传染性流感病毒的生产的制作方法
【专利说明】传染性流感病毒的生产 发明领域
[0001] 本发明设及用于生产流感传染性病毒的方法，其中用通过使用合适的表达载体集 转染细胞生成的传染性流感病毒种子感染CK)细胞。本发明还设及重组盒，W及包含所述 重组盒的载体，其可用于生产感染性病毒的方法，特别是根据本发明的方法。
[000引发明背景
[0003] 流感病毒是高度传染的呼吸道疾病，通常称为"流感"，的病原体，其可影响动物 和人从而引发健康和经济问题。流感病毒是具有由单链阴性RNA片段组成的分割的基 因组的包膜RNA病毒。流感病毒涵盖=种类型：流感A、流感B和流感C病毒。流感A和 B病毒导致人流感流行病，其每年导致超过50000人死亡（Rossmanetal,2011,Virolo gy，411(2):229-236)。虽然流感A病毒感染人还有多种动物（鸟类、猪、马、狗、猫等），且最 大的天然储存体是野生水鸟，流感B病毒主要限于人，其部分是由于B/NS1蛋白质不能抵消 其他品种的先天免疫应答（Sri化aranetal, 2010,JBiolChem, 285 (11): 7852-7856)，而 流感C病毒分离自人和猪。
[0004] A型病毒具有球形或丝形且具有约80至150nm的大小。由脂双层组成的病毒包膜 来自宿主细胞的脂质膜。作为宿主抗体的主要祀，表面糖蛋白HA(血凝素）和NA(神经氨 酸酶）形成的针插入该包膜中。同样包埋于所述膜中的M2蛋白质是主要在病毒的脱壳作 用中发挥功能的离子通道。基质蛋白Ml位于病毒内缘与脂双层和核糖核蛋白（RN巧相关 联。其在RNPs的核质运出过程中具有重要作用。在衣壳中，vRNA片段加工非编码5'和3' 末端，其包含用于病毒基因组转录、复制和壳体化所必需的信号。称为PA(聚合酶酸性）、 PB1 (聚合酶碱性蛋白1)、PB2(聚合酶碱性蛋白2)、NP(核蛋白）、HA、NA、M和NS(非结构 蛋白）的流感A病毒的八种vRNA通过选择性剪接编码一种或多种蛋白质。所述PA片段编 码PA蛋白；所述PB1片段编码PBUPB1-F2和PB1-N40蛋白；所述NP片段编码NP蛋白；所 述HA片段编码HA蛋白；所述NA片段编码NA蛋白；所述M片段编码Ml和M2蛋白；所述NS 片段编码非结构蛋白NS1和NS2或肥P(vRNPs的核输出）。vRNAs盘绕在NP上，NP的每个 单体与24个核巧酸结合，所述聚合酶复合体与RNA分子的两端结合，形成发夹结构。该复 合体由PB1、PB2和PA组成。所述RNA、NP和聚合酶的组合形成核糖核蛋白（RNP)复合体。 [000引 B型病毒具有除NAW外的称为NB的糖蛋白，其如蛋白质M2具有m型结构。
[0006] C型病毒仅有一个多功能表面糖蛋白，"血凝素-醋酶-融合蛋白"她巧。
[0007] 因此，A和B型病毒的基因组包含8种病毒RNA(vRNA)而流感病毒C型的基因组 仅包含7种。
[000引流感A病毒根据病毒表面糖蛋白的性质也被分成不同亚型，即，目前的血凝素 (HA)化1至化7)和神经氨酸巧酶（NA) (N1至N9)。
[0009] 由Burnet在1936年发现的流感病毒能在母鸡含胚卵中生长，该发现 使得流感特性得W研究且允许了失活疫苗的发展值e化aetal，1995,JClin Microbiol, 33 (7): 1948-1949)。如世界卫生组织（WHO)描述，接种疫苗是预防感染最为 有效的方式。幸运的是，已获得安全和有效的疫苗超过70年。季节性流感疫苗包含不同 的流感类型和亚型（A/HINI、A/H3N2和B)，由于抗原修饰其每年更新两次（一次针对南 半球且一次针对北半球）。由于该个原因，WHO协调全球流感监视网络佑ISN)监测流感 病毒的流行病学。一旦包括于下一季的病毒疫苗被确定，候选的高度生长种子病毒株必 须通过WHO合作中屯、如纽约医学院（NYMC，US)、生物标准和控制国立研究院（NIBSC，UK)、 C化小组（Australia)和传染病国立研究院（NIID,Japon)制备（Gerdiletal, 2003 ，Vaccine, 21 (16) : 1776-1779)。疫苗株随后在卵、MDCK或Vero细胞系上由制造商扩增 化oudstaaletal, 2009,Vaccine, 27 (19): 2588-2593)。目前，MDCK(Treeetal, 2001,Vac cine, 19(25-26) :：M44-3450)、Vero(Kistneretal, 1998,Vaccine, 16(9-10) : 960-968)和 PE民.C6?|(Pauetal，2001，Vaccine, 19(17-19) :2716-2721)是全部的S种可能满足监 管需求且已表明成功确保流感A和B病毒得W复制的细胞系。全部的=种细胞系已适应于 在无血清培养基中生长（Coussensetal, 2011，Vaccine, 29(47) :8661-8668)。
