A型流感病毒h1亚型检测方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种A型流感病毒H1亚型检测方法及其试剂盒。本发明的试剂盒包括第一包被膜和第二包被膜，所述第一包被膜的一端与所述第二包被膜的一端相连，所述第一包被膜中的至少一块区域包被有带荧光标记的第一抗体，所述第二包被膜包含分离的第一区域和第二区域，所述第一区域比所述第二区域靠近所述第一包被膜，所述第一区域包被有第二抗体，所述第二抗体和所述第一抗体能够特异性结合同一种抗原，所述第二区域包被有抗抗体，所述抗抗体能够特异性结合所述第一抗体。利用本发明的试剂盒和/或方法检测A型流感病毒H1亚型，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便，可实现客观化测定等优点。
【专利说明】A型流感病毒H1亚型检测方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒检测领域，特别地，本发明涉及A型流感病毒Hl亚型的检测方法 及其试剂盒，特别地，本发明涉及一种试剂盒、试剂盒在检测A型流感病毒Hl亚型中的用途 以及一种检测A型流感病毒Hl亚型的方法。
【背景技术】
[0002] A型流感病毒即甲型流感病毒为常见流感病毒，甲型流感病毒容易发生变异，其亚 型常被人们称为"禽流感"。禽流感是严重危害世界养禽业的毁灭性疫病，其病原容易突变， 具有多个血清型，给该病的防控带来困难，病毒基因变异后能够感染人类，感染后的症状主 要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导 致死亡。A型流感病毒Hl亚型是人类最常感染的流感病毒之一，自2009年3月墨西哥爆 发HlNl疫潮以来，已经造成全球范围内数万人死亡。
[0003] 目前常见的A型流感病毒Hl亚型的检测方法主要有：核酸检测和病毒分离鉴定。 核酸检测有RT-PCR检测和real-time RT-PCR检测方法，核酸检测依赖于样本模板RNA的质 与量，操作要求严格，需要大量仪器与设备及专业人员操作，检测时间较长，检测灵敏度高。 病毒分离鉴定常用于对阳性样品病毒的亚型鉴定，需要专门实验室才能进行。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商 业选择。
[0005] 为此，依据本发明的一方面，提供一种试剂盒，其包括第一包被膜和第二包被膜， 所述第一包被膜的一端与所述第二包被膜的一端相连，所述第一包被膜中的至少一块区域 包被有带荧光标记的第一抗体，所述第二包被膜包含分离的第一区域和第二区域，所述第 一区域比所述第二区域靠近所述第一包被膜，所述第一区域包被有第二抗体，所述第二抗 体和所述第一抗体能够特异性结合同一种抗原，所述第二区域包被有抗抗体，所述抗抗体 能够特异性结合所述第一抗体。对第一包被膜中的包被有荧光标记第一抗体的区域的大 小不作限制，可以是整个第一包被膜，也可以是第一包被膜的一部分，在本发明的一个实施 例中第一包被膜被称为样品垫。同样的，对第二包被膜中的分离的第一区域和第二区域各 自的大小也不作特别限制，在本发明的一个实施例中，如图1所示，试剂盒的第一包被膜和 第二包被膜都是长方形的，第一包被膜的一条宽边和第二包被膜的一条宽边相粘，第一包 被膜中的包被有荧光标记第一抗体的区域为长约2cm、宽约3mm的长方形，第二包被膜中的 第一区域和第二区域都为线状，第一区域被称为检测线（T线），第二区域被称为质控线（C 线），两个区域所在的线状平面都平行于两包被膜的粘结边，所说的线状第一或第二区域的 宽度大约为〇. 5-lmm、长为膜的宽。
[0006] 本发明的这一试剂盒利用第一膜和第二膜分别包被有能特异性结合同一种抗原 的荧光标记的第一抗体和第二抗体，加入待测样品后利用膜层析，在第二膜上形成双抗体 夹心复合物，基于检测复合物中的第一抗体上带的荧光标记的荧光强度来判断样品中是否 存在所说的抗原。本发明的这一试剂盒能够明显的提高检测的特异性，缩短检测所需时间。 通过荧光标记第一抗体，能够明显的提高检测灵敏度。
[0007] 根据本发明的一个实施例，本发明的这一方面的试剂盒中的第二包被膜的另一端 连接有吸水垫。吸水垫可为强吸水物质，这样在检测液态样品时能够给予定向作用力使液 态样品从第一包被膜定向层析至第二包被膜。
