[0039] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中细胞裂解具体为向共转 染后的真核表达细胞加入与等体积的细胞裂解液，混匀，37°C解育24小时；所述细胞裂 解液为；1/20 体积的 10 %TritonX-100 (Pierce#28314)(终浓度为 0. 5 % )，0. 1 % 的 Benzonase. 0. 1%的PlasmidSafe, 1/40 体积Imol/L的硫酸锭（pH9)。；
[0040] 所述盐抽提具体为：
[0041] 步骤（1);弃去所述细胞裂解液，冰浴5min;
[0042] 步骤（2);加入细胞0. 17倍体积的5M的化Cl溶液，使盐浓度调整为850mmol/L;
[0043]步骤（3);冰浴 10 ~20min;
[0044]步骤（4);离屯、5000Xg，lOmin。
[0045] 步骤巧）；取上清，分装、-70°C冻存。
[0046] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中所述假病毒的滴定具体为：
[0047] 步骤（1);预先6小时铺293FT细胞于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为1. 5Xl〇4 个/lOOy1，于37°C，5%C〇2的条件下培养；
[0048] 步骤（2);将所述假病毒进行起始稀释度为1000倍的倍比稀释，获得假病毒稀释 液；
[0049] 步骤（3);在所述96孔细胞培养板中，每孔加入100y1假病毒稀释液；
[0050] 步骤（4);置于37°C，5%C〇2的条件下培养72小时；
[0化1] 步骤巧）：用Florospot巧光斑点计数仪扫描计数每孔巧光斑点数；
[0化引步骤化）；用Reed-Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量（TCID50)，即 病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度；
[0化3] 所述用Reed-Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量（TCID50)具体为；
[0054] 步骤①：计算各病毒稀释度阳性孔数目（a)和阴性孔数目化）；
[0055] 步骤②：计算阳性和阴性孔的累积数；阳性孔累积数由下向上累计（C)，阴性孔累 积数由上向下累计（d);
[0056] 步骤⑨；计算阳性孔的百分比：比率=(C)/〔（c) + (d) ) X 100 ;
[0化7] 步骤④：计算距离比例：距离比例=(大于50%的阳性百分比一50)/(大数于 50 %的阳性百分比一小于50 %的阳性百分比）；
[0化引步骤⑥；TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+距离比 例X稀释系数的对数。
[0化9] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤3具体为：
[0060] 步骤（1);预先6小时铺293FT细胞于96孔板，每孔细胞数为1. 5X104个/100y1， 于37°C，5%CA的条件下培养；
[0061] 步骤（2);将假病毒按照固定的假病毒接种量（200TCID50/孔）进行稀释，将包 含绿色巧光蛋白的HPV16和包含红色巧光蛋白的HPV18的两种假病毒等量混合，终体积为 60y1的假病毒稀释液；
[0062] 步骤（3);将待测样本做初始稀释度为1:40的4倍倍比稀释，获得待测样本稀释 液；
[0063] 步骤（4);在96孔板中，将所述假病毒稀释液和所述待测样本稀释液等体积混合 (60y1+60y1)，每份样品作双复孔；
[0064] 步骤巧）；于4°C放置1小时；
[0065] 步骤做；从各孔中吸取100y1的假病毒血清混合物贴壁缓缓加入预先已铺好细 胞的培养板对应孔中，混匀；
[0066] 步骤（7);置于37°C，5%C〇2的条件下培养72小时；
[0067] 步骤巧）：用Fluorospot巧光斑点计数仪扫描计数每孔巧光斑点数。
[0068] 具体的，本发明提供的一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法具体为：
[0069] 假病毒的制备：
[0070] 结构基因表达质粒和报告质粒共转染293FT细胞；
[0071] (1)膜酶消化293FT细胞，计数，将6X106个细胞/15ml接种于75cm2细胞培养瓶 中，37°C，5%C02的解箱中培养。
[007引 （2)待细胞汇合率达50%左右时，利用Lipofectamine2000将结构基因表达质粒 (pi化Lw和pi化Lw)分别与巧光蛋白报告质粒（PCDNA3-GFP和pRwB)共转染293FT细胞。 [007引 做取结构基因表达质粒和报告质粒各15yg溶于1. 875ml无抗性、无牛血清的培 养基中，轻柔混匀。
[0074] (4)取75y1Lipofectamine2000,溶于1. 875ml无抗性、无牛血清的培养基中，轻 柔混匀，室温静置5min，此过程不宜超过25min。
