一方面，本发明提供本发明任何方面的抗体或其片段在制备用于治疗HBV和/或至少一种HBV相关疾病的药物中的至少一种应用。BV相关疾病包括硬化、HCC等。所有HCC中的75%由慢性HBV引起。按照其他方面，本发明提供至少一种用于诊断HBV和/或至少一种HBV相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本发明的抗体或其片段。按照一个方面，本发明提供至少一种分离的核酸分子，其编码(a)本发明任何方面的抗体或其片段的至少一种轻链，其中所述轻链包含SEQ IDNO USEQ ID NO :32、其变体、突变或片段；和/或(b)本发明任何方面的抗体或其片段的至少一种重链，其中所述重链包含SEQ IDN0:2、SEQ ID NO :33、其变体、突变或片段。按照另一方面，本发明提供确定对象中疫苗效力的方法，所述方法包括-给予所述疫苗后5-15天，将本发明任何方面的至少一种抗体或其片段与获自所述对象的至少一种样品接触；和-检测抗体或其片段与HBV感染细胞的结合；和-对比给予所述疫苗前后HBV感染细胞的数量，其中HBV感染细胞数量减少说明疫
苗有效。确定HCC细胞中HBV抗原的存在可用于检测疫苗的抗原加工或不同个体中抗原加工的缺陷。按照本发明任何方面的TCR样抗体还可用于疫苗验证，作为确定所需HBV-T细胞表位是否在细胞上展示的有用工具和作为理解体内和体外抗原加工和呈递的命运的研究试剂，且可在实体瘤细胞、转移瘤细胞、接触化学剂的细胞、接触疫苗后的肿瘤细胞等之间评估这些过程。 按照另一方面，本发明提供确定细胞中抗原加工和呈递的精确性的方法，所述方法包括用本发明任何方面的至少一种抗体或其片段与所述细胞接触的步骤。按照另一方面，本发明提供包含本发明核酸的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。具体地，所述载体可包含但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒载体。更具体地，逆转录病毒载体可用于体外、离体或体内递送所述构建体。按照本发明任何方面的TCR样抗体可用作治疗剂，作为抗体或双特异性分子/双特异性抗体，或者可用作药物转运载剂将有毒物质载荷转运到肿瘤细胞和/或病毒感染细胞中。本发明任何方面的TCR样抗体还可用于致癌物概况分析以提供癌症检测和治疗的个体化方法。因此，术语“致癌物概况分析”指用TCR样抗体筛选癌细胞以确定HLA I类分子呈递的HBV肽是否展示在HCC的表面。目前总体描述了本发明内容，通过参照以说明方式提供的以下实施例能更容易理解本发明，但这些实施例不应限制本发明。本领域技术人员会理解本发明可实施而不需按照本文提供的方法进行过度实验。所述方法、技术和化学品如所附参考文献所述或来自标准生物技术和分子生物学教科书中的实验方案。
实施例本领域已知且未具体描述的标准分子生物学技术一般按照Sambrook和Russel,Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆实验室手册》)，纽约的冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory) (2001)所述。实施例I抗原/单体的制备靶向的HBV抗原为FLPSDFFPSV的HBc 18-27 (SEQ ID NO :3)。制备的单体为至少一种HLA-A201重链和轻链加SEQ ID NO :3抗原肽的FPLC纯化重组、无膜、完全折叠的异源
三聚体复合物。人主要组织相容性复合物(MHC) I类HLA-A201重链(HC)和轻链(LC) (B2微球蛋白)在BL21大肠杆菌(E. coli)(德国，诺瓦基公司(Novagen))中表达为重组蛋白。所述重链和轻链分离为包含体并溶于8M尿素。然后选择来自HBV的HBc 18-27的SEQ ID NO 3抗原肽并用HLA重链和轻链再折叠以形成体外C18/A2单体。采用阴离子交换色谱纯化所述单体然后C18/A2单体四聚化。抗cl8/A2 TCR样抗体的生成上述步骤的C18/A2单体用作抗原来源以刺激免疫的Balb/C小鼠中的抗体响应。雌性Balb/c小鼠用完全弗氏佐剂中25ii g的纯化C18/A2单体腹膜内免疫(初次给药)(美国西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))，然后用相同单体加不完全弗氏佐剂加强给药(3次加强给药)(美国西格玛-艾尔德里奇公司)。最后一次不含佐剂的加强给药通过与NSl骨髓瘤细胞融合前3天的尾部注射进行。处死该小鼠并通过温和均质化制备脾细胞。通过孵育所述脾细胞和生物素化cl8/A2单体来纯化具有所需特异性的B细胞，所述单体结合对所述单体特异的B细胞表面发现的特异性B细胞受体。然后偶联免疫-磁珠的抗生物素(新加坡美天旎生物技术公司)用 于通过免疫磁性选择法正选择磁柱上结合的B细胞。免疫小鼠的骨髓瘤细胞融合前抗原特异B细胞的预纯化采用连接免疫磁珠的生物素化形式单体，相较标准杂交瘤方法大大改善具有校正特异性的杂交瘤百分比。使用标准技术通过PEG1500(美国西格玛-奥德里奇公司)将所选的B细胞与NSl骨髓瘤细胞(新加坡的新加坡国立大学的Chan Soh Ha教授惠赠)融合。