专利名称：肠道病毒71型的中和表位多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人肠道病毒71型中和表位多肽，及其保守性变异体或活性片段，及其相关编码序列，及应用该多肽或保守变异体或活性片段于预防或诊断的用途。
背景技术：
手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。早期发现的手足口病的病原体主要为柯萨奇病毒A16型(以下简称CA16)，肠道病毒71型(以下简称EV71)最早是在1969年首次从美国加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离获得，但一直到1974年EV71才被鉴定并命名。此后EV71与CA16交替出现，成为手足口病的主要病原体。EV71传染性强，易引起暴发或流行。自病毒发现以来在全世界已至少造成十多次爆发流行，波及到美洲、欧洲、澳洲和亚洲的四十多个国家和地区。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行，1975年 保加利亚报告病例750例，其中149人致瘫，44人死亡。20世纪90年代后期，EV71开始东亚地区流行。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4-8月共有2628人发病，4-6月有29例病人死亡。1998年，我国台湾地区发生EV71感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，监测哨点共报告129106例病例，80%有手足口病和中枢神经症状。其中重症病人405例，死亡78例。我国大陆地区自1995年武汉病毒研究所首次从手足口病人中分离出EV71病毒以来，全国很多地区均有报道。2008年3月在安徽阜阳地区流行的也是EV71。由于疫情的严重性和社会的广泛关注，卫生部已经将手足口病列入传染病防治法规定的丙类传染病，并紧急成立了防控组。近年来，EV71引起的手足口病，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，因此开发快速的诊断试剂与安全有效的预防和治疗性疫苗具有重大意义。本实验室利用不同时间、不同地点分离到的EV71不同的代表株免疫小鼠，进行单克隆抗体的制备，已制备出557株对EV71有特异性反应的单抗。并利用基于ELISP0T的EV71高通量中和实验方法对上述单抗的中和活性进行鉴定，发现有6株单抗对目前所用的EV71各代表株均有中和活性，说明EV71病毒可能存在高保守性的中和位点，为EV71的中和表位鉴定提供了突破口。ELISP0T是近年来新兴起来的一种检测T细胞应答的方法。它最早出现于上世纪80年代应用于抗体分泌细胞的研究；1988年首次应用于细胞因子分泌的检测。随着该技术的不断改进和发展，目前已较为成熟和完善，在世界上各大实验室、临床检验上广泛应用，大有完全取代以前种种研究T细胞免疫应答旧方法的趋势。本中心成功建立了基于酶联免疫斑点法(ELISP0T)的EV71、CA16快速中和试验，并申请专利“快速检测病毒中和抗体的方法和试剂盒”一项(专利申请号200910143481. O)。与传统中和试验相比，耗时短(从7天以上缩短为30个小时左右)、通量高、稳定、客观。该方法的基本原理是将待测样品与EV71或CA16病毒混匀孵育一段时间后加到细胞培养板中感染细胞，随后固定细胞，通过EV71或CA16特异性酶标抗体与EV71或CA16病毒特异性结合，而后在TMB显色条件下，被EV71病毒感染的RD细胞出现肉眼可见的蓝色斑点，而未被感染的细胞则无斑点。
发明内容
在第一方面，本发明提供了肠道病毒71型VPl蛋白中位于215-218位氨基酸的中和表位多肽，其氨基酸序列为KQEK(SEQ ID NO :1)。本发明还提供分离的中和表位多肽，其氨基酸序列为KQEK。在第二方面，本发明还提供了上述多肽免疫获得的血清，具有中和肠道病毒71型的能力。在第三方面，本发明提供了本发明上述多肽的变异体。本发明提供了分离的中和表位多肽，其选自(a)中和表位多肽，它是肠道病毒71型VPl蛋白的、含有氨基酸序列KQEK的片段 (其长度可以是5-20个氨基酸，例如5-15个、5-10个氨基酸)，并具有诱导中和抗体产生的能力；(b)中和表位多肽，它是在氨基酸序列KQEK的基础上经一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换而得到的，仍具有诱导中和抗体产生的能力；(c)中和表位多肽，它的氨基酸序列与氨基酸序列KQEK相比不同在于它具有一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换，仍具有诱导中和抗体产生的能力。在一个实施方案中，提供中和表位多肽，它是肠道病毒71型VPl蛋白的、含有氨基酸序列KQEK的片段(其长度可以是5-20个氨基酸，例如5-15个、5_10个氨基酸)，并在氨基酸序列KQEK的基础上经一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸而得到的，仍具有诱导中和抗体产生的能力。