专利名称：预防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于一种生物制品，特别是一种预防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制备方法。
背景技术：
流行性感冒病毒(influenza virus)是引起人类死亡的主要原因之一。它能引起急性呼吸道感染，严重危害人类的健康和生命。
血凝素(hemagglutinin，简称HA)是流感病毒最主要的表面抗原，它能够诱导机体产生相应的中和抗体以中和病毒。流感病毒HA由RNA节段4编码，以A/PR/8/34(H1N1)毒株为例，其RNA节段4由1765个核苷酸组成。开放阅读框(ORF)编码566个氨基酸。HA是典型的I类膜蛋白，其一级结构含有4个结构域信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。HA以三聚体的形式镶嵌在病毒包膜上，每个单体糖蛋白由两个经二硫键连接的蛋白亚单位组成，它们来自于一条前体链(HA0)，经蛋白水解酶的切割而形成，分别命名为HA1和HA2。
预防流感的最好方法就是在流感流行前对人体进行疫苗接种，传统的疫苗主要有裂解疫苗、亚单位疫苗、全病毒灭活疫苗等。由于HA是流感病毒最主要的表面抗原，流感病毒的流行与HA抗原结构的变化密切相关，因此，在流感病毒疫苗的研究中HA占有重要的地位。以去污剂裂解病毒，使病毒灭活，可以制备成裂解疫苗，疫苗的主要成分是HA。亚单位疫苗可以从裂解的病毒中提取纯化，也可以用其它表达系统直接表达，如杆状病毒系统。现在临床上使用的流感病毒疫苗是一种三联全病毒灭活疫苗，它由H1N1、H3N2和B型病毒三种成分组成，其中HA成分占到了48％。传统的疫苗能够有效预防与其HA分子有着相同或交叉反应表位的流感病毒株。但是流感病毒不断发生抗原漂移，为了有效预防流感，这些疫苗的成分不得不经常更换。由于传统疫苗从病毒株分离到疫苗制备完成，需要4-6个月时间，在短时间内难以生产出大量的疫苗，因此不能有效抵御突发性的流感流行，比如由抗原转变造成的大流行以及可能出现的新型禽流感病毒在人类中的流行。
核酸疫苗，又称DNA疫苗，是近十几年发展起来的一种新型疫苗。DNA疫苗是指利用基因重组技术直接将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA)与真核表达载体重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。但是，流感病毒易突变，仍然无法克服DNA疫苗交叉保护能力较差的问题。如果找到A/PR/8/34流感病毒HA基因抗流感病毒的关键序列，然后将各亚型流感病毒的截短片段构建成多价DNA疫苗，就能实现良好的交叉保护作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种预防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制备方法。该疫苗具有实用价值，它能够有效地诱导宿主机体产生持久和全面的免疫应答，同时引起细胞和体液免疫，以达到预防和治疗流感疾病的目的。该疫苗制备方法简单，便于生产、贮存和运输，利于今后推向市场。
本发明所采用的技术方案如下提供预防流感病毒的截短的HA疫苗，其成分是截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因，该基因编码区全长1701核苷酸，编码一个大小为566个氨基酸的蛋白质产物，其中nt1～nt825片段是最短的保护序列。
本发明疫苗由截短后的A/PR/8/34流感病毒HA基因代替全长A/PR/8/34流感病毒HA基因制得。
本发明与现有技术相比，具有以下主要效果(1)确定了A/PR/8/34流感病毒HA基因nt1～nt825片段是最短的保护序列，从而为制备预防流感病毒的截短的HA疫苗(以下简称本疫苗)找到了有效的途径。
(2)根据本发明技术，我们预见可将截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因与其它亚型流感病毒株截短的HA基因构建成预防流感病毒多价DNA疫苗。
(3)根据本发明技术，我们可以预见将截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因表达成蛋白，制备预防流感病毒的蛋白疫苗。
(4)本疫苗接种后，它们所编码的蛋白在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物MHC I类或MHC II类分子结合，能够诱导机体产生持久和全面的免疫应答。
(5)本疫苗作为一种重组真核表达载体，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，真核表达载体稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏。
