专利名称：有缺陷的流感病毒颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及流感病毒和针对流感的疫苗接种的领域。
流感病毒(正粘病毒科)是有包膜的具有分段的基因组的负链RNA病毒(Taubenberger和Layne，Molecular Diagnosis Vol.6 No.4 2001)。根据它们的核蛋白和基质蛋白之间的显著的抗原差异，可以将它们分成2类一类包含流感A和B，另一类包含流感C。这3个病毒类型也存在致病性和基因组组织的差异。发现类型A广泛存在于恒温动物中，但是类型B和C主要是人病原体。通过从病毒粒子表面伸出的血细胞凝集素(HA)和NA表面糖蛋白的抗原特征，进一步细分流感A病毒。目前，有15种HA和9种NA亚型。流感A病毒能感染广泛种类的动物，包括鸟、猪、马、人和其它哺乳动物。水鸟是所有已知亚型的流感A的自然宿主，且可能是人流行流感株的遗传物质源。
不同于相关的副粘病毒，流感病毒具有分段的RNA基因组。流感A和B病毒具有类似的结构，而流感C是更离散的。A和B类病毒都含有8个离散的分别编码至少一种蛋白的基因片段，C类型含有7个离散的片段，它组合了A和B类型的片段4和6。流感A和B病毒覆盖着3种蛋白的突出部分HA，NA，和基质2(M2)。流感C病毒仅仅具有一种表面糖蛋白。每种流感RNA片段由核蛋白(NP)包裹成壳，形成核糖核苷酸核蛋白(RNP)复合物。这3种聚合酶蛋白与RNP复合物的一端相连。RNP被膜围绕，所述的膜含有作为组成部分的基质蛋白(基质1)。包膜的磷脂部分源自宿主细胞膜。在病毒颗粒内，还发现了非结构性蛋白2(NS2)。
世界卫生组织(WHO)关于流感病毒命名法的规则如下。首先，指定病毒的类型(A，B，或C)，然后为宿主(如果非人)，分离地，分离数目，和分离的年(以斜线分隔)。对于流感A，在括号中注明了HA和NA亚型。例如，包含在近期的2000至2001季的三价疫苗中的株是A/巴拿马/2007/99(H3N2)，A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)，和B/Yamanashi/16/98。自1977年以来，已经有2种流感A亚型共存于人类H1N1和H3N2。
流感病毒能积累复制过程中的点突变，因为它们的RNA聚合酶复合物不具有校对活性。能改变表面糖蛋白的抗原部分中的氨基酸的突变能通过逃避预先存在的免疫而为病毒株提供选择优势。通过结合某些宿主细胞上的受体，HA分子能启动感染。针对HA蛋白的抗体可以阻止受体结合，能非常有效地预防相同株的再次感染。通过抗原性漂移(其中目前循环的HA基因的突变会破坏抗体结合)或抗原性转变(其中病毒获得新亚型的HA)，HA可以逃避以前获得的免疫。抗原性漂移压力在HA分子中是不均等的，阳性选择变化主要发生在HA蛋白的球形头上。这些变化在HA中的积累程度也大于在NA中的。在其它流感蛋白中更慢产生变化。同样地，抗原性漂移压力在人-适应的流感株中最大，在猪-和马-适应的株中中等，在鸟-适应的株中最小。
因为流感病毒具有分段的基因组，2种不同株在同一宿主中的共感染可以导致生成新的重新组合的流感株，其含有亲本基因片段的不同组合。已知15种HA亚型存在于野鸟中，并提供了HA的来源，所述HA对于人类而言是新的。含有新的亚型(通过抗原性转变)的流感株在人循环中的出现，已经成为1957和1968年的最近2次流感大流行的原因，且极有可能是1918年流感大流行的原因。为了与已知的关于流行性流感病毒的出现相一致，流行株必须具有在抗原性上不同于目前流行的HA；该HA不得已经在人类中循环了60至70年；且该病毒必须是可以在人间传播的。在1957和1968年，HA的转变导致了大流行，且在2种情况下，流行株的HA与鸟毒株密切相关。尽管大流行的一个绝对条件是HA必须变化，尚不清楚病毒的其它部分可以或必须变化的程度。仅仅可以得到1957和1968年的流行性病毒用于直接研究，使用分子考古学，表征了1918年的流行性流感病毒。在1957年，3个基因被替换为鸟类基因HA，NA，和聚合酶复合物的亚基(PB1)。在1968年，仅仅替换了HA和PB1。
通过病毒分离、血凝抑制(HI)实验、免疫测定法检测抗原、血清学实验、验证分泌物中的NA活性或基于分子的实验，可以特异性地诊断流感感染。可以将试样收集为唾液、鼻咽拭子或通过口漱缓冲盐水溶液得到的鼻咽洗液。流感诊断的标准是培养后进行免疫学表征。血清学分析能提供精确的、但是可追溯的流感感染方法，因为它需要收集急性期和渐愈期的血清。
流感病毒可以在含胚的鸡蛋或许多组织培养系统中生长。加入胰蛋白酶(用于HA的切割活化)，会使流感病毒在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞和其它系中繁殖。疫苗生产的主要方法仍然是在蛋中培养流感病毒。细胞系的培养物通常用于人流感病毒(类型A和B)的初步分离。可以直接在含胚的蛋的尿囊腔中培养许多人流感病毒。有些流感A和B病毒需要首先在羊膜腔中培养，然后转移到尿囊腔中。培养物分离后，使用免疫测定法或免疫荧光法，确定地鉴别出了大多数流感分离物。流感病毒的HA分子能结合呼吸细胞表面上的唾液酸残基，以利于病毒的进入。
利用流感病毒体外使红细胞凝集的能力，可以在抗原方面表征流感株。抗-HA抗体可以抑制凝集。因而，血凝反应抑制(HI)实验是用于表征流感株的标准方法之一。HI实验可以用于确定样品株是否在免疫学上与近来的疫苗株相关(即交叉反应性的)。以一系列的2倍稀释，向孔中加入分型血清，后者一般在雪貂中生产，实验人员通过观察悬浮的和凝集的红细胞，对实验孔打分。在大多数情况下，一组血清用于匹配针对疫苗的样品株和参照株，且在任何给定的流感季的过程中，通过HI实验成功地匹配了大多数样品株。