在另一个实施方案中，提供中和表位多肽，它是肠道病毒71型VPl蛋白的、含有氨基酸序列KQEK的片段(其长度可以是5-20个氨基酸，例如5-15个、5_10个氨基酸)，它的氨基酸序列与氨基酸序列KQEK相比具有一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸，仍具有诱导中和抗体产生的能力。在另一个实施方案中，提供中和表位多肽，氨基酸序列是TFGEHKQEKDLEYG(SEQ IDNO 2)或者是 FGEHKQEKDLEY (SEQ ID NO 3)或者是 GEHKQEKDLE (SEQ ID NO :4)，更优选地是 EHKQEKDL (SEQ ID NO 5)或者是 HKQEKD (SEQ ID NO 6)或者是 HKQEK (SEQ ID NO 7)或者是 KQEKD (SEQ ID NO :8)。在另一个实施方案中，所述中和表位多肽包含HKQEKD或者HKQEK或者KQEKD。上述多肽，经一个或者几个氨基酸的延伸、替换而得到的变异体，仍具有诱导中和抗体产生的能力，其氨基酸序列优选地是TFGEHKQEKDLEYG或者是FGEHKQEKDLEY或者是GEHKQEKDLE,更优选地是EHKQEKDL或者是HKQEKD或者是HKQEK或者是KQEKD。在第四方面，本发明还提供了包含上述所有任一中和表位多肽的融合蛋白，或所述中和表位多肽与其他蛋白或毒素或脂类等载体(大分子载体或重组载体)偶联或融合而得到的复合物，或者展示上述中和表位多肽的类病毒颗粒。本发明还提供了包含上述所有任一中和表位多肽和其它多肽的融合蛋白。所述中和表位多肽和所述其它多肽任选通过连接序列连接。本发明还提供了由上述所有任一中和表位多肽、其它多肽以及连接所述中和表位多肽和所述其它多肽的任选的连接序列组成的融合蛋白。其中作为融合蛋白一部分的所述其它多肽可以是肠道病毒71型可能暴露于表面的肽段，例如EV71病毒VPl蛋白上的208-232aa区段，其氨基酸序列是YPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGT (SEQ ID NO 9)。连接序列可以是任意可用的限制性内切酶的酶切序列例如BamH I的酶切序列GGATCC、EcoR I的酶切序列GAATTC等。本发明还提供所述中和表位多肽与其他蛋白或毒素或脂类等载体(大分子载体或重组载体)偶联或融合而得到的复合物。所述偶联可以是MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等。所述载体有例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他Y球蛋白等蛋白类载体，另有重组载体可以为多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸2S甘油半胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。
本发明还提供展示上述中和表位多肽的类病毒颗粒。所述中和表位多肽典型地通过与载体蛋白融合，经过蛋白纯化和组装后可形成类病毒颗粒，并将所述中和表位多肽展示在类病毒颗粒表面，使其仍保持诱导中和抗体产生的能力，其中所述载体蛋白优选地为HBcAg0在第五方面，本发明提供了编码上述任何多肽，和所有融合蛋白或类病毒颗粒的核酸序列或包含该核酸序列的核酸构建体或核酸载体。在第六方面，本发明还提供了上述任何核酸载体转化的宿主细胞，例如微生物宿主细胞如大肠杆菌宿主细胞。在第七方面，本发明还提供了上述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒用于制备预防手足口病的疫苗的用途。本发明还提供了上述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，用于预防手足口病。本发明还提供疫苗，其包含上述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，和任选的可药用载体如佐剂。本发明还提供预防手足口病的方法，包括给予动物或者人免疫有效量的上述疫苗或者任何中和表位多肽或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒。在第八方面，本发明还提供了上述所述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒在制备用于诊断手足口病的组合物或者诊断剂中的用途。本发明还提供了上述所述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，用于诊断手足口病。本发明还提供了诊断手足口病的方法，包括用上述所述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒和来自患者的生物样品接触，并检测中和表位多肽或融合蛋白或复合物或类病毒颗粒与样品中可能存在的抗体之间形成的特异性免疫结合物。本发明还提供组合物(如药物组合物或诊断组合物)，包含本发明任何中和表位多肽，或融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，和任选的可药用载体。本发明还提供抗本发明任何中和表位多肽，或融合蛋白或复合物或类病毒颗粒的抗血清，其具有中和肠道病毒71型的能力。