(6)可将编码不同抗原的基因构建在同一个真核表达载体中，或将不同抗原基因的多种重组真核表达载体联合应用，制备多价DNA疫苗，而且该疫苗可以产生持久的免疫应答，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫，这样就可以避免多次接种带来的应激反应并大大减少人力、物力和财力。
(7)使用安全本疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，具有与天然抗原相同的构象和抗原性，没有减毒、灭活疫苗可能引起的危险，如病毒力返祖或残留病毒颗粒引发疾病，也不会引起机体的不良反应。
(8)实用性强本疫苗有预防流感作用。
基于上述效果，本发明为开发出预防流感病毒的截短的血凝素疫苗提供了一条有希望的途径。
图1是A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列。
图2是A/PR/8/34流感病毒HA基因3′端缺失示意图。
图3是A/PR/8/34流感病毒HA基因5′端缺失示意图。
图4是真核表达载体pCAGGSP7结构示意图。
具体实施例方式
本发明是一种预防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制备方法。
所述疫苗包括(1)预防流感病毒的截短的血凝素核酸疫苗，即预防流感病毒的截短的HA DNA疫苗。(2)预防流感病毒的截短的血凝素蛋白疫苗。
下面结合实例及附图对本发明作进一步说明。
一.预防流感病毒的截短的血凝素疫苗(一)预防流感病毒的截短的HA DNA疫苗1.疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因。
A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列见图1全长1701核苷酸，编码一个大小为566个氨基酸的蛋白质产物，该基因中nt1～nt825片段是最短的保护序列。
2.用A/PR/8/34流感病毒HA基因截短后的序列代替全长A/PR/8/34流感病毒HA基因，制备预防流感病毒的截短的HA DNA疫苗。
(二)预防流感病毒的截短的血凝素蛋白疫苗根据预防流感病毒的截短的HA DNA疫苗的技术，我们可以预见将截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因表达成蛋白，以制备预防流感病毒的蛋白疫苗。
(三)预防流感病毒多价DNA疫苗根据预防流感病毒的截短的HA DNA疫苗的技术，我们可以预见将截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因与其它亚型流感病毒株截短的HA基因构建成预防流感病毒多价DNA疫苗。
二.截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因1.该基因的关键序列是通过如下步骤实现的PCR的方法分别从5’端或3’端对A/PR/8/34流感病毒HA基因(全长1701bp)进行了部分缺失，构建了一系列含缺失HA基因的真核表达载体。
验证方法将这些真核表达载体免疫小鼠，用致死量A/PR/8/34流感病毒攻击，并且观察小鼠的存活率、血清中抗HA抗体的效价和肺部病毒量。
2.具体制备方法包括以下步骤(1)从10日龄鸡胚中增殖得到A/PR/8/34病毒，从中提取RNA，RNA经逆转录反应得到单链cDNA。
(2)根据A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列，在其两个末端设计PCR引物(分别见表1、表2)，正向引物含有XhoI酶切位点，反向引物含有SmaI酶切位点，以cDNA为模板对目的基因进行PCR扩增，将PCR产物用XhoI酶与SmaI酶酶切，酶切片段克隆入真核表达载体pCAGGSP7(见图4)中，获得重组真核表达载体pCAGGSP7/HA。
在扩增5’端缺失片段时，以起始密码子ATG为起点，从A/PR/8/34流感病毒HA基因的5′端缺失3～591个核苷酸，1个缺失为3个核苷酸的倍数。在扩增3’端缺失片段时，以终止密码子TAG为起点，从A/PR/8/34流感病毒HA基因3’端缺失69～903个核苷酸，1个缺失为3个核苷酸的倍数。
上述PCR引物分别见表1、表2表1中HA-5′-d-3表示在HA序列5′端缺失3个核苷酸，真核表达载体编码的是全长HA基因的片段nt4--nt1701，所用F引物如表中所示，R引物是5’aaccccgggtctcagatgcatattctgcactgca-3’，表中其它真核表达载体以此类推。
表2中HA-3′-d-69表示在HA序列3′端缺失69个核苷酸，真核表达载体编码的是全长HA基因的片段nt1--nt1632，所用R引物如表中所示，F引物是5’aacctcgagaatgaaggcaaacctactggtcc-3’，表中其它真核表达载体以此类推。
(3)对所得pCAGGSP7/HA进行测序，确定是A/PR/8/34流感病毒HA基因，并获得其编码区的1701个核苷酸。