关于鉴别各病毒株的抗原特征，WHO提供了准则，WHO协作中心提供了指南。根据免疫学系谱，例如A/莫斯科/10/99(H3N2)-样，A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)-样，和B/北京/184/93-样病毒，对样品株进行分类。对于不能在HI实验中进行表征的样品株，实验室工作人员必须将它们接种进雪貂中，以生成株特异性的抗血清。当新的抗血清准备好后，再如所述进行HI实验。如果新血清在交叉反应性中表现出显著差异(通常定义为样品和疫苗株之间的4倍差异)，则将它整合进常规实验室组中，并用于寻找新的流行性株。因而，HI实验在疫苗株选择的流感病毒监视工作中非常重要，且是最常用的估计抗原性漂移的方法。
通过各基因片段的序列对比，可以遗传地表征流感株，WHO准则和WHO协作中心又提供了关于识别包含下述片段的个体性质的指南包含流感基因组的RNA片段；能编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感A和B病毒核酸片段，和能编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、血细胞凝集素-神经氨酸酶样糖蛋白(HN)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感C病毒核酸片段。关于抗原分析、核酸序列对比和鉴别疫苗病毒的参照株的请求，可以致送WHO流感参考和研究协作中心，45 Poplar Road，Parkville，Victoria 3052，Australia(fax+61 3 9389 1881，web sitehttp//www.influenzacentre.org)；WHO流感参考和研究协作中心，National Institute of Infectious Diseases，Gakuen 4-7-1，Musashi-Murayama，Tokyo 208-0011，Japan(fax+81 42 5610812或+81 42 5652498)；WHO流感监视、流行病学和控制协作中心，Centersfor Disease Control and Prevention，1600 Clifton Road，Mail stop G16，Atlanta，GA 30333，United States of America(fax+1 404 639 23 34)；或WHO流感参考和研究协作中心，National Institute for MedicalResearch，The Ridgeway，Mill Hill，London NW7 1AA，England(fax+44 208 906 4477)。在WHO的网站http://www.who.int/influenza上，可以得到最新的流行病学信息，在http://www.who.int/flunet上，可以得到地理信息系统，FluNet。
人们对于流感的影响和预防它的健康和经济益处的认识正在逐步提高，过去十多年已经观察到了疫苗接种的应用和益处，且显著地出现了许多抗流感药物。作为在许多国家更长的寿命预期的结果，更多的人处于并发症的危险中，在流感流行病过程中的保健系统的负担被更广泛地承认，更频繁的国际旅行已经为病毒的传播创造了机会，尽管新产品的出现已经增加了预防和治疗疾病的选择。约50个国家具有政府资助的国家流感免疫计划，且在许多其它国家可以得到疫苗。关于使用疫苗的具体推荐是不同的，但是通常包含年老个体和由于以前存在的慢性医学病而处于严重疾病的高危险中的大于6个月龄的个体的年度免疫。在有些国家中，疫苗用于减少流感向高危人群中的传播。在它们的总体公共健康优先权的范围内，成员国需要考虑流感预防活动的益处。
根据它们是否含有全病毒颗粒，部分打破的病毒颗粒(分裂的疫苗)或纯化的包膜抗原(亚单位疫苗)，可以将失活的疫苗分成几种类型。已经将有些亚单位疫苗与佐剂或输送系统相组合。
少数国家已经许可了用于某些目标群体的活的减毒的流感疫苗。在俄罗斯联邦，已经将一种疫苗的2种不同的制剂用于健康的成年人和儿童，已经广泛测试了另一种活疫苗。但是，在可以更广泛地得到活的减毒疫苗之前，一般仍不推荐将它们用于流感预防。
为了预防和治疗流感，已经开发出了2类抗病毒药。M2抑制剂即金刚烷胺和金刚乙胺限于治疗流感A病毒，且已经报道它们能有效地预防感染。尽管二种产品都会造成一些副作用，金刚烷胺更常见明显的神经副作用。最近，许多国家已经许可神经氨酸酶抑制剂(例如扎那米韦和奥赛米韦)用于治疗类型A和B流感，且已经报道它们对于预防也是有效的。已经在接受2类抗病毒药的患者中检测到了抗性突变株。尽管目前尚未将其视为重要的公共健康问题，但是如果非常大规模地使用这些药物，情况可能会发生变化。
WHO维持着全球国际监视计划，它在位于82个国家的110个国家流感中心和位于亚特兰大(美国)、伦敦(英国)、墨尔本(澳大利亚)和东京(日本)的4个WHO流感参考和研究协作中心的合作下运行。这些中心提供关于出现具有流行病潜能的株的早期警告系统。该系统很重要，因为如果流感疫苗不含有目前循环的株，则其功效会降低。WHO会发布关于疫苗组成的推荐，如可以在由世界卫生组织出版的WeeklyEpidemiological Record(例如见，issue 9，2004，79，第88页或http://www.who.int/wer)中所见的，2月发布在北半球使用的疫苗，9月发布在南半球使用的疫苗。由于流感在赤道区具有不太确定的季节特征，流行病学的考虑会影响这些推荐中的哪一种(2月或9月)适用于在赤道国家使用的疫苗。
