一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方 法。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（HPV)属于乳头瘤病毒科（papillomaviridae)，为无包膜的双链环 状DNA病毒，现在经过完全测序后归类的HPV可分为100多个基因型。根据其致癌性可分 为"低危"型和"高危"型。前者包括HPV6、HPV11等，主要引起良性的生殖器扼和低度的宫 颈上皮坏死（CIN);后者包括HPV16、HPV18等，它们的感染是引发宫颈癌的主要原因。在大 多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95%W上的生殖道感染能在3到5 年内痊愈。但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的一系列的病变发展为宫颈癌。宫颈 癌是危害女性健康的第二大恶性肿瘤，95%W上的宫颈癌病理组织中能够检测到HPVDNA， 超过15个HPV型与宫颈癌的发病有关，因而宫颈癌成为第一个由世界卫生组织（WHO)确认 的完全由病毒感染所引起的癌症。全球每年发病50万例，主要发生于发展中国家，我国每 年新发病例约13. 5万，约占世界宫颈癌新发病例总数的1/4,死亡人数约为5万人。开发、 研制HPV预防性疫苗被认为是预防HPV感染及宫颈癌的最根本手段。而预防性疫苗成功与 否的关键是其能否诱导有效的的体液免疫，只有产生高滴度针对HPV的中和抗体才能抵抗 外来HPV的感染。因此建立稳定、有效的疫苗评价系统，检测疫苗免疫反应的保护效果，对 于疫苗的研制和质控具有重要意义。
[000引但由于HPV的生命周期与细胞的分化状态密切相关，无法在体外通过传统的细胞 培养系统进行生长繁殖，且从被感染的病理组织中提取的病毒量太少，不能满足中和试验 的需要。Buck等利用乳头瘤病毒（PV)能非特异包装DNA的特性，将含密码子优化的PV晚 期蛋白L1、L2基因的质粒与表达GFP的报告质粒共转染，48小时后收取细胞裂解液，成功产 生了高滴度的假病毒，该种假病毒与天然病毒结构和抗原表位类似，可体外模拟HPV感染， 对于HPV的生物学研究、抗体中和活性的鉴定和疫苗开发都有重要意义。Pastrana等用优 化的基因共转染产生了包裹分泌性碱性磯酸酶（SEA巧报告基因的假病毒，并在此基础上 建立了基于SEAP的检测HPV中和抗体的方法。
[0004] 直接化ISA法是检测抗体最常用的方法，该方法首先将主要衣壳蛋白L1形成的病 毒样颗粒（VL巧做适当稀释后包被化ISA板，封闭后加入倍比稀释的待测血清，再加入酶标 的二抗，底物显色，通过酶标仪读取每孔光密度值，判断血清中的中和抗体滴度。该方法的 缺点是：直接ELISA只能初步测定总抗体滴度，而非中和抗体滴度。葛兰素史克（GSK)公司 HPV疫苗临床试验免疫学检测所用的是该方法，所用的包被抗原是GSK公司生产的抗原，与 其他企业的检测结果缺乏可比性。
[0005] 竞争抑制化ISA是用VLP包被封闭后，加入待测血清与辣根过氧化物酶（HR巧标 记的中和单抗的混合物，室温反应后洗漆，然后加入底物进行显色检测。该方法的缺点是： 利用该方法检测中和抗体时，待测血清中不与HRP标记的中和单抗竞争VLP中特定表位的 中和抗体不能被检测到，因此在竞争抑制ELISA法中HRP标记的中和单抗应是针对VLP主 要中和表位的单抗。另外，待测血清中存在的某些非中和抗体可能会在构象上阻止VLP与 HRP标记的中和单抗结合，造成假阳性结果，默沙东（Merck)公司HPV疫苗临床试验免疫学 检测所用的是在该方法基础上改进的Luminex方法，所用的包被抗原和抑制性中和单抗都 是公司特有的，该检测结果与其他企业的检测结果缺乏可比性。
[0006] 基于SEAP(分泌性碱性磯酸酶）的假病毒中和抗体检测方法：该方法通过化学发 光检测仪细胞表达分泌的SEAP来确定样本中和抗体的水平。缺点；祀细胞SEAP的本底值 较高，难于制备高滴度的假病毒，虽然能实现高通量，但操作相对较复杂，且试验成本较高， 不适用于大规模的临床试验或临床样本的流行病学调查。
[0007] 基于Glue(长腹水圣巧光素酶）的假病毒中和抗体检测方法；该方法，利用了 Glue表达产物稳定和易于检测的特点，克服了基于SEAP方法的缺点，可W制备高滴度的假 病毒，并能初步实现高通量检测。缺点：该方法一次只能检测针对一种型别假病毒的中和抗 体，而现在的HPV疫苗都是多种型别抗原组成的多价疫苗（GSK的2价疫苗，Merck的4价 及9价疫苗，我国在研的多种疫苗有2价、3价、4价、6价、9价和13价疫苗），对于不同型别 抗体的检测只能分别制备改型别假病毒，进行单独检测。用该方法对于上万份的临床样本 进行多种中和抗体检测的工作量将会非常巨大。
[000引世界卫生组织（WHO)在其发布的《HPVVLP疫苗质量、安全性及效力评价指导原 贝1J》指出中和实验是评价HPV疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的"金标准"。目前的试验 方法难于检测大规模临床样本的中和抗体水平，特别是对于多价HPV疫苗临床评价中和抗 体检测，亟需开发一种灵敏度高、特异性好、周期短且能实现高通量检测的方法。
【发明内容】