(4)用PCR的方法以pCAGGSP7/HA为模板，构建一系列真核表达载体，其中包含了从5’端或者3’端连续缺失的A/PR/8/34流感病毒HA基因，即得到截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因。
例如A/PR/8/34流感病毒HA基因5′端缺失3～591个核苷酸(见图3)；A/PR/8/34流感病毒HA基因从3′端缺失69～903个核苷酸(见图2)。图2和图3中黑色椭圆点为起始密码子，黑色方块为终止密码子。
(5)用QIAGEN纯化试剂盒纯化，用紫外分光光度法测定包含A/PR/8/34流感病毒HA基因或者截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因的真核表达载体的浓度和纯度，DNA的浓度和纯度通过OD260、OD280确定，选取OD260/OD280比值在1.8～2.0的真核表达载体，测序验证。经测序确认无误后免疫小鼠，以鉴定本疫苗效果。
在扩增5’端缺失片段时，在目的片段5’端设置起始密码子ATG。扩增5’端缺失片段的方法是以起始密码子ATG为起点，从A/PR/8/34流感病毒HA基因的5′端缺失3～591个核苷酸共10个连续位点，1个缺失为3个核苷酸的倍数。5’端的10个连续位点所对应的截短的片段是nt4～nt1701、nt7～nt1701、nt13～nt1701、nt16～nt1701、nt25～nt1701、nt43～nt1701、nt52～nt1701、nt151～nt1701、nt220～nt1701和nt592～nt1701。
在扩增3’端缺失片段时，在目的片段的3’端设置终止密码子TAG。扩增3’端缺失片段方法是以终止密码子TAG为起点，从A/PR/8/34流感病毒HA基因3’端缺失69～903个核苷酸20个连续位点，1个缺失为3个核苷酸的倍数。3’端的20个连续缺失位点所对应的截短的片段是nt1～nt1632、nt1～nt1590、nt1～nt1560、nt1～nt1470、nt1～nt1029、nt1～nt972、nt1～nt942、nt1～nt921、nt1～nt906、nt1～nt897、nt1～nt888、nt1～nt870、nt1～nt861、nt1～nt846、nt1～nt831、nt1～nt825、nt1～nt819、nt1～nt813、nt1～nt810和nt1～nt798。
3.真核表达载体pCAGGSP7来源由Niwa et al(Niwa H et al.Gene 1991，108103-200.)构建(见图4)。其方法是将多克隆位点KpnI、XhoI、ClaI、EcoRI、SmaI、NotI和SacI插入pCAGGS的EcoRI位点得到pCAGGSP7。真核表达载体pCAGGS含鸡的β-肌动蛋白启动子成分，SV40的复制起始部位(Ori)，氨苄青霉素抗性基因，CMV瞬时增强子，牛生长激素基因(BGH)多聚A。
三.实验材料和方法1.免疫和病毒攻击每15只4～6周龄的雌性BALB/C小鼠为一组，表达HA基因或者HA基因缺失片段的真核表达载体以每只每次剂量30μg(溶于30μl TE)免疫小鼠。采用股四头肌肌肉注射法，并在接种位点两侧5mm加入正反各3次的电击(100V电压，电击时间为50ms)。初次免疫后第3周再以相同剂量的真核表达载体加强免疫一次。以未免疫的小鼠作为阴性对照组，以免疫全长HA真核表达载体的小鼠作为阳性对照组。第二次免疫后第7天，用致死量(40×LD50)的A/PR/8/34(H1N1)病毒悬液通过滴鼻法攻击小鼠。这种感染能够引起病毒在小鼠肺部快速、广泛的复制，使未免疫小鼠6～8天内死亡。病毒攻击后3～21天内定期观测小鼠的体重变化和死亡情况(见表3)。
表3中1.病毒攻击后第3天采集小鼠心血，用ELISA方法测定IgG抗体(2n)，以每组小鼠的平均值±SD表示；2.体重变化为攻击后第七天的体重丢失与攻击前体重的百分比，以每组小鼠的平均值±SD表示；3.保护情况以攻击后第二十一天剩余的实验小鼠数与实验小鼠数进行对比表示。
“*”表示有显著差异(p＜0.05)2.样本采集病毒攻击后第3天，将每组15只实验小鼠分为两部分其中5只处死用来采集心血测抗体及取肺测肺部病毒量。另外10只用来观测小鼠的体重变化和死亡情况，以判断真核表达载体的保护效果。攻击后用于采血的小鼠用氯仿麻醉，平放在实验桌上，从剑状软骨下方微偏左处以15～20°角插入注射器针头，缓慢地抽取心血直至血流停止。将收集到的血液置于室温1小时左右，使血液凝固并析出血清，然后以5000rpm离心10min，吸出血清，-20℃冰箱保存。收集的血清用来检测真核表达载体诱导产生的IgG抗体量。采完血的小鼠，从小鼠的剑突至颏部腹向切开，取出气管和肺，注入2ml PBS(含0.1％BSA)漂洗3次，并将漂洗液离心去细胞碎片用于测病毒滴度。
3.抗体测定取小鼠血清样本作ELISA，检测IgG抗体。第一，用10μg/ml的A/PR/8/34(H1N1)流感病毒灭活疫苗包被96孔酶标板，37℃温育2小时；第二，PBS-T洗液洗三次后加入封闭液(封闭液为含1％BSA的PBS)4℃过夜；第三，用封闭液稀释血清后，加入酶标板，37℃温育2小时；第四，PBS-T洗三次后，加入用生物素标记的山羊抗鼠IgG二抗，37℃温育1小时；第五，PBS-T洗三次后，加入碱性磷酸酶标记的链菌蛋白37℃温育1小时；最后，PBS-T洗三次后，加入PNPP显色。在30分钟内，用酶标仪(LabsystemsMultiskan Ascent芬兰产)利用双波长(414nm-405nm)测出OD值，最终确定抗体IgG的最高稀释度，以此来确定抗体量的高低(见表3)。