协作中心对国家中心提交的流感分离株进行抗原和遗传分析。当观察到抗原变化的证据时，将其与流行病学数据进行比对，以估计该变体的流行病学显著性。使用在疫苗接种之前和之后收集的人血清组，将代表性的分离株与目前的疫苗株进行对比，以确定能否认为现在的疫苗会保护免受这些病毒。在出版WHO的年度疫苗推荐后，开发了高生长株，并提供给生产商作为参照病毒，以辅助生成用于疫苗生产的种子病毒。对流感疫苗的安全性和效力的测试，包括病毒失活、微生物灭菌、用于破坏病毒的化学试剂的测量和确认推荐的抗原浓度。推荐疫苗能符合WHO的要求，但是，国家控制机关应当批准在每个国家使用的特定疫苗病毒。国家公共卫生机关负责推荐疫苗的使用。另外，WHO已经出版了关于预防流感的推荐(见WER No.35，2002，pp.281-288)。
已经证实，现在的流感疫苗不能保护未免疫(naive)个体，当从未遇到流感感染的许多个体处于危险中并出现流感大流行爆发时，该事实会变得非常重要。病毒一般通过下述方法开始它们的寿命周期结合到宿主细胞表面受体上，进入细胞，使它们的病毒核酸脱壳，随后复制病毒基因组。在合成了新拷贝的病毒蛋白和基因后，将这些组分包装进后代病毒粒子中，它们然后退出细胞。在装配步骤的过程中，后代病毒必须从存在于细胞质中的大量病毒和细胞核酸中有效地选择它的基因组核酸。将病毒基因组包装进病毒粒子中，典型地包含被病毒核酸中的顺式作用序列的病毒组分所识别，所谓的“包装信号”。定义这样的信号对于理解病毒生命周期是重要的，且为我们提供了可以用于构建表达外来蛋白的病毒载体的信息。实际上，使用逆转录病毒作为表达外来蛋白的基因输送载体的运输工具，可以在很大程度上归因于非常确实地理解将它们的vRNA包装进后代病毒粒子的过程。
不太理解其它RNA病毒的基因组包装信号，阻碍了它们作为表达和输送外来基因的载体的应用进程。例如，流感A病毒是有包膜的负链RNA病毒，它的分段的基因组具有核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的编码能力。
该病毒在包膜上具有2种跨膜糖蛋白，血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA蛋白能结合到宿主细胞表面上的含有唾液酸的受体上，并在受体介导的胞吞作用后，介导病毒包膜与内体膜的融合。相反地，NA蛋白提供下述机理在感染晚期起关键作用从唾液酸寡糖去除唾液酸，从而从细胞表面释放出新装配的病毒粒子，并阻止病毒粒子的自聚集。在包膜内，包含8个不同病毒RNA(vRNA)片段的病毒基因组紧密连接到核蛋白(NP)和聚合酶蛋白(PA，PB1，和PB2)上，形成核糖核蛋白复合物。为了生成感染性病毒，需要全部8个(或者在C类型病毒的情况下全部7个)功能性基因片段。已经描述了聚合酶基因中的多个突变(WO2004/094466，WO2003/091401，US 5578473，Fodor等，J.Virol.77，5017-5020，2003)，其会改变聚合酶活性，或者以另一种方式改变聚合酶，但不会使它减弱在合成病毒RNA中的功能性，以使含有这种突变的聚合酶的病毒不能复制。在WO2004/094466中，生成了具有突变的PA基因的感染性病毒，由此证实了允许生产和回收具有突变的基因的感染性病毒的选择系统的益处。在WO2003/091401中，证实了如何生产具有聚合酶基因突变的感染性病毒，以便生产和回收具有与活的减毒的疫苗病毒生产有关的理想性能(例如温度敏感性或其它类型的减毒)的流感病毒。在US55788473中，提出了可以改变多种聚合酶的特异性和降低其活性的聚合酶基因片段。但是，它们没有用于重构病毒，更不用说重构已经完全丧失了它的聚合酶活性的病毒了。另外，在上述的申请中，都没有生产出有缺陷的已经丧失了它们的复制能力的颗粒。众所周知，当流感A病毒以高感染复数传代时，会生成有缺陷的病毒颗粒，其缺少一个或多个功能性基因片段。在这样的病毒颗粒中，由于流感病毒聚合酶造成的错误，一个或多个功能基因被替换为有缺陷的干扰(DI)基因片段。由于高感染复数，和因此细胞感染了超过一个病毒颗粒，含有DI RNA的病毒的缺陷被含有完整拷贝的丢失的功能基因的病毒所补偿。近来证实，酸性聚合酶基因中的某些突变会提高生成具有缺陷基因的病毒颗粒的效率(Fodor 2003)。重要的是注意到，在这些实验中的有缺陷的病毒颗粒的生成和互补都在这些实验中随机地发生。该随机的过程会限制DI RNA和条件性缺陷的病毒颗粒在实际应用中的使用。而且，当使用这些公开的方法生产有缺陷的病毒颗粒时，除了需要的条件性缺陷的病毒外，还生成了野生型能复制的病毒。这种能复制的病毒可以是完全野生型(辅助病毒)或由辅助病毒和缺陷病毒的遗传混合形成的重排株(reassortant)。流感病毒的基因片段的包装过程，无论是通过随机的还是特异性的机理，都已经争论了许多年。已经描述了这2种选择的一些证据。随机包装的证据是，聚集的病毒颗粒具有比未聚集的病毒颗粒更高的感染性，且当以低传染方式(moi)感染细胞培养物时，一些感染的细胞不能表达一个片段，这二者表明存在不含有完整流感病毒基因组的病毒粒子。随机包装的其它证据是，已经在实验中生产了含有9个片段的流感病毒。
一个支持特异性包装过程的理由是，尽管所有基因片段都等量地存在于病毒原液中，它们以不同的量存在于生产细胞中。另外，当生成了有缺陷的干扰(DI)颗粒时，DI vRNA会替换其所源自的片段(有缺陷的干扰颗粒是其中一个基因片段具有较大的内部缺失的病毒颗粒。当病毒以高moi传代时，会出现这些颗粒)。最后，病毒粒子形成的效率随着基因片段数目的增加而增加。