[0009] 有鉴于此，本发明提供一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法。该方法操 作简便、检测周期短（72小时）、灵敏度高、可重复性好、结果判读客观、高通量、样品需求量 少、检测成本低、方法可标准化，便于实验室间推广、可同时检测针对多种型别病毒的中和 抗体，更接近疫苗免疫后的真实状况。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0011] 本发明提供了一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法，包括如下步骤：
[0012] 步骤1 ;获得结构基因表达质粒pi化Lw和pi化Lw;
[0013]步骤2;将步骤1所述结构基因表达质粒pi化Lw和结构基因表达质粒pi化Lw与巧 光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP、巧光蛋白报告质粒pRwB共转染真核表达细胞，获得假病毒；
[0014] 步骤3 ;将待测样本和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞， 表达巧光蛋白，经巧光斑点计数，获得检测样本斑点数；
[0015] 步骤4 ;将培养基和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表 达巧光蛋白，经巧光斑点计数，获得病毒对照斑点数；
[0016] 步骤5 ;将培养基稀释，经巧光斑点计数，获得细胞对照斑点数；
[0017] 步骤6 ;获得感染抑制率（％ ) =[1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数）/(病 毒对照斑点数-细胞对照斑点数）]X100 ;
[0018] 步骤7 ;W所述待测样本的稀释度作为X，W所述感染抑制率作为Y，用 Reed-Muench法获得所述待测样本的中和滴度IC50 ;
[0019] 步骤8 ;所述待测样本的中和滴度IC50 > 40时，为HPV型特异性中和抗体阳性。
[0020] 基于GFP的检测方法是经典的HPV中和抗体检测方法，其结果的判定方式主要有 两种；一是流式细胞仪读取GFP阳性细胞比例，计算抗体对病毒感染的抑制率；二是通过巧 光显微镜观察，估算GFP阳性细胞比例，计算抗体对病毒感染的抑制率。前一种方法操作繁 琐，W检测一块96孔板为例，需要90分钟左右，而且细胞消化后，会出现细胞活力降低，表 达巧光的泽灭，产生检测误差。后一种方法通过巧光显微镜观察，主观性强，并且原始检测 结果无法保留。由于上述两种结果判定方法的缺陷，国外已基本不采用该方法。巧光斑点 计数（Fluorospot)方法，虽然已被应用于细胞免疫分析，主要通过检测分泌到细胞外的细 胞因子，来分析机体的细胞免疫水平，并未应用于活细胞直接表达巧光蛋白的检测，在HPV 中和抗体检测中也未见报道。
[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤2所述真核表达细胞为 293FT细胞。
[0022] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤2所述共转染真核表达 细胞具体为：
[002引步骤（1);膜酶消化293FT细胞，于37°C，5%C02的条件下培养；
[0024] 步骤（2);利用Lipofectamine2000将结构基因表达质粒pi化Lw和pi化Lw分别 与巧光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP和pRwB共转染293FT细胞。
[0025] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤（2)具体为：
[0026] 步骤①：待细胞汇合率达50%时，取所述结构基因表达质粒和所述巧光蛋白报告 质粒各15yg溶于1. 875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混匀；
[0027] 步骤②：取75y1Lipofectamine2000,溶于1. 875ml无抗性、无牛血清的培养基 中，混匀，室温静置5min，获得Lipofectamine2000混合液；此步骤不超过25min;
[002引步骤⑨；将所述Lipofectamine2000混合液加入质粒混合液中，轻柔混匀，室温解 育 20min;
[0029] 步骤④：将步骤⑨获得的解育好的混合液与步骤1培养获得的293FT细胞混匀；
[0030] 步骤⑥：于37°C、5%C〇2的条件下，解育6小时后，换液；
[0031] 步骤⑧：转染48小时后收集细胞。
[0032] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤⑧具体为：
[003引步骤（A);转染后48小时，弃去细胞的培养基上清；
[0034] 步骤炬）；用膜酶消化步骤（A)获得的细胞，完全培养基终止，收集细胞悬液；
[00对 步骤似：离屯、210Xg，5min，弃上清；
[0036] 步骤做；用1ml DPBS-Mg将细胞重悬，将细胞悬液离心弃上清。
[0037] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤（1)具体为：膜酶消化 293FT细胞，计数，将6X1〇6个细胞/15ml接种于75cm2细胞培养瓶中，于37°C，5 %C02的 条件下培养。
[003引在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤2所述获得假病毒包括 细胞裂解、盐抽提、假病毒的滴定。