在第九方面，本发明还提供了一种抗体(它可以优选是单克隆抗体或中和抗体)，特异识别上述的任何一种多肽。所述抗体可为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。在一个优选实施方案种，本发明所述的抗体是广谱中和单克隆抗体，对多种(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15种)EV71型病毒具有中和能力。所述广谱中和单克隆抗体的优选例子有例如单抗H3B10和K8G2，产生单抗H3B10和K8G2的小鼠杂交瘤细胞株已于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，位于武汉的武汉大学)进行保藏，保藏日是2011年11 月 08 日，H3B10 的保藏号是 CCTCC-C2011106，K8G2 的保藏号是 CCTCC-C2011105。本发明还提供特异识别上述的任何一种多肽的抗体(它可以优选是单克隆抗体或中和抗体)，用于诊断手足口病或者治疗手足口病。在第十方面，本发明还提供了上述抗体在制备用于诊断手足口病的组合物中的用途。
在第十一方面，本发明还提供了上述抗体在制备用于治疗手足口病的药物组合物中的用途。本发明还提供组合物(如药物组合物或诊断组合物)，包含任何上述抗体，和任选的可药用载体。本发明还提供诊断手足口病的方法，包括将本发明的抗体和来自患者的生物学样品接触，并检测该抗体和样品中可能存在的抗原之间形成的特异性免疫结合物。本发明还提供治疗手足口病的方法，包括给患者(动物或者人)给予本发明的抗体。
图I为pT0-T7-C149的质粒示意图。图2 为 pT0-I7-C149-208_232aa 的质粒示意图。图3为融合蛋白EV71-C149-4纯化样品的SDS-PAGE电泳图，其中I :表达EV71-C149-4的大肠杆菌(E. coli)全部溶胞产物；2 :EV71_C149_4之超声溶胞产物的上清；3 EV71-C149-4超声上清65°C水浴中热变性30min后离心后上清；4 C149蛋白对照。图4为EV71-C149-4重组蛋白组装的类病毒颗粒的电镜图(放大25000倍)。图5 为显示 EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5 与各种单抗之间的结合亲和力的ELISA检测值OD (450/620)的强度雷达图。图6为显示合成肽EV71-7、8、9、10、11、12、13、14与广谱中和抗体K8G2和H3B10之间的结合亲和力的ELISA检测值OD (450/620)的强度矩形图。图 I 为显示合成肽 EV71-CA、CB、CC、CD、CE、CF、CG、CH、Cl、CJ、CK、CL、CM、CN、CO、CP与广谱中和抗体K8G2和H3B10之间的结合亲和力的ELISA检测值OD (450/620)的强度矩形图。图 8 为显示合成肽 EV71-CRA、CRB、CRC、CRD、CRE、CRF、CRG、CRH、CRI、CRJ、CRK、CRL、CRM, CRN、CRO、CRP与广谱中和抗体K8G2和H3B10之间的结合亲和力的ELISA检测值OD (450/620)的强度矩形图。图9为显示EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6与不同稀释度的广谱中和抗体K8G2之间的亲和力的ELISA检测值OD (450/620)的强度矩形图。图10为实施例9所述单抗K8G2的EV71感染保护动物试验中感染后小鼠体重测量结果。横坐标表示感染后天数，纵坐标表示小鼠体重(单位g)。结果显示，在EV71感染新生鼠模型中广谱中和单抗K8G2可有效保护EV71感染鼠免于发病。其中感染组体重增长缓慢，平均每日增长不足lg，体型瘦弱；K8G2保护组平均体重增长接近阴性对照组，体型健康同阴性对照组。图11为在EV71感染新生鼠保护实验中各实验组代表性小鼠的体征图像(实验见实施例9)。A图和B图均为实验开始后第5天的体征，A图左侧鼠为阴性组，右侧鼠为EV71感染组；B图左侧鼠为EV71感染组，右侧鼠为K8G2保护组。