发明概述有缺陷的流感病毒颗粒(例如Mena I.等.，J.Virol.705016-24(1996)；Neumann G.等.，J.Virol.74547-51(2000).)可以用作疫苗候选品，因为它们会诱导针对除了HA和NA以外的其它病毒蛋白的抗体，如果它们能进入宿主细胞，因为它们除了体液反应之外还可以诱导针对病毒的细胞免疫反应(例如辅助T细胞，细胞毒性T细胞)。迄今为止，已经通过转染生产了有缺陷的流感病毒颗粒(Mena I.等.，J.Virol.705016-24(1996)；Neumann G.等.，J.Virol.74547-51(2000).)，减少了生产大量这种颗粒的可能性。该方法的一个替代方案是，生产条件性缺陷的病毒颗粒，使它们能在某些生产系统中复制，但是不能在正常细胞或生产系统中复制。为此，修饰了生产系统的细胞，使其能生产一个或多个流感病毒基因或基因产物，能反式互补有缺陷的流感病毒颗粒。本发明首次公开了有缺陷的流感病毒颗粒的确定的反式互补。在实验室中，当携带野生型的有缺陷的干扰基因片段的病毒补偿了同一细胞中的有缺陷的干扰流感病毒时，已经观察到了流感病毒颗粒的反式互补。该反式互补的“自然系统”不能用于生产确定的条件性缺陷的流感病毒颗粒。首先，该系统要求，一种(部分地)有缺陷的病毒被至少一种(部分地)能复制的病毒所补偿，这会导致意外地生成全感染性的病毒。其次，因为不同的基因片段以随机方式生产有缺陷的干扰颗粒，不能生产确定的条件性缺陷的病毒颗粒。
条件性缺陷的流感病毒颗粒理论上可以基于完整基因片段或其部分的缺失。如果流感病毒基因组的包装依赖于所有8个片段的存在(这是许多争论中的一种版本(见本说明书中的其它地方))，通过删除完整基因片段(和反式生产编码的基因产物)来生产确定的条件性缺陷的病毒颗粒的能力会受到限制。如果包装过程要求所有8个基因片段的存在，不知道是否需要所有的基因片段都以全长形式存在，这使得条件性缺陷的病毒颗粒的生产进一步复杂化。本发明已经解决了这些问题。
本发明提供了得到条件性缺陷的流感病毒颗粒的方法，其包括第一步，用下述物质转染合适的第一种细胞，例如293T细胞具有内部缺失的基因构建体，例如本文提供的通过内部删除编码流感聚合酶的核酸衍生的pΔPB2，pΔPB1，pΔPA或pDIPA，由此使所述的基因构建体不能生产能拷贝或合成病毒RNA的功能聚合酶；和编码流感病毒的互补流感病毒核酸片段，例如7个能编码A/WSN/33的互补构建体(HW181-188，Hoffmann等.，2000)；和能在所述细胞中表达所述聚合酶的表达质粒，例如本文提供的HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一个；在转染后合适的时间点，例如10-50小时内、优选地在约20-30小时，从所述的第一种细胞的上清液中收获至少一个病毒颗粒；第二步，用能在所述细胞中表达所述聚合酶的表达质粒转染合适的第二种细胞，例如MDCK细胞；第三步，用包含从所述的第一种细胞得到的至少一个病毒颗粒的上清液转染所述的第二种细胞；第四步，包括在转染后合适的时间点，例如24-96小时、优选48-72小时，从所述的第一种细胞的上清液中收获至少一个(现在为条件性缺陷的，因为生成的病毒缺少能表达拷贝或合成病毒RNA的功能聚合酶的基因片段，因为它们包装了具有内部缺失的基因片段)病毒颗粒。
优选的是能使基因片段不能生产功能蛋白的内部缺失，但是它不得阻止将病毒的基因片段包装进病毒颗粒中。优选地，这些缺失分别从5’和3’非编码区计算。对于流感A，对于PA蛋白，这些优选的缺失从例如位于核苷酸58至75之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至50之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB1蛋白，从位于核苷酸43至75之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸24至50之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB2蛋白，从位于核苷酸34至50之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至50之间(不含端点)的3’-核苷酸结束。更优选地，这些缺失对于PA蛋白，从位于核苷酸58至100之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至100之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB1蛋白，从位于核苷酸43至100之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸24至100之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB2蛋白，从位于核苷酸34至100之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至100之间(不含端点)的3’-核苷酸结束。甚至更优选地，这些缺失对于PA蛋白，从位于核苷酸58至150之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至150之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB1蛋白，从位于核苷酸43至150之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸24至150之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB2蛋白，从位于核苷酸34至150之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至150之间(不含端点)的3’-核苷酸结束。