4.病毒滴度测定将气管和肺洗液作系列10倍稀释，用每个稀释度感染培养于24孔板中的MDCK细胞，并将感染细胞置于CO2培养箱中。37℃培养48小时后，观察细胞病变。以引起细胞病变的最低稀释度计算出每个样本的病毒滴度(以TCID50表示)，每个实验组病毒滴度是用每组所有5只小鼠样本的病毒滴度的平均值±SD来表示。
5.统计学分析用Student’s test对实验组间的数据进行评定；P＜0.05定为显著。小鼠存活率结果是否有意义用Fisher’s exact test比较实验组和对照组来确定。
6.实验结果HA基因5′端缺失6个核苷酸仍然具有保护效果；缺失12个核苷酸不具有保护效果。HA基因从3′端缺失876个核苷酸仍然具有保护效果；缺失882个核苷酸不具有保护效果。
(1)A/PR/8/34流感病毒HA基因部分缺失真核表达载体的构建用PCR的方法从模板中扩增得到HA基因部分缺失片段，实验条件如上所示，引物见表1、2。使用限制性内切酶Xho I和Sma I双酶切HA基因部分缺失片段，定向插入到同样用Xho I和Sma I双酶切过的PCAGGSP7表达载体中。所有表达HA基因截短片段真核表达载体经377DNA测序仪测序证实没有发生点突变和阅读框改变。全长HA的序列见图1。构建的HA基因截短片段真核表达载体如图2、3所示(只表示出各真核表达载体所编码的HA基因部分缺失片段，载体部分略去)。
(2)A/PR/8/34流感病毒HA基因5′部分缺失真核表达载体的保护效果真核表达载体HA-5′-d-3和HA-5′-d-6能够保护小鼠抗致死量流感病毒的攻击，实验组小鼠血清IgG抗体水平以及体重变化与全长HA组相当。真核表达载体HA-5′-d-12不能保护小鼠抗致死量流感病毒的攻击，小鼠血清中也检测不到IgG抗体。缺失更多核苷酸的真核表达载体，如真核表达载体HA-5′-d-51，实验结果与真核表达载体HA-5′-d-12的相似。
(3)A/PR/8/34流感病毒HA基因3′部分缺失真核表达载体的保护效果从真核表达载体HA-3′-d-69开始，一直到HA-3′-d-876，HA基因3′端缺失的核苷酸数从69个连续增加到876个，真核表达载体所编码的HA部分缺失片段从1632个核苷酸减少到825个核苷酸，这十六个真核表达载体都能够保护小鼠抗致死量流感病毒攻击，而且与全长HA真核表达载体相比，实验组小鼠在血清IgG抗体以及体重变化方面几乎没有差别。真核表达载体HA-3′-d-882到真核表达载体HA-3′-d-903，HA基因3′端缺失的核苷酸数从882个连续增加到903个，真核表达载体所编码的HA缺失片段从819个核苷酸减少到798个核苷酸，这些真核表达载体都不能保护小鼠抗致死量流感病毒的攻击，实验组小鼠血清IgG抗体远低于全长HA实验组，体重变化与不免疫对照组相似(见表3、4)。
表3、4中1.病毒攻击后第3天采集小鼠心血，用ELISA方法测定IgG抗体(2n)，以每组小鼠的平均值±SD表示；2.体重变化为攻击后第七天的体重丢失与攻击前体重的百分比，以每组小鼠的平均值±SD表示；3.保护情况以攻击后第二十一天剩余的实验小鼠数与实验小鼠数进行对比表示。
“*”表示有显著差异(p＜0.05)(4)真核表达载体免疫后小鼠肺洗液中的病毒滴度能够保护小鼠抗致死量流感病毒攻击的真核表达载体，如真核表达载体HA-5′-d-6，实验组小鼠肺洗液的病毒滴度都要明显低于对照组，与全长HA组相当；不能保护小鼠抗致死量流感病毒攻击的真核表达载体，如真核表达载体HA-3′-d-882，实验组小鼠肺洗液的病毒滴度与不免疫对照组相当。
实验结果请见表51)病毒攻击后第3天采集小鼠心血，同时取器官肺，用2mlPBS(0.1％BSA)洗两次，用MDCK细胞来测肺洗液中病毒的TCID50；2)以每组小鼠的TCID50平均值±SD表示；3)“+”表示能够提供保护，“-”表示不能提供保护。
五.附表表1 A/PR/8/34流感病毒HA基因5′部分缺失片段真核表达载编码片段 F引物体编号HA-5′-d-3 nt4--nt1701 cctctcgagtgatggcaaacctactggtcctgHA-5′-d-6 nt7--nt1701 tcgctcgagaagatgaacctactggtcctgttaHA-5′-d-12 nt13--nt1701 atgctcgagaacatgctggtcctgttatgtgcHA-5′-d-15 nt16--nt1701 aagctcgagctaatggtcctgttatgtgcacHA-5′-d-24 nt25--nt1701 tacctcgagttatgtgtgcacttgcagctgcaHA-5′-d-42 nt43--nt1701 gcactcgaggctatggatgcagaccacaatatgHA-5′-d-51 nt52--nt1701 