[0075] (5)将Lipofectamine2000混合液加入质粒混合液中，轻柔混匀，室温解育20min， 此时溶液可能出现轻微浑浊。
[0076] (6)将解育好的混合液加入已接种好细胞的培养瓶中，轻柔的前后左右混匀。
[0077] (7)将细胞培养瓶重新置于细胞培养箱中，37°C、5 %C〇2,解育6小时后为细胞换 液。
[007引 （8)转染48小时后收集细胞。
[0079] 转染细胞的收集；
[0080] (1)转染后48小时，弃去细胞培养瓶中的培养基上清。
[0081] 似用膜酶消化细胞，完全培养基终止，将细胞悬液转移至50ml离屯、管中。
[00間（3)离屯、210Xg，5min，弃上清。
[008引 （4)用1mlDPBS-Mg将细胞重新悬起，将细胞悬液转移至1. 5ml离屯、管中，离屯、，弃 上清。
[0084] 细胞的裂解；
[0085] 向含细胞沉淀的离屯、管中加入与细胞沉淀等体积的细胞裂解液，混匀，放至培养 箱中，37°C解育24小时。
[0086] 盐抽提；
[0087] (1)取出细胞裂解液，冰浴5min。
[00能](2)加入0. 17倍体积的5M的化C1溶液，使盐浓度调整为850mmol/L。
[0089] (3)冰浴 10 ~20min。
[0090] (4)离屯、5000Xg，lOmin。
[0091] (5)取上清，分装、-70°C冻存。
[009引假病毒的滴定：
[009引 （1)预先6小时铺293FT细胞于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为1.5X104个 /lOOy1，37°C，5%C02解箱中培养。
[0094] (2)将各型假病毒分别进行起始稀释度为1000倍的倍比稀释，共9个稀释度。
[0095] (3)在96孔细胞培养板中，每孔加入100y1假病毒稀释液，每型假病毒每种稀释 度8个复孔。
[0096](4)将细胞培养板置于37°C，5%C〇2的解箱中培养72小时。
[0097] (5)用Florospot巧光斑点计数仪扫描计数每孔巧光斑点数。
[009引 （6)计算组织细胞培养半数感染量（TCID50)，即病毒感染一半组织细胞时的病毒 稀释度，用Reed-Muench方法计算；
[0099] ①计算各病毒稀释度阳性孔数目（a)和阴性孔数目化）；
[0100] ②计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累计（C)，阴性孔累积数 由上向下累计（d);
[OW] ⑨计算阳性孔的百分比；比率=(c)/〔（c) + (d))XlOO;
[0102] ④计算距离比例：距离比例=(大于50%的阳性百分比一50)/(大数于50%的阳 性百分比一小于50%的阳性百分比）；
[0103] TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+距离比例X稀 释系数的对数；
[0104] 待测血清中和抗体的检测：
[0105] (1)预先6小时铺293FT细胞于96孔板，每孔细胞数为1. 5X1〇4个/100y1，37°C， 5%C〇2解箱中培养。
[0106] (2)将假病毒按照固定的假病毒接种量（200TCID50/孔）进行稀释，将两种假病毒 (包含绿色巧光蛋白的HPV16和包含红色巧光蛋白的HPV18)等量混合，终体积为60y1。
[0107] (3)将待测血清做初始稀释度为1:40的4倍倍比稀释。
[0108] (4)在96孔稀释板中，将假病毒稀释液和待测血清稀释液等体积混合 (60y1+60y1)，每份样品作双复孔，同时设立培养基替代血清的病毒对照孔及只加培养基 细胞对照孔。
[0109] (5)将稀释板4°C放至1小时。
[0110] (6)从稀释板各孔中吸取100y1的假病毒血清混合物（或培养基）贴壁缓缓加入 预先已铺好细胞的培养板对应孔中，轻拍培养板四周混匀。
[0111] (7)将细胞培养板置于37°C，5%C02的解箱中培养72小时。
[0112] (8)用Fluorospot巧光斑点计数仪扫描计数每孔巧光斑点数，公式为：感染抑制 率（％ ) = [1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数）/(病毒对照斑点数-细胞对照斑点 数）]X100。
[0113](9)用Reed-Muench法计算样本的中和滴度IC50 (半数抑制剂量），中和滴度高于 40的样本被认为是HPV型特异性中和抗体阳性样本。
[0114] 本发明提供的方法基于血清样品中针对人乳头瘤病毒（HPV)特异性中和抗体可 W阻断假病毒感染细胞而建立的。首先，利用lip〇fectamine2000脂质体共转染技术，分别 将不同型别HPV晚期蛋白L1L2表达质粒与巧光蛋白表达质粒共转染真核表达细胞，48小时 后收获假病毒。假病毒感染真核细胞（293TT或293FT)后，表达巧光蛋白，通过巧光斑点计 数仪（Fluorospot)可W得到感染细胞的数量（图1A)。若待测血清中含有的HPV特异性中 和抗体，可W与病毒表面相应表位结合，从而阻断病毒进入细胞内，导致细胞不被感染或感 染细胞数量降低（图