[0008] 根据本发明的一个实施例，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水垫固定 在同一固相基质上。固相基质主要为在使用本发明的这一试剂盒时有个承载，方便操作，固 相基质的类型不作特别限定，可以为不会与待测样品发生反应或者不影响抗原抗体结合的 惰性材料，比如纸板、塑料板等。
[0009] 根据本发明的一个实施例，所述第一包被膜为玻璃纤维素膜，所述第二包被膜为 硝酸纤维素膜（NC膜）。玻璃纤维膜呈化学惰性，不含粘合剂，采用100%硼硅酸玻璃纤维制 造而成，其上包被有荧光标记的第一抗体，利于第一抗体与待测样品中的目标抗原发生特 异性结合。而NC膜本身是已经添加了表面活性剂来改善亲水能力，而且已经存在有一定的 缓冲系统，具有毛细纤维结构，能吸附比同等纤维素滤纸更多的水分，流速快，耐高温，利于 其上包被的第二抗体与前述的荧光标记第一抗体-抗原发生特异性结合反应，激发荧光。
[0010] 根据本发明的一个实施例，所述突光标记为突光微球标记，所述第一抗体与所述 荧光微球标记通过肽键共价结合。这样，提高标记物的稳定性，避免了抗体空间位阻的影 响，有利于提高灵敏度和特异性。在本发明的一个实施例中，所述荧光微球直径在纳米级范 围内，其直径范围为10-500nm，较佳地为20-300nm，其上负载有荧光物质，是受外界能量刺 激能激发出荧光的固体微粒。所述荧光微球负载的荧光物质为掺杂荧光染料、稀土络合物、 量子点等的转换荧光纳米材料。所述荧光微球负载的荧光物质通过高分子聚合物修饰有活 性官能基团，所述活性官能基团为羧基，氨基，羟基，巯基。在本发明的一个实施例中，所述 活性官能基团具体为羧基，所述荧光微球标记第一抗体为为将待标记的第一抗体和羧基修 饰的荧光微球以肽键共价结合形成的聚合体。
[0011] 根据本发明的一个实施例，所述第一抗体为A型流感病毒Hl亚型抗体，所述第二 抗体为不同于所述第一抗体的A型流感病毒Hl亚型抗体。这两种抗体都可以特异性结合 抗原A型流感病毒Hl亚型，而且较佳地，两种抗体能与抗原的不同表面决定簇特异性结合， 这样利于抗原检测的准确进行。在本发明的一个实施例中，所述第一抗体和/或第二抗体 为A型流感病毒Hl亚型单克隆抗体和A型流感病毒Hl亚型多克隆抗体中的任一种。本发 明的这一试剂盒是基于对荧光标记、抗原和抗体特性的研究，通过选择适合的荧光标记与 特异性的抗体进行定向共价化学偶联，获得荧光标记抗体分析，并通过优化双抗体夹心免 疫反应的各种条件，制备得到上述检测A型流感病毒Hl亚型的试剂盒。
[0012]根据本发明的一个实施例，所述抗抗体为羊抗鼠 IgG抗体，其能够与第一抗体特 异性结合，即与多余的带荧光标记第一抗体结合形成免疫复合物，激发荧光，得以能够定性 和/或定量检测该免疫复合物。
[0013] 依据本发明的另一方面，提供上述本发明一方面的和各种实施例中的任一试剂盒 在检测A型流感病毒Hl亚型中的用途。前面针对试剂盒所描述的优点和技术特征，仍适用 于该试剂盒的用途，在此不再赘述。
[0014] 依据本发明的又一方面，提供一种检测A型流感病毒Hl亚型的方法，所述方法包 括步骤：将待测样本加到上述任一试剂盒中的第一包被膜中的包被有带荧光标记的第一抗 体的区域；检测所述试剂盒中的第一区域和第二区域的荧光强度，获得第一区域荧光强度 和第二区域荧光强度；基于比值大于预定阈值，判定所述待测样本中存在A型流感病毒Hl 亚型，其中，比值=第一区域荧光强度/第二区域荧光强度。第一包被膜中的包被有带荧光 标记的第一抗体的区域为与待测样本中的目标抗原（若有的话）结合的区域，在本发明的 一个实施例中，将该区域称为加样端。在本发明的一个实施例中，所述预定阈值为〇. 0075， 该值是通过参考利用已知的双抗体夹心免疫反应的条件或市售试剂盒产品，大量测定正常 样本和添加阳性样本的正常样本来确定的，是个二者测定值的比值的均值，利用该均值作 为临界值（cutoff)，可以准确判断检测样本是阳性或阴性的。在本发明的一个实施例中，通 过手持仪器检测荧光强度，获得第一区域荧光强度和第二区域荧光强度的比值，将比值与 所述的临界值相比较，能够客观得到检测结果，而且该检测结果与市售检测A型流感病毒 Hl亚型的荧光PCR试剂盒的检测结果一致。利用本发明的这一检测方法，利用本发明的上 述试剂盒，能够实现对A型流感病毒Hl亚型的快速和高灵敏测定，本发明的方法具有灵敏 度高、特异性强、快速、简便，可实现客观化测定的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将 变得明显和容易理解，其中：