gctctcgaggcaatgacaatatgtataggctaccHA-5′-d-150nt151--nt1701gttctcgagctcatggacagccacaacggaaaacHA-5′-d-219nt220--nt1701gggctcgagaacatggccggatggctcttgggHA-5′-d-591nt592--nt1701tggctcgagcatatgccgtctaacagtaagg表2 A/PR/8/34流感病毒HA基因3′部分缺失片段真核表达载编码片段 R引物体编号HA-3′-d-69 nt1--nt1632tgccccgggggatcacaaaagcaccagtgaaHA-3′-d-111nt1--nt1590tgacccgggcgctcaaatctgatagatccccaHA-3′-d-141nt1--nt1560ttgcccgggatcacactccatctaccttttccHA-3′-d-231nt1--nt1470cttcccgggcatcaattgtcacacttgtggtaHA-3′-d-672nt1--nt1029tcccccgggacctcaggattgaatggacggaaHA-3′-d-729nt1--nt972 caacccgggacttcagacgtattttgggcacHA-3′-d-759nt1--nt942 ctccccgggtgttcatgggtgtatattctggaHA-3′-d-780nt1--nt921 tatcccggggaatcagagactgctgtttatagcHA-3′-d-795nt1--nt906 agacccgggtttcaagctcccaggggtgtttgaHA-3′-d-804nt1--nt897 gttcccgggtcctcagggtgtttgacacttcHA-3′-d-813nt1--nt888 ccacccgggttcaacacttcgtgttacactcaHA-3′-d-831nt1--nt870 cttcccgggacatcaatgcattgatgcgtttgaHA-3′-d-840nt1--nt861 acacccgggcattcatgcgtttgaggtgatgaHA-3′-d-855nt1--nt846 atgcccgggaggttcagatgccggacccaaaHA-3′-d-870nt1--nt831 atgcccgggcctcagcctctactcagtgcgaaaHA-3′-d-876nt1--nt825 acccccgggctcaactcagtgcgaaagcataHA-3′-d-882nt1--nt819 aagcccgggcttcatgcgaaagcataccttHA-3′-d-888nt1--nt813 actcccgggtcaagcataccttggtgctattaHA-3′-d-891nt1--nt810 ctccccgggaatcaataccttggtgctattaHA-3′-d-903nt1--nt798 catcccggggtcatattagatttccatttgcc
表3血清中IgG抗体、小鼠体重变化和保护情况5′缺失真核 IgG抗体(2n)1体重变化(％)2保护情况3表达载体Control ＜1 25.2±7.70/10HA 14.7±1.5 2.8±3.4*10/10*HA-5′-d-3 14.0±1.0 3.8±2.1*10/10*HA-5′-d-6 15.3±1.2 5.0±2.4*10/10*HA-5′-d-12 ＜1 20.3±5.50/10HA-5′-d-15 ＜1 22.8±7.10/9HA-5′-d-24 ＜1 22.4±4.80/10HA-5′-d-42 ＜1 19.5±6.80/10HA-5′-d-51 ＜1 18.2±7.00/10HA-5′-d-150＜1 24.7±5.50/10HA-5′-d-219＜1 25.6±4.31/9HA-5′-d-591＜1 20.3±3.90/10表4血清中IgG抗体、小鼠体重变化和保护情况3′缺失真核表IgG抗体(2n)1体重变化(％)2保护情况3达载体Control ＜1 25.2±7.70/10HA 14.7±1.5 2.8±3.4*10/10*HA-3′-d-69 15.2±1.8 8.2±4.2*10/10*HA-3′-d-111 14.3±1.9 7.5±2.6*9/10*HA-3′-d-141 13.8±1.5 6.5±3.5*10/10*HA-3′-d-231 14.0±1.0 6.9±4.2*8/10*HA-3′-d-672 12.0±0.8 5.0±3.9*10/10*HA-3′-d-729 14.8±2.2 7.5±3.6*10/10*HA-3′-d-759 12.2±1.5 10.5±5.8*8/10*HA-3′-d-780 14.6±1.3 6.4±4.0*10/10*HA-3′-d-795 15.2±1.9 10.3±7.0*9/9*HA-3′-d-804 13.5±2.2 8.4±6.2*10/10*HA-3′-d-813 14.7±1.6 5.2±5.1*10/10*HA-3′-d-831 13.0±1.0 8.3±7.1*9/9*HA-3′-d-840 12.0±1.0 9.5±6.6*10/10*HA-3′-d-855 13.3±2.5 6.5±4.4*10/10*HA-3′-d-870 13.7±2.6 9.0±6.1*10/10*HA-3′-d-876 14.0±1.6 10.4±4.3*10/10*HA-3′-d-882 5.8±1.826.4±4.70/10HA-3′-d-888 7.1±2.525.2±6.71/10HA-3′-d-891 7.5±1.824.8±4.20/10HA-3′-d-903 8.3±2.823.1±7.90/9