具体实施例方式除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子生物学、生物化 学、免疫学实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规命名和步骤。实施例I广谱中和单抗的鉴定利用基于ELISP0T的EV71高通量中和实验方法(参见200910143481. 0)对本中心制备的557株EV71特异性单抗的中和活性进行鉴定，结果显示其中64株对JS06-52-3毒株具有中和活性。随机选取其中的22株中和单抗，考察其对不同亚型的12株代表性EV71毒株的中和活性。结果见表1，表I数值所表示为各单抗针对不同毒株EV71病毒的中和活性滴度。由表I可知，6株单抗对各代表株均有中和活性，其中H3B10(保藏号CCTCC-C2011106)和K8G2 (保藏号CCTCC-C2011105)为广谱高中和活性单抗，其余16株单抗对3株B4亚型、I株B5亚型和I株C4亚型的EV71毒株均无中和活性。OOOT §2 02 02 §2 0 ^ ' 0000T OTHSld
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权利要求
1.分离的中和表位多肽，其氨基酸序列为KQEK。
2.分离的中和表位多肽，其选自 (a)中和表位多肽，它是肠道病毒71型VPl蛋白的、含有氨基酸序列KQEK的片段(其长度可以是5-20个氨基酸，例如5-15个、5-10个氨基酸)，并具有诱导中和抗体产生的能力； (b)中和表位多肽，它是在氨基酸序列KQEK的基础上经ー个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换而得到的，仍具有诱导中和抗体产生的能力； (c)中和表位多肽，它的氨基酸序列与氨基酸序列KQEK相比相差ー个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换，仍具有诱导中和抗体产生的能力。
3.权利要求2所述的多肽，其中所述中和表位多肽包含HKQEKD或者HKQEK或者KQEKD。
4.权利要求2所述的多肽，其氨基酸序列是TFGEHKQEKDLEYG或者是FGEHKQEKDLEY或者是GEHKQEKDLE，更优选地是EHKQEKDL或者是HKQEKD或者是HKQEK或者是KQEKD。
5.包含权利要求1-4任一项所述多肽的融合蛋白，或所述多肽与其他蛋白或毒素或脂类等载体(如大分子载体或重组载体)偶联或融合而得到的复合物，或者展示上述多肽的类病毒颗粒。
6.编码权利要求1-4任ー项所述多肽，权利要求5中所述融合蛋白或类病毒颗粒的核酸序列或包含该核酸序列的核酸构建体或核酸载体。
7.权利要求5中所述核酸载体转化的宿主细胞。
8.权利要求1-4任ー项所述多肽，或权利要求5所述融合蛋白或复合物或类病毒颗粒用于制备预防手足ロ病的疫苗的用途。
9.权利要求1-4任ー项所述多肽，或权利要求5所述融合蛋白或复合物或类病毒颗粒在制备用于诊断手足ロ病的组合物或诊断剂中的用途。
10.组合物(如药物组合物或诊断组合物)，包含权利要求1-4任ー项所述多肽，或权利要求5所述融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，和任选的可药用载体。
11.抗权利要求1-4任ー项所述多肽，或权利要求5所述融合蛋白或复合物或类病毒颗粒的抗血清，具有中和肠道病毒71型的能力。
12.抗体(所述抗体可以是例如单克隆抗体或者中和抗体)，特异识别权利要求1-4任一项所述的多肽。
13.权利要求12所述抗体，其为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。
14.权利要求13所述的抗体，其是广谱中和单克隆抗体，对多种(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15种化乂71型病毒具有中和能力，优选例如单抗H3B10和K8G2，产生单抗H3B10和K8G2的小鼠杂交瘤细胞株已于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，位于武汉的武汉大学)进行保藏，H3B10的保藏号是CCTCC-C2011106，K8G2的保藏号是CCTCC-C2011105。
15.权利要求12或13或14所述抗体在制备用于诊断手足ロ病的组合物或诊断剂中的用途。
16.权利要求12或13或14所述抗体在制备用于治疗手足ロ病的药物组合物中的用途。
17.组合物(如药物组合物或诊断组合物)，包含权利要求12或13或14所述抗体，和任选的可药用载体 。
全文摘要
本发明涉及肠道病毒71型的中和表位多肽及其用途。具体而言，本发明提供了肠道病毒71型中和表位多肽，及其保守性变异体或活性片段，及其相关编码序列，其融合蛋白或耦联物，及应用该多肽于预防或诊断的用途，本发明还提供特异识别该中和表位多肽的单克隆抗体，及其用于诊断或治疗手足口病的用途。
文档编号A61K39/125GK102690327SQ20111035799
公开日2012年9月26日 申请日期2011年11月11日 优先权日2010年11月12日
发明者何德磊, 夏宁邵, 徐飞海, 程通, 翁祖星, 葛胜祥, 陈毅歆, 陈自敏 申请人:厦门万泰沧海生物技术有限公司, 厦门大学