[0016] 图1是本发明的一个实施例中的试剂盒结构示意图；
[0017] 图2是本发明的一个实施例中的检测A型流感病毒Hl亚型的试剂盒的结构示意 图；
[0018] 图3是本发明的一个实施例中的检测A型流感病毒Hl亚型的检测值与浓度标准 曲线图。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。另外，本发明中的术语"包被"为免疫学术语，包含固定 和/或吸附之意。
[0020] 以下将第一抗体称为A型流感病毒Hl亚型标记抗体，将荧光标记的第一抗体称为 A型流感病毒Hl亚型抗体混合物，将第二抗体称为A型流感病毒Hl亚型包被抗体，将第一 区域称为测试区或T线，将第二区域称为质控区或C线，将第一包被膜称为样品垫，将第二 包被膜称为包被膜。
[0021] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从常规市售途径得到。
[0022] 下述实施例中所用的突光微球是购自Bangs Laboratories, Inc.公司，产品目 录号为FC02F/10930固含量为10mg/ml，为羧基修饰的荧光微球，该荧光微球平均直径为 IlOnm0
[0023] 下述实施例中所用的待标记A型流感病毒Hl亚型抗体是购自昆明云大单抗中心 的编号为F1-34抗A型流感病毒Hl亚型的单克隆抗体。
[0024] 下述实施例中的A型流感病毒Hl亚型包被抗体是购自云大单抗中心的编号为 F1-37抗A型流感病毒Hl亚型的单克隆抗体。
[0025] 下述实施例中用于制作样品垫的玻璃纤维膜购自Millipore公司、商品目录号为 GF-CP20300。
[0026] 下述实施例中用于制作吸水垫的吸水纸购自Millipore公司、商品目录号为 CF-SP22300。
[0027] 下述实施例中用于制作包被膜的硝酸纤维素膜购自Millipore公司、商品目录号 为 Hi-Flow PlusHF135。
[0028] 下述实施例中的pH为7. 4的0. 02M PBS缓冲液按照如下方法配制：称取2. 3g Na2HP04、0. 524gNaH2P04. H20、8. 77g NaCl 溶于纯水，用纯水定容至 1L，调 pH 至 7. 4,得到 pH 为7. 4的0. 02M PBS缓冲液。
[0029] 下述实施例中的膜处理缓冲液按照如下方法配制：将Tween-20、BSA、蔗糖溶于上 述pH为7. 4的0. 02M PBS缓冲液使Tween-20的质量百分含量为0. 2 %、BSA的质量百分含 量为1 %、蔗糖的质量百分含量为2%，调pH至7. 4,得到膜处理缓冲液。
[0030] 下述实施例中的50mM pH为8. 5的硼砂缓冲液按照如下方法配制：称取I. 9g Na2B407. IOH2O溶于IOOml纯水，调pH至8. 5得到50mM pH为8. 5的硼砂缓冲液。
[0031] 下述实施例中的样品处理液按照如下方法配制：将Tween-20溶于上述pH为7. 4 的0. 02M PBS缓冲液使Tween-20的质量百分含量为0. 2%，调pH至7. 4,得到样品处理液。
[0032] 检测A型流感病毒Hl亚型试剂盒的一般制备方法包括以下步骤：
[0033] ( 一）羧基修饰的突光微球标记探针的制备
[0034] 采用适合的羧基修饰的荧光微球，活化其表面的羧基后，采用共价偶联的方式分 别将A型流感病毒Hl亚型标记抗体定向连接到该羧基修饰的荧光微球表面。
[0035] (二）测试区T线和C线处抗体的包被
[0036] 采用喷膜仪器，于包被膜测试区的T线处喷涂A型流感病毒Hl亚型包被抗体，于 C线处喷涂羊抗鼠 IgG抗体。
[0037](三）样品垫处标记探针的包被
[0038] 采用喷涂仪器，于样品垫特定位置处喷涂荧光微球标记的A型流感病毒Hl亚型抗 体混合物，该特定位置为样品垫上的一块区域，该区域即作为后续的"加样端"。
[0039](四）试剂盒的组装成型
[0040] 按照试剂盒的结构图示意图图2,于塑料支撑背板中间粘贴作为测试区的包被膜， 于包被膜的T线端粘贴样品垫，C线端粘贴吸水垫。采用试纸分切机，将其分切为一定宽带 的纸条，比如4mm宽，并装入夹片，用装有干燥剂的铝箔袋进行包装。
