2Fluorospot斑点计数与流式细胞仪阳性细胞比例的相关性
[0184] 基于绿色巧光蛋白的HPV假病毒中和抗体检测结果判定的经典方法是根据流式 细胞仪阳性细胞比例来计算的，因此首先比较Fluorospot斑点计数仪和流式细胞仪检测 结果的相关性，将实施例1制备的分别包含绿色巧光蛋白巧GF巧和红色巧光蛋白（RF巧的 HPV16和HPV18假病毒进行病毒滴定，然后用Fluorospot和流式细胞仪分别进行计数，然后 进行线性回归分析，4种假病毒的检测结果的线性相关系数R2值都在0. 99W上（图2)，说 明对于两种巧光蛋白假病毒的计数，巧光斑点计数和流式细胞仪具有较好的一致性。
[0185] 病毒量的选择：对两份不同的样本，在不同病毒量的情况下，检测样本的中和抗 体滴度。随着假病毒加入量的减少，病毒对照（只加细胞和假病毒，不加血清样本的检测 孔）检测值逐渐降低。对同一份血清样本，当病毒量逐渐降低时，其IC50的检测值逐渐升 高，即检测灵敏度随病毒量的增加而降低。但是当假病毒加入量使阳性细胞百分比降低至 约5%时，中和曲线的线性相关系数R2会显著减低，为0. 9左右，如果病毒加入量增加至高 于15%时，R2均高于0. 99,因此建议加入病毒产生的阳性细胞百分比不低于15%，对应的 HPV16-EGFP检测斑点数为300左右，对应的HPV8-RFP检测斑点数为400左右（Fluorospot 灵敏度设置值为200)。
[0186] 灵敏度设置值对检测结果的影响：
[0187]Fluorospot检测仪可W通过调整灵敏度设置值来调整检测的灵敏度，如图4所 示，当灵敏度设置值越高时，读出的斑点数越多，但当灵敏度设置值太高时，会出现失真的 情况，没有斑点的孔中也会读出斑点数，而灵敏度设置值太低时，会出现斑点漏读的情况。 对于EGFP病毒，灵敏度设置值对检测结果的影响更大，如图5所示，当随着灵敏度设置值的 增大，流式细胞仪的检测结果与巧光斑点计数结果的线性相关系数R2先增大后减小，对于 EGFP病毒，当设置值在200-230之间时，R2大于0. 99,对于RFP病毒，当设置值在180-250 之间时，R2大于0. 99,最终将灵敏度设置值定为215。
[0188] 方法的重复性：对3份临床实验样本，用HPV16-EGFP和HPV18-RFP混合假病毒毒 检测中和抗体滴度IC50,在不同时间重复3次实验，每次实验分别检测样本5次，计算实验 内和实验间的变异度，CV值均小于30%，检测重复性较好（表1)。
[0189] 表1.重复性结果
[0190]
【主权项】
1. 一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1 :获得结构基因表达质粒pl6LLw和pl8LLw ; 步骤2 :将步骤1所述结构基因表达质粒pl6LLw和结构基因表达质粒pl8LLw与荧光 蛋白报告质粒PCDNA3-GFP、荧光蛋白报告质粒pRwB共转染真核表达细胞，获得假病毒； 步骤3 :将待测样本和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表达 荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得检测样本斑点数； 步骤4 :和步骤2获得的假病毒稀释后与培养基混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光 蛋白，经荧光斑点计数，获得病毒对照斑点数； 步骤5 :将培养基加入真核细胞，经荧光斑点计数，获得细胞对照斑点数； 步骤6:获得感染抑制率（％) = [1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数V(病毒对 照斑点数-细胞对照斑点数）]X 100 ; 步骤7 :以所述待测样本的稀释度作为X，以所述感染抑制率作为Y，用Reed-Muench法 获得所述待测样本的中和滴度IC50 ; 步骤8 :所述待测样本的中和滴度IC50 > 40时，为HPV型特异性中和抗体阳性。
2. 根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤2所述真核表达细胞为 293FT细胞。
3. 根据权利要求1或2所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤2所述共转染真核表 达细胞具体为： 步骤⑴：胰酶消化293FT细胞，于37°C，5% 0)2的条件下培养； 步骤（2):利用Lipofectamine2000将结构基因表达质粒pl6LLw和pl8LLw分别与焚 光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP和pRwB共转染293FT细胞。
4. 根据权利要求3所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤（2)具体为： 步骤①：待细胞汇合率达50%时，取所述结构基因表达质粒和所述荧光蛋白报告质粒 各15 y g溶于I. 875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混勾； 步骤②：取75 y I Lipofectamine2000,溶于I. 875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混 勾，室温静置5min，获得Lipofectamine2000混合液；此步骤不超过25min ; 步骤③：将所述Lipofectamine2000混合液加入质粒混合液中，轻柔混勾，室温孵育 20min ； 步骤④：将步骤③获得的孵育好的混合液与步骤1培养获得的293FT细胞混匀； 步骤⑤：于37°C、5% 0)2的条件下，孵育6小时后，换液； 步骤⑥：转染48小时后收集细胞。