[0010] 将流感病毒引入细胞通过流感血凝素（HA)表面蛋白和特定的细胞表面受体之 间的特异性相互作用发生。特异性针对流感病毒的宿主细胞膜受体由唾液酷乳糖胺链的 糖结构生成（唾液酸[Sia]a2-3/6半乳糖[Gal]M-4/3N-己酷氨基葡萄糖）（Suz址i etal，2011，AdvExpMedBiol，705:443-452)。人流感病毒优先与包含Sia2-6Gal连接 的细胞受体结合，其中禽病毒优先与Sia2-3Gal受体结合（Coussensetal,2011,Vacc ine，29(47) :8661-8668)。当两种病毒感染相同细胞时，称为重排的基因组vRNAs的不同 组合可能发生。该特性已被用于流感A疫苗的生产来组合祀循环病毒的HA和神经氨酸 酶（NA)蛋白的抗原特性与对卵适应性病毒有利的生长特性（内部基因），称为A/Puerto Rico/8/34(PR8)(HlNl)。不幸的是，理想的高产量病毒获取的成功难W预测。此外，如果 分离自未经验证的细胞系，一些病毒株不能被监管机构接受作为祖疫苗株，因此不能使用 该些病毒株（Nicolsonetal, 2005,Vaccine, 23(22):2943-2952)。关于流感类型B病 毒，直至最近，并没有识别具有A/PR/8/34化1N1)生长特性的B病毒。因此，可将流行循 环（或季节性）的B病毒直接用于感染母鸡含胚卵并需要数代来改进B疫苗株的产量 (Iwatsuki-Horimotoetal, 2008,VirusRes, 135(1):161-165)。
[0011] 自1999年，由于使得传染性流感病毒的生成完全来自克隆的病毒cDNA的基 于质粒的反向遗传技术，在速度和安全性方面实现了显著改进（Fodoretal，1999,J Virol, 73 (11) :9679-9682)。基于能够诱导八种vRNAs和至少转录所需的聚合酶蛋白质复 合体和核蛋白（N巧表达的质粒集，建立了不同的系统。所述聚合酶蛋白质复合体和NP也 可分别通过四种额外质粒的转染或通过使用能使得vRNA和mRNA通过RNA聚合酶I(P化 1)和II(P化2)合成的具有双向启动子的质粒来进行表达（Jacksonetal，2011，JGen Virol,92(Ptl):l-17)。转染的质粒总数可从 16(Neumanetal, 1999,Proc化1:1Acad SciUSA, 96(16):9345-9350)，或 12(Fodoretal, 1999,JVirol, 73(11):9679-9682)变 化至 8(Hoffmannetal, 2002,Vaccine, 20 (25-26) : 3165-3170)，取决于所述策略是单向 或双向，且如果质粒编码多个vRNA，则可从3(Neumannetal, 2005,Proc化1:1AcadSci USA, 102 (46):16825-16829)至 1狂hangetal, 2009,JVirol, 83(18):9296-9303)。
[001引 目前的反向遗传系统基于使用PE民.C6⑥化oudstaaletal, 2009,Vacc ine, 27(19) : 2588-2593)、CEP(ChickenEmbiroPrimary)细胞或鸡胚胎成纤维细 胞（CE巧狂hangetal, 2009,JVirol, 83(18) :9296-9303)、293T细胞自身（Neuman et al，1999，Proc化tl Acad Sci USA，96(16):9345-9350)或伴随进一步在MDCK上的扩增化offmann et al, 2002, Vaccine, 20口5-26): 3165-3170 ;ScMckli et al, 2001, Philos Trans R Soc Lond Biol Sci, 356 (1416): 1965-1973)'Vero细胞自 身（Nicolson et al, 2005, Vaccine, 23(22):2943-2952 ;Neumann et al,2005,Proc 化tl Acad Sci USA，102(46):16825-16829)或伴随进一步的在Madin-Darby Bovine Ki化巧(MDBK)上的扩增（Fodor et al, 1999, J Virol, 73 (11):9679-9682)、CEP细胞或 CEF(Legastelois et al, 2007, Influenza Other Respi Viruses, 1(3):95-104 ;Whitel巧 et al, 2007, Influenza Other Respi Viruses, 1(4):157-166)。
[0013] 当使用细胞系的混合物通过反向遗传方法来生产病毒时，将能被最有效转染的细 胞系认为是负责传染性流感病毒生成的细胞系，同时其他细胞系对传染性病毒的增殖做出 贡献。由于通常在允许流感vRNAs产生的质粒中使用人RNAP化I启动子，人和类人猿细 胞是在反向遗传系统中用作转染细胞系的最合适的细胞系。然而来自犬或鸡源的POLI启 动子也可分别用于犬科或鸟类