[0041] (五）抗原-抗体荧光免疫复合物的形成
[0042] 于上述组装成型的加样端处加入待测样品，样品中的A型流感病毒Hl亚型与荧光 微球标记的A型流感病毒Hl亚型标记抗体结合后层析到T线处喷涂的A型流感病毒Hl亚 型包被抗体，在T线处形成包被抗体-抗原-荧光微球标记抗体免疫复合物，多余的荧光微 球标记A型流感病毒Hl亚型抗体则在C线处与羊抗鼠 IgG形成的荧光标记免疫复合物。 [0043](六）荧光标记免疫复合物荧光强度检测
[0044] 用荧光检测仪测定T线处和C线处荧光强度，通过与设定的阈值比对而确定其阳 性或阴性结果，C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。
[0045] 所述的荧光标记免疫复合物的荧光强度，是指在T线、C线处分别滞留下的结合 荧光微球的数量用荧光检测仪测定后所得到的数值。通过双抗体夹心免疫反应的条件，经 大量测定正常样本和添加阳性样本可确定出各不同正常样本的测定均值，以此作为临界值 (cutoff)来确定检测样本的阳性或阴性结果。C线测定结果则作为该测定方法的质控内 标。
[0046] 下面详细描述本发明的实施例。下面实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不 能理解为对本发明的限制。需要说明的是，在本文中所使用的术语"第一"、"第二"等仅用于 方便描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性，也不能理解为之间有先后顺序关系。 在本发明的描述中，除非另有说明，"多个"的含义是两个或两个以上。
[0047] 实施例1检测A型流感病毒Hl亚型试剂盒的制备
[0048] (一）荧光微球标记A型流感病毒Hl亚型标记抗体的制备
[0049] 以平均直径为llOnm、羧基修饰的突光微球（购自Bangs Laboratories, Inc?公 司，产品目录号为FC02F/10930)，抗A型流感病毒Hl亚型的单克隆抗体（购自昆明云大单 抗中心，编号为F1-34)，按照下述方法制备荧光微球标记A型流感病毒Hl亚型标记抗体：
[0050] 取5mg的上述羧基修饰的荧光微球用MES缓冲液（0. lM、pH4. 7)洗涤并离心后，用 Iml MES缓冲液（0? 1M、pH4. 7)重悬，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC) 至终浓度为5mM、加入NHS (N-羟基丁二酰亚胺）至终浓度为10mM，室温避光，反应半小时得 到活化后羧基修饰的荧光微球。
[0051] 用50mM pH8. 5的硼砂缓冲液洗涤该活化后羧基修饰的荧光微球，分别取0. 37mg 上述待标记A型流感病毒Hl亚型抗体和5mg上述活化后羧基修饰的荧光微球混合到50mM PH8. 5的硼砂缓冲液中充分混匀。室温避光下反应2小时，让抗体和荧光微球形成稳定的肽 键共价结合得到荧光微球与A型流感病毒Hl亚型抗体的偶联物。反应结束后，加入终浓度 为1 % (质量百分含量）的BSA溶液对荧光微球与A型流感病毒Hl亚型抗体的偶联物上剩 余活性羧基位点进行封闭，室温避光反应〇. 5小时。完成后，用pH7. 4的0. 02M PBS缓冲液 洗涤、重悬得到5mg/ml荧光微球标记A型流感病毒Hl亚型抗体液体，4°C保存待用。
[0052] (二）检测A型流感病毒Hl亚型试剂盒的制备
[0053] 以A型流感病毒Hl亚型包被抗体，以羊抗鼠 IgG抗体制备包被膜，具体方法如下：
[0054] 采用pH7. 4的0. 02M PBS缓冲液，将羊抗鼠 IgG抗体（长沙博优生物科技有限公 司，ABGAM-0500)配制为浓度lmg/ml溶液，将A型流感病毒Hl亚型包被抗体（购自昆明云 大单抗中心，编号为F1-37)的浓度分别配制为浓度2mg/ml溶液，选用BioDot的XYZ3050 喷膜系统将羊抗鼠 IgG抗体喷至包被膜（硝酸纤维素膜）的质控线（C线）位置，将A型流 感病毒Hl亚型包被抗体喷至检测线（T线）位置，于相对湿度为10%以下的干燥车间进行 抽湿4小时后干燥待用，得到具有检测线和质控线的包被膜。