更优选地，这些缺失对于PA蛋白，从位于核苷酸58至175之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至175之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB1蛋白，从位于核苷酸43至175之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸24至175之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB2蛋白，从位于核苷酸34至175之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至175之间(不含端点)的3’-核苷酸结束。最优选地，这些缺失对于PA蛋白，从位于核苷酸58至207之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至194之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB1蛋白，从位于核苷酸43至246之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸24至197之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB2蛋白，从位于核苷酸34至234之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于核苷酸27至209之间(不含端点)的3’-核苷酸结束。
在本文中，将互补片段定义为能导致一整套8个基因片段(例如流感A病毒的)的片段。因而，如果片段1已经用于生产有缺陷的片段，则互补(无缺陷的)片段是片段2，3，4，5，6，7和8。如果片段2是有缺陷的，则互补片段是片段1，3，4，5，6，7和8。依此类推。
有利地，本发明提供了一种方法，由此不需要或不存在辅助病毒。
本发明提供了分离的和条件性缺陷的流感病毒颗粒，其缺少编码选自酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶1(PB1)和碱性聚合酶2(PB2)的聚合酶的功能性流感病毒核酸片段(在本文中也称作条件性缺陷的流感病毒颗粒)，所述的颗粒不能生成聚合酶或不能用作聚合酶的来源，以拷贝或合成病毒RNA，由此仅仅且有条件地允许在用功能聚合酶反式补偿的细胞中生成可复制的病毒颗粒。另外，本发明提供了得到条件性缺陷的流感病毒颗粒的方法，包括通过用功能性流感病毒聚合酶反式补偿，来提供细胞。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的颗粒能在用该颗粒自身缺少的类似核酸片段补偿的细胞中复制，例如缺少功能性流感病毒核酸PA片段的颗粒可以在至少已经提供或补偿了功能性流感病毒核酸PA片段的细胞中复制，缺少功能性流感病毒核酸PB1片段的颗粒可以在至少已经提供了功能性流感病毒核酸PB1片段的细胞中复制，缺少功能性流感病毒核酸PB2片段的颗粒可以在至少已经提供了功能性流感病毒核酸PB片段的细胞中复制。在一个优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明的颗粒，其具有能编码病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段，更优选地具有能编码核蛋白(NP)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。在一个实施方案中，提供了根据本发明的颗粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。另外，提供了根据本发明的颗粒，其含有不能编码流感肽的核酸。另外，本发明提供了分离的细胞，其包含根据本发明的颗粒，所述细胞不含有野生型流感病毒或辅助病毒，但是优选地已经被提供了或补偿了流感病毒聚合酶或编码它的基因片段。在一个优选的实施方案中，这样的细胞是反式补偿的293T或MDCK细胞。在一个实施方案中，本发明提供了分离的细胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PA片段的颗粒，所述细胞不含有野生型流感病毒或辅助病毒，但是至少已经被提供或补偿了功能性流感病毒核酸PA片段或功能性PA。在另一个实施方案中，本发明提供了分离的细胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PB1片段的颗粒，所述细胞不含有野生型流感病毒或辅助病毒，但是至少已经被提供了功能性流感病毒核酸PB1片段或功能性PB1。在另一个实施方案中，本发明提供了分离的细胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PB2片段的颗粒，所述细胞不含有野生型流感病毒或辅助病毒，但是至少已经被提供了或补偿了功能性流感病毒核酸PB2片段或功能性PB2。另外，本发明提供了组合物，其包含根据本发明的颗粒或细胞或源自根据本发明的细胞的物质，和这样的组合物在生产药物组合物中的应用，所述的药物组合物能产生使对象免受流感病毒感染的免疫保护。因此，本发明提供了产生使对象免受流感病毒感染的免疫保护的方法，包括给需要的对象提供根据本发明的组合物。另外，本发明提供了根据本发明的流感病毒颗粒在生产组合物中的应用，所述的组合物用于将不编码流感肽的核酸输送进细胞中。另外，本发明提供了根据本发明的颗粒在生产药物组合物中的应用，所述的组合物用于将不编码流感肽的核酸输送进对象的细胞中，和将不编码流感肽的核酸输送进细胞或对象中的方法，包括给所述的细胞或对象提供根据本发明的颗粒。