5. 根据权利要求4所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤⑥具体为： 步骤（A):转染后48小时，弃去细胞的培养基上清； 步骤（B):用胰酶消化步骤（A)获得的细胞，完全培养基终止，收集细胞悬液； 步骤（C):离心210Xg，5min，弃上清； 步骤（D):用Iml DPBS-Mg将细胞重悬，将细胞悬液离心，弃上清。
6. 根据权利要求3至5任一项所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤（1)具体为： 胰酶消化293FT细胞，计数，将6 X IO6个细胞/15ml接种于75cm 2细胞培养瓶中，于37°C， 5% CO2的条件下培养。
7. 根据权利要求1至5任一项所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤2所述获得假 病毒包括细胞裂解、盐抽提、假病毒的滴定。
8. 根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，细胞裂解具体为向共转 染后的真核表达细胞加入与等体积的细胞裂解液，混匀，37°C孵育24小时；所述细胞裂 解液为：1/20 体积的 10 % Triton X-IOO (Pierce#28314)(终浓度为 0? 5 % )，0? 1 % 的 Benzonase. 0? 1%的 Plasmid Safe，1/40 体积 lmol/L 的硫酸按（pH 9); 所述盐抽提具体为： 步骤（1):弃去所述细胞裂解液，冰浴5min; 步骤（2):加入细胞0. 17倍体积的5M的NaCl溶液，使盐浓度调整为850mmol/L ; 步骤（3):冰浴10~20min ; 步骤（4):离心 5000 X g，IOmin ; 步骤（5):取上清，分装、-70°C冻存。
9. 根据权利要求7或8所述的高通量检测方法，其特征在于，所述假病毒的滴定具体 为： 步骤（1):预先6小时铺293FT细胞于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为I. 5 X IO4个 /lOOyl，于37°C，5% 0)2的条件下培养； 步骤（2):将所述假病毒进行起始稀释度为1000倍的倍比稀释，获得假病毒稀释液； 步骤（3):在所述96孔细胞培养板中，每孔加入100 y 1假病毒稀释液； 步骤⑷：置于37°C，5% CO2的条件下培养72小时； 步骤（5):用Florospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数； 步骤（6):用Reed - Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量（TCID50)，即病毒 感染一半组织细胞时的病毒稀释度； 所述用Reed - Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量（TCID50)具体为： 步骤①：计算各病毒稀释度阳性孔数目（a)和阴性孔数目（b); 步骤②：计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累计（c)，阴性孔累积数 由上向下累计（d); 步骤③：计算阳性孔的百分比：比率=(C)/〔（c) + (d)〕X100; 步骤④：计算距离比例：距离比例=(大于50%的阳性百分比一 5〇V(大数于50%的 阳性百分比一小于50%的阳性百分比）； 步骤⑤：TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+距离比 例X稀释系数的对数。
10. 根据权利要求1至9任一项所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤3具体为： 步骤⑴：预先6小时铺293FT细胞于96孔板，每孔细胞数为I. 5 X IO4个/100 y 1，于 37°C，5% 0)2的条件下培养； 步骤（2):将假病毒按照固定的假病毒接种量（200TCID50/孔）进行稀释，将包含绿色 荧光蛋白的HPV16和包含红色荧光蛋白的HPV18的两种假病毒等量混合，终体积为60 y 1 的假病毒稀释液； 步骤（3):将待测样本做初始稀释度为1:40的4倍倍比稀释，获得待测样本稀释液； 步骤（4):在96孔板中，将所述假病毒稀释液和所述待测样本稀释液等体积混合 (60 y 1+60 y I)，每份样品作双复孔； 步骤（5):于4°C放置1小时； 步骤（6):从各孔中吸取100 y 1的假病毒血清混合物贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的 培养板对应孔中，混匀； 步骤（7):置于37°C，5% CO2的条件下培养72小时； 步骤（8):用Fluorospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法。本发明构建了包含EGFP和RFP不同荧光蛋白报告基因的HPV假病毒，建立了包含不同报告基因假病毒混合检测不同中和抗体的检测方法。该方法操作简便、检测周期短(72小时)、灵敏度高、可重复性好、结果判读客观、高通量、样品需求量少、检测成本低、方法可标准化，便于实验室间推广、可同时检测针对多种型别病毒的中和抗体，更接近疫苗免疫后的真实状况。
【IPC分类】G01N33-569
【公开号】CN104880555
【申请号】CN201510346407
【发明人】王佑春, 聂建辉, 黄维金, 吴雪伶
【申请人】中国食品药品检定研究院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月19日