得到的杂交瘤细胞混合物接种在96孔板上并在HAT培养基(美国西格玛-奥德里奇公司)中选择2周。约筛选到1500个杂交瘤细胞用于经流式细胞仪选择所需mAb特异性。SEQ ID NO 3的cl8_27肽脉冲处理或SEQ ID NO 17的Ml肽(GILGFVFTL)脉冲处理的ClR细胞与杂交瘤上清4°C孵育30分钟，清洗并与抗小鼠IgG-alexafluor-488 二抗(美国英杰公司(Invitrogen))再室温孵育30分钟，清洗并用细胞搜索软件在BD FACSCAN流式细胞仪上分析。仅一个克隆(即cl8/A2mAb#449)展现限于cl8/A2单体的所需识别特征且与Ml肽脉冲处理细胞不显示反应性。此阳性克隆通过有限稀释亚克隆2次，稳定扩增并大量收集培养物上清。这些上清中的cl8/A2mAb用蛋白G琼脂糖柱纯化。cl8/A2mAb 的特异性通过孵育获自ATCC的T2细胞和衍生自HBV聚合酶、X和包被蛋白以及衍生自EBV、flu(尤其是H1N1)、CMV的不同HLA-A2限制性肽和各种肿瘤相关抗原表位来检测cl8/A2mAb的特异性。所用的肽序列(即SEQ ID NO : 17-29)在表I中提供。T2细胞与I y M各肽孵育I小时，清洗3次并用0.5 iig cl8/A2mAb染色。清洗3次后，用抗小鼠IgG-AleXaFluor488抗体(美国英杰公司)孵育细胞30分钟，清洗并在流式细胞仪上获得。
"Ti序歹丨JSEQ ID NO
Ml肽 /FECl(Flu)GILGFVFTL17
HBV X,52-60HLSLRGLPV18
Mage A10,254-262GLYDGMEHL19
权利要求
1.一种分离的TCR样抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能特异性结合至少一种HBV衍生肽。
2.如权利要求I所述的抗体，其特征在于，所述HBV衍生肽包括至少一种乙肝核心抗原和/或至少一种乙肝包被抗原。
3.如权利要求I或2所述的抗体，其特征在于，所述HBV衍生肽与主要组织相容性复合物(MHC) I类分子结合。
4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述MHCI类分子是人白细胞抗原(HLA)I类分子。
5.如权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述HLAI类分子是HLA-A2。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述HBV衍生肽为MHC-I肽复合物的部分，所述复合物包含HBV衍生肽和HLA I类分子。
7.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述HBV衍生肽含HBcl8-27和/或HBel83-191、其变体、突变或片段。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自下组 a.杂交瘤细胞系PTA-IO167和/或PTA-11068生产的抗体； b.具有杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的结合特征的抗体； c.与能结合杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的抗原结合的抗体； d.结合包含SEQID NO:3、SEQ ID NO :24、其变体、突变或片段的氨基酸序列的抗原的抗体；和 e.包含至少一种轻链和至少一种重链的抗体，其中所述轻链包含SEQID NO USEQ IDNO :32、其变体、突变或片段的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO :33、其变体、突变或片段的氨基酸序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体为至少一种人、人源化或嵌合抗体。
10.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体用至少一种放射性核和/或荧光团标记。
11.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体连接至少一种药物、抗病毒药物、毒素和/或化疗剂。
12.—种分离的杂交瘤细胞系，所述细胞系以登录号PTA-10167和/或PTA-11068保藏于 ATCC。
13.—种生产至少一种杂交瘤、乙肝病毒(HBV)特异性抗体或其片段的方法，所述方法包括以下步骤 a.用与MHCI类分子结合的至少一种HBV衍生肽免疫至少一种非人哺乳动物，形成至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞； b.选择至少一种对MHCI类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；和 c.将所选B细胞与至少一种永生细胞融合以产生至少一种杂交瘤，其中所述杂交瘤能生产至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的HBV特异性抗体或其片段；和 d.任选地从所述杂交瘤中分离所述HBV特异性抗体。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)包含对MHCI类分子结合的HBV衍生肽特异的至少一种B细胞和下述一起孵育 i.至少一种生物素化抗原，所述抗原能结合对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；和 .至少一种抗生物素偶联珠。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述HBV衍生肽为HBcl8_27或HBel83-1910