本发明提供了条件性缺陷的流感病毒颗粒，当与它的自然基因组相比较时，其缺少一个功能性流感病毒片段，它是与野生型或辅助A或B类型病毒相比时，具有7个(而不是8个)不同的功能性流感病毒核酸片段，或与野生型或辅助C类型病毒相比时，具有6个(而不是7个)不同的功能性流感病毒核酸片段。当在本文中使用术语“条件性缺陷的”时，它包括但不限于，病毒颗粒，其中一个病毒基因片段具有较大的内部缺失，这导致从它表达无功能的蛋白。感染性病毒的生产，需要所有8个基因片段(例如流感A病毒的)和它们编码的所有蛋白。因而，含有缺陷基因片段的病毒自身是有缺陷的它可以感染细胞，且可以经过一个复制周期，因为所有病毒蛋白都存在于该病毒粒子(例如，当生产病毒时，通过表达质粒生产该蛋白)中，但是在感染的细胞中没有生成感染性病毒颗粒，因为该病毒不能生产一种病毒蛋白。但是，当感染的细胞能表达一般由有缺陷的基因片段表达的蛋白时，有缺陷的病毒可以在这些细胞中复制，因为所有的病毒蛋白都存在。因而，这些病毒是条件性缺陷的直到提供具有正确条件的细胞，它们才可以复制(在该情况下，细胞会表达因为病毒缺少基因片段而不编码的病毒蛋白)。
另外，本发明提供了条件性缺陷的流感病毒颗粒，其缺少能编码聚合酶的功能性流感病毒核酸片段。在本文中，功能性流感病毒核酸片段包含能编码功能性流感蛋白的核酸，其允许生成可复制的病毒，且是必需的。例如，流感A病毒是负链RNA病毒，其具有8-段的基因组。8个基因片段能编码11种蛋白；基因片段1-8能分别编码碱性聚合酶2(PB2)、碱性聚合酶1(PB1)和PB1-ORF2(F2)，酸性聚合酶(PA)，血细胞凝集素(HA)，核蛋白(NP)，神经氨酸酶(NA)，基质蛋白1和2(M1，M2)和非结构蛋白1和2(NS1，NS2)。8个基因片段的编码区的侧翼为病毒RNA合成必需的非编码区(NCR)。分别在病毒基因组RNA的5’和3’-端的末端13和12个核苷酸在所有流感A病毒片段中是保守的，且是部分地互补的，以形成能被病毒聚合酶复合物识别的二级结构。NCR可以含有至多60个其它核苷酸，它们在8个基因片段之间是不保守的，但是在不同的流感病毒之间是相对保守的。有效的病毒基因组包装需要NCR和编码区中的侧翼序列。因而，功能性流感病毒核酸片段由具有编码功能性流感蛋白的潜力、允许生成可复制的病毒的序列(1或2个开放读码框/片段)、mRNA、病毒RNA(vRNA)和与病毒RNA互补的RNA(cRNA)转录所需的NCR和存在于NCR和侧翼编码序列中的包装信号组成。
优选地，所述的条件性缺陷的缺少一个流感病毒核酸的流感病毒颗粒缺少能编码功能聚合酶PA、PB1或PB2的片段。另外，对于疫苗目的，所述的颗粒优选地具有能编码病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。
在一个实施方案中，本发明提供了流感A病毒颗粒，其具有7个不同的流感A核酸片段。根据本发明的有缺陷的流感病毒颗粒能够复制，虽然在合适的、未补偿的宿主动物或细胞中仅仅一次。
在合适的补偿的细胞中，根据本发明的颗粒可以复制多个循环。对于疫苗和基因输送目的，有缺陷的颗粒不能在正常的、未反式补偿的细胞中无限复制是一个很大的优点，由此减少了疫苗病毒在宿主间扩散的危险，并减少了回复到野生型病毒的危险。
这是首次使用反向遗传学生产有缺陷的流感A病毒，其仅仅含有7个功能性基因片段，且可以经历1个周期的复制，或者当反式补偿了有缺陷的基因片段时，可以经历多个周期的复制。在一个实施方案中，本发明提供了条件性缺陷的流感病毒颗粒，其缺少基本编码酸性聚合酶(PA)的流感核酸片段。与PA的反式互补类似，可以预见其它流感病毒基因的反式互补。但是，由于已经证实PA表达水平不如其它流感病毒蛋白的表达水平关键，PA是缺失的聚合酶组的优选基因片段，也可以生产缺失了PB2和PB1的病毒，不能反式补偿缺失了NP的病毒。在一个优选的实施方案中，本发明提供了条件性缺陷的流感A病毒颗粒，其具有7个不同的流感A核酸片段，且缺少基本编码酸性聚合酶的流感A核酸片段。对于疫苗目的，优选的根据本发明的条件性缺陷的流感A病毒颗粒具有基本编码血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的流感A核酸片段，这些蛋白对于赋予保护是免疫学上最相关的。为了选择合适的包含在疫苗中的基因片段，基因片段优选地选自WHO推荐的用于疫苗用途的病毒。当然，根据要接种预防的流感变体的HA和NA亚型，HA和NA亚型可以变化。最优选地，生产根据本发明的条件性缺陷的流感病毒颗粒，其具有基本编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，“基本编码”在本文中具体指功能性蛋白由各自的基因片段表达。特别地，在具有功能性PA或能编码PA的功能性基因片段的分离的细胞中提供了这样的颗粒。在另一个实施方案中，在本文中提供了根据本发明的条件性缺陷的流感病毒颗粒，其具有基本编码核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶2(PB2)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，“基本编码”在本文中具体指功能性蛋白由各自的基因片段表达。特别地，在具有功能性PB1或能编码PB1的功能性基因片段的分离的细胞中提供了这样的颗粒。在另一个实施方案中，在本文中提供了根据本发明的条件性缺陷的流感病毒颗粒，其具有基本编码核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶1(PB1)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，“基本编码”在本文中具体指功能性蛋白由各自的基因片段表达。特别地，在具有功能性PB2或能编码PB2的功能性基因片段的分离的细胞中提供了这样的颗粒。在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的颗粒，其另外含有不能编码流感肽的核酸，例如，编码用于引发免疫反应的外来蛋白或肽，或其含有能干扰细胞或病原体在细胞中的功能的核酸。