表5真核表达载体免疫后小鼠肺洗液中的病毒滴度5′和3′缺失真核表肺部病毒滴度保护情况3达载体(TCID50)1，2Control 5.2±0.7 -HA3.3±0.3 +HA-5′-d-33.0±0.2 +HA-5′-d-63.5±0.2 +HA-5′-d-12 5.6±0.3 -HA-5′-d-51 4.9±0.5 -HA-3′-d-111 3.0±0.4 +HA-3′-d-672 3.3±0.2 +HA-3′-d-813 3.5±0.4 +HA-3′-d-876 3.2±0.5 +HA-3′-d-882 4.9±0.6 -HA-3′-d-903 5.4±0.8 -
权利要求
1.一种预防流感病毒血凝素疫苗，其特征是预防流感病毒的截短的血凝素疫苗即预防流感病毒的截短的HA疫苗，该疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因，A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列如下ATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTAGAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAACTATGTAGATTAAAAGGAATAACCCCACTACAATTGGGGAATTGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAAGAACTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAAAGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACAAAGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGCGGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGCTGAAAAATTCTTATGTGAACAAGAAAGGGAAGGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCACCCGTCTAACAGTAAGGAACAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAATAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAAGGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTTCCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATTCCGTCCATTCAATCCAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGTGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAACTCTGTTATCGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTAGAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGTTCTACTGGAAAATGAAAGGACTCCGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGA上述A/PR/8/34流感病毒HA基因编码区全长1701核苷酸，编码一个大小为566个氨基酸的蛋白质产物，该基因中nt1～nt825片段是最短的保护序列。
2.根据权利要求1所述的预防流感病毒血凝素疫苗，其特征在于预防流感病毒的截短的血凝素疫苗是预防流感病毒的截短的血凝素核酸疫苗，即预防流感病毒的截短的HA DNA疫苗。
3.根据权利要求1所述的预防流感病毒血凝素疫苗，其特征在于预防流感病毒的截短的血凝素疫苗是预防流感病毒的截短的血凝素蛋白疫苗。
4.一种预防流感病毒的疫苗，其特征在于截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因代替全长A/PR/8/34流感病毒HA基因，制备预防流感病毒的截短的HA疫苗。