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述HBcl8-27包含SEQID NO :3的氨基酸序列和/或HBel83-191包含SEQ ID NO :24、其变体、突变或片段的氨基酸序列。
17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述MHCI类分子是人白细胞抗原(HLA) I类分子。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述HLAI类分子是HLA-A2。
19.一种按照权利要求13-18中任一项所述的方法生产的分离的抗体或其片段。
20.一种检测和定量对象中至少一种HBV感染细胞的存在和分布的方法，所述方法包括 a.将如权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段与从至少一个对象获得的至少一种样品接触；和 b.检测和定量抗体与所述HBV感染细胞的结合。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗体特异性结合HBcl8-27、HBel83-191、其变体、突变或片段或HBV感染细胞的其片段。
22.—种检测对象中HBV相关的肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包括 a.将如权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段与 从至少一个对象获得的至少一种样品接触；和 b.检测抗体与所述HBV连接的HCC感染细胞的结合。
23.一种治疗HBV和/或至少一种HBV相关疾病的方法，所述方法包括将权利要求1_11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段给予需要的对象。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述HBV相关疾病是HCC。
25.如权利要求1-11和19中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段用于药物应用。
26.如权利要求1-11和19中任一项所述的抗体或其片段在制备治疗HBV和/或至少一种HBV相关疾病的药物中的应用。
27.—种诊断HBV和/或至少一种HBV相关疾病的药盒，所述药盒包括如权利要求1_11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段。
28.一种确定对象中疫苗效力的方法，所述方法包括 a.给予所述疫苗后5-15天，将权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段与从所述对象获得的至少一种样品接触；和 b.检测所述抗体或其片段与HBV感染细胞的结合；和 c.对比给予所述疫苗前后HBV感染细胞的数量，其中HBV感染细胞数量减少说明疫苗有效。
29.一种确定细胞中抗原加工和呈递的精确性的方法，所述方法包括将权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段与所述细胞接触的步骤。
30.一种分离的核酸分子，所述分子编码 a.如权利要求1-11和19中任一项所述的抗体或其片段的至少一种轻链，其中所述轻链包含SEQ ID NO=USEQ ID NO :32、其变体、突变或片段；和/或 b.如权利要求1-11和19中任一项所述的抗体或其片段的至少一种重链，其中所述重链包含SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :33、其变体、突变或片段。
31.一种包含权利要求30所述核酸的表达载体。
32.—种包含权利要求31所述表达载体的宿主细胞。
全文摘要
提供至少一种分离的TCR样抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能特异性结合至少一种HBV衍生肽。
文档编号A61K39/42GK102781961SQ201080053680
公开日2012年11月14日 申请日期2010年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者A·贝尔托莱蒂, P·A·麦卡利, S·K·西沙拉马, 朱娟蒂, 陈苏虾 申请人:新加坡国立大学, 新加坡科技研究局