另外，本发明提供了包含根据本发明的流感病毒颗粒的细胞。当没有为颗粒提供基本编码所需的聚合酶的基因片段时，有用的是考虑已经被提供了合适的功能性流感病毒聚合酶的细胞，允许有缺陷的流感病毒颗粒在这样补偿的细胞中复制多个周期。
另外，本发明提供了组合物，其包含根据本发明的有缺陷的流感病毒颗粒或细胞或源自根据本发明的细胞的物质；这样的组合物可以例如用于生产旨在生成使对象免受流感病毒感染的免疫保护的药物组合物。另外，本发明提供了产生使对象免受流感病毒感染的免疫保护的方法，包括给需要的对象提供这样的组合物。除了根据本发明的颗粒作为疫苗或免疫组合物的应用外，优选地将这样的组合物配制成疫苗，即通过混合病毒颗粒或源自这样的颗粒的病毒蛋白(分裂-疫苗)与适当的药物载体，例如盐溶液或佐剂(例如常用的铝盐或其它赋形剂(见例如http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excipient.pdf.)。根据本发明的条件性缺陷的流感病毒颗粒也是用于外来基因输送和表达外来蛋白的备选载体，因为可以将功能性基因例如插入在5’和3’PA序列之间。考虑到本发明提供了得到条件性缺陷的、可能含有外来或宿主核酸片段或其片段的流感病毒颗粒的方法，其包括第一步，用下述物质转染合适的第一种细胞通过内部删除能编码流感蛋白的核酸而衍生的一个或多个基因构建体，由此使所述的基因构建体不能生产功能蛋白，且不能阻止将病毒的基因片段包装进病毒颗粒；和能编码流感病毒的互补流感病毒核酸片段；和能在所述细胞中表达所述蛋白的一个或多个表达质粒；在转染后合适的时间点，从所述的第一种细胞的上清液中收获至少一个病毒颗粒；第二步，用能在所述细胞中表达所述蛋白的一个或多个表达质粒转染合适的第二种细胞；第三步，用包含从所述的第一种细胞得到的至少一个病毒颗粒的上清液感染所述的第二种细胞；第四步，包括在感染后合适的时间点，从所述的第二种细胞的上清液中收获至少一个病毒颗粒。因此，本发明提供了得到条件性缺陷的流感病毒颗粒的方法，其包括用下述物质转染合适的细胞通过内部删除能编码流感聚合酶的核酸而衍生的一个或多个基因构建体，由此使所述的基因构建体不能生产功能聚合酶，且不能阻止将病毒的基因片段包装进病毒颗粒；和能编码流感病毒的互补流感病毒核酸片段；和能在所述细胞中表达所述聚合酶的一个或多个表达质粒；在转染后合适的时间点，从所述细胞的上清液中收获至少一个病毒颗粒。所述的得到条件性缺陷的流感病毒颗粒的方法，包括第一步，用能在所述细胞中表达流感聚合酶的一个或多个表达质粒转染合适的细胞；第二步，用包含条件性缺陷的流感病毒颗粒的上清液感染所述的细胞；第三步，包括在感染后合适的时间点，从所述细胞的上清液中收获至少一个病毒颗粒；或得到条件性缺陷的流感病毒颗粒的方法，其包括第一步，用下述物质转染合适的第一种细胞通过内部删除能编码流感聚合酶的核酸而衍生的一个或多个基因构建体，由此使所述的基因构建体不能生产功能聚合酶，且不能阻止将病毒的基因片段包装进病毒颗粒；和能编码流感病毒的互补流感病毒核酸片段；和能在所述细胞中表达所述聚合酶的一个或多个表达质粒；在转染后合适的时间点，从所述的第一种细胞的上清液中收获至少一个病毒颗粒；第二步，用能在所述细胞中表达所述聚合酶的一个或多个表达质粒转染合适的第二种细胞；第三步，用包含从所述的第一种细胞得到的至少一个病毒颗粒的上清液感染所述的第二种细胞；第四步，包括在感染后合适的时间点，从所述的第二种细胞的上清液中收获至少一个病毒颗粒。在该方法中，所述的聚合酶可以是例如酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶1(PB1)或碱性聚合酶2(PB2)。优选地，本发明提供了通过内部删除能编码流感聚合酶的核酸造成内部缺失的方法，对于PA蛋白，所述的内部缺失从位于由非编码区计起的核苷酸58至207之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于由非编码区计起的核苷酸27至194之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；或者对于PB1蛋白，从位于由非编码区计起的核苷酸43至246之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于由非编码区计起的核苷酸24至197之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；或者对于PB2蛋白，从位于由非编码区计起的核苷酸34至234之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于由非编码区计起的核苷酸27至209之间(不含端点)的3’-核苷酸结束。在另一个变体中，将外来片段插入该内部缺失中。