5.根据权利要求1或4所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于所述的截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因，由以下步骤获得(1)从10日龄鸡胚中增殖得到A/PR/8/34病毒，从中提取RNA，RNA经逆转录反应得到单链cDNA，(2)根据A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列，在其两个末端设计PCR引物，正向引物含有XhoI酶切位点，反向引物含有SmaI酶切位点，以cDNA为模板对目的基因进行PCR扩增，将PCR产物用XhoI酶与SmaI酶酶切，酶切片段克隆入真核表达载体pCAGGSP7中，获得重组真核表达载体pCAGGSP7/HA，(3)对pCAGGSP7/HA进行测序，确定是长度为1701个核苷酸的A/PR/8/34流感病毒HA基因，(4)用PCR的方法以pCAGGSP7/HA为模板，构建一系列真核表达载体，其中包含了从5’端或者3’端连续缺失的A/PR/8/34流感病毒HA基因，即得到截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因，(5)用QIAGEN纯化试剂盒纯化，用紫外分光光度法测定包含A/PR/8/34流感病毒HA基因或者截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因的真核表达载体的浓度和纯度，DNA的浓度和纯度通过OD260、OD280确定，选取OD260/OD280比值在1.8～2.0的真核表达载体，测序验证。
6.根据权利要求5所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于在扩增5’端缺失片段时，在目的片段5’端设置起始密码子ATG；在扩增3’端缺失片段时，在目的片段的3’端设置终止密码子TAG。
7.根据权利要求6所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于在扩增5’端缺失片段时，以起始密码子ATG为起点，从A/PR/8/34流感病毒HA基因的5′端缺失3～591个核苷酸共10个连续位点，1个缺失为3个核苷酸的倍数。
8.根据权利要求7所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于5’端的10个连续位点所对应的截短的片段是nt4～nt1701、nt7～nt1701、nt13～nt1701、nt16～nt1701、nt25～nt1701、nt43～nt1701、nt52～nt1701、nt151～nt1701、nt220～nt1701和nt592～nt1701。
9.根据权利要求6所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于在扩增3’端缺失片段时，以终止密码子TAG为起点，从A/PR/8/34流感病毒HA基因3’端缺失69～903个核苷酸共20个连续位点，1个缺失为3个核苷酸的倍数。
10.根据权利要求9所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于3’端的20个连续缺失位点所对应的截短的片段是nt1～nt1632、nt1～nt1590、nt1～nt1560、nt1～nt1470、nt1～nt1029、nt1～nt972、nt1～nt942、nt1～nt921、nt1～nt906、nt1～nt897、nt1～nt888、nt1～nt870、nt1～nt861、nt1～nt846、nt1～nt831、nt1～nt825、nt1～nt819、nt1～nt813、nt1～nt810和nt1～nt798。
全文摘要
本发明是预防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制备方法。本疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因。A/PR/8/34流感病毒HA基因编码区全长1701核苷酸，编码一个大小为566个氨基酸的蛋白质产物，该基因中nt1～nt825片段是最短的保护序列。用截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因代替全长A/PR/8/34流感病毒HA基因而制得本疫苗。本发明确定了A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列，并且确定了其中的最短的保护序列。本发明提供的疫苗能够诱导机体产生持久和全面的免疫应答，具有实用性强、使用安全等优点，从而为开发出预防流感病毒的截短的血凝素疫苗提供了一条有希望的途径。
文档编号A61K48/00GK1631439SQ20041006120
公开日2005年6月29日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者陈则 申请人:中国科学院武汉病毒研究所