[0055] 用上述膜处理缓冲液浸泡玻璃纤维纸半小时，浸泡的温度为37°C，于同样的抽湿 条件进行抽湿4小时后，用上述膜处理缓冲液稀释步骤（一）所得荧光微球标记A型流感病 毒Hl亚型抗体液体至荧光微球标记A型流感病毒Hl亚型抗体含量为0. 05mg/ml混合液后， 采用BioDot的XYZ3050喷膜系统将其喷涂至上述处理过的玻璃纤维素膜上制备形成样品 垫，于同样的抽湿条件进行干燥。在10万级洁净和干燥的车间中把上述干燥好的具有检测 线和质控线的包被膜、上述样品垫、吸水垫、背板按图2所示进行搭配组装后，采用BioDot 的CM4000裁切系统将贴好的纸板裁切为4mm/条的宽度，装入检测用夹片待用。
[0056] 实施例2、检测A型流感病毒Hl亚型试剂盒的评估 [0057](一）检测灵敏度
[0058] 以A型流感病毒Hl亚型HI试验抗原作为待测样品来测定实施例1的检测A型流 感病毒Hl亚型试剂盒的灵敏度。
[0059] 同时将A型流感病毒Hl亚型HI试验抗原用pH为7. 4的0. 02M PBS缓冲液分别 和混合配制成系列浓度（64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 063、0HA unit)，分别加入 由实施例1得到的检测A型流感病毒Hl亚型试剂盒的加样端中，并采用荧光检测仪检测。 检测步骤：检测前先将待检测样品恢复室温（25°C )，用精确移液器取待检测样品60 iU垂 直缓慢滴入上述得到的检测A型流感病毒Hl亚型试剂盒的加样端中，10分钟后用荧光检测 仪进行测试。
[0060] 其检测结果如下表1所示。从检测结果中可以得出上述试剂盒检测A型流感病毒 Hl亚型的灵敏度为0. 125HA unit，T/C Cut-Off值大于0. 0075为阳性。
[0061] A型流感病毒Hl亚型试剂盒检测值与浓度曲线图如图3所示。
[0062] 表I A型流感病毒Hl亚型不同样品浓度的试剂盒检测值
[0063]
【权利要求】
1. 一种试剂盒，其包括第一包被膜和第二包被膜，所述第一包被膜的一端与所述第二 包被膜的一端相连， 所述第一包被膜中的至少一块区域包被有带荧光标记的第一抗体， 所述第二包被膜包含分离的第一区域和第二区域，所述第一区域比所述第二区域靠近 所述第一包被膜， 所述第一区域包被有第二抗体，所述第二抗体和所述第一抗体能够特异性结合同一种 抗原， 所述第二区域包被有抗抗体，所述抗抗体能够特异性结合所述第一抗体。
2. 权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述第二包被膜的另一端连接有吸水垫。
3. 权利要求2的试剂盒，其特征在于，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水垫 固定在同一固相基质上。
4. 权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述第一包被膜为玻璃纤维素膜，所述第二包被 膜为硝酸纤维素膜。
5. 权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为荧光微球标记。
6. 权利要求5的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体与所述荧光微球标记通过肽键共 价结合。
7. 权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为A型流感病毒H1亚型抗体，所述 第二抗体为不同于所述第一抗体的A型流感病毒H1亚型抗体。
8. 权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。
9. 权利要求1-8任一试剂盒在检测A型流感病毒H1亚型中的用途。
10. -种检测A型流感病毒H1亚型的方法，其特征在于，包括， 将待测样本加到权利要求1-8任一试剂盒中的第一包被膜中的包被有带荧光标记的 第一抗体的区域； 检测所述试剂盒中的第一区域和第二区域的荧光强度，获得第一区域荧光强度和第二 区域荧光强度； 基于比值大于预定阈值，判定所述待测样本中存在A型流感病毒H1亚型，其中，比值= 第一区域荧光强度/第二区域荧光强度； 任选地，所述预定阈值为0. 0075。
【文档编号】G01N33/569GK104407134SQ201410612019
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】马岚, 吴峰, 秦智锋, 卢体康 申请人:清华大学深圳研究生院