另外，本发明提供了用包含条件性缺陷的流感病毒颗粒的上清液感染细胞的方法，所述的细胞已经能表达无功能的聚合酶，例如酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶1(PB1)或碱性聚合酶2(PB2)，和可以通过本文所述的方法得到的流感颗粒。例如，要用基因构建体和核酸片段转染的细胞已经能表达无功能的聚合酶。更具体地，本发明提供了流感病毒颗粒，其包含一个或多个在片段中具有内部缺失的核酸片段，所述缺失使片段不能生产功能性流感聚合酶，且不能阻止将病毒的基因片段包装进病毒颗粒中，其中聚合酶选自酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶1(PB1)或碱性聚合酶2(PB2)。优选地，内部缺失对于PA蛋白，从位于由非编码区计起的核苷酸58至207之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于由非编码区计起的核苷酸27至194之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB1蛋白，从位于由非编码区计起的核苷酸43至246之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于由非编码区计起的核苷酸24至197之间(不含端点)的3’-核苷酸结束；对于PB2蛋白，从位于由非编码区计起的核苷酸34至234之间(不含端点)的5’-核苷酸开始，至位于由非编码区计起的核苷酸27至209之间(不含端点)的3’-核苷酸结束。在一个优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明的颗粒，其具有能编码病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。本发明还提供了根据本发明的颗粒，其具有能编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段，或者提供了颗粒，其具有能编码核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶2(PB2)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段，或者提供了颗粒，其具有能编码核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶1(PB1)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。更具体地，本发明提供了根据本发明的颗粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。本发明还提供了根据本发明的颗粒，其含有不编码流感肽的核酸。另外，本发明提供了包含根据本发明的颗粒的细胞，更具体地，细胞已经含有一种或多种流感病毒聚合酶，其中聚合酶选自酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶1(PB1)或碱性聚合酶2(PB2)。另外，本发明提供了组合物，其包含根据本发明的颗粒或细胞或源自根据本发明的细胞的物质，这样的组合物在生产旨在生成使对象免受流感病毒感染的免疫保护的药物组合物中的应用，和产生使对象免受流感病毒感染的免疫保护的方法，包括给需要的对象提供这样的组合物。另外，本发明提供了根据本发明的颗粒在生产旨在将不编码流感肽的核酸输送给细胞的组合物中的应用，和根据本发明的颗粒在生产旨在将不编码流感肽的核酸输送给对象的细胞中的药物组合物中的应用。这样的核酸(在本文中也称作外来核酸)可以编码外来基因或基因片段，后者能编码合适的抗原表位或蛋白，或者可以编码一段核苷酸，后者能干扰细胞中的核酸转录。在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的流感A病毒颗粒在生产旨在将不编码流感肽的核酸输送进细胞或对象的细胞中的组合物中的应用。另外，本发明提供了将不编码流感肽的核酸输送进细胞或对象中的方法，包括给所述细胞或所述的对象提供有缺陷的流感病毒颗粒，其含有根据本发明的外来核酸。
附例
图1的图例条件性缺陷的流感A病毒的生产和繁殖。首先，用7个能编码A/PR/8/34的双向质粒、pHMG-PA和适当时的pΔPA或pDIPA转染了293T细胞。转染后48小时，收获转染的细胞的上清液，并用于接种给MDCK细胞和提前24小时用HMG-PA转染的MDCK细胞。将病毒复制阳性的MDCK-PA细胞的上清液在MDCK和MDCK-PA细胞中传代4次。
图2的图例用于生产条件性缺陷的病毒颗粒的构建体。上图显示了野生型PA基因片段。标示了非编码区(NCR)和起始密码子。通过用StuI消化pHW183，一种含有A/WSN/33的PA的双向质粒(9)，并随后重新连接，构建了pΔPA。通过将A/PR/8/34的PA基因片段的5’194和3’207nts克隆入pSP72中，构建了pDIPA。然后将插入物转移给双向的反向遗传学载体。如本文所述，构建了pΔPB1和pΔPB2。
图3的图例RT-PCR分析PA基因片段在上清液rPR8-7，rPR8-ΔPA和rPR8-DIPA中的存在。使MDCK-PA第4代上清液穿过22μM过滤器，并离心浓缩。随后，分离RNA，并使用针对PA片段的非编码区的引物，进行RT-PCR。使用从野生型A/PR/8/34分离出的RNA作为对照。泳道1rPR8-7；泳道2rPR8-ΔPA；泳道3 rPR8-DIPA；泳道4野生型A/PR/8/34。标记物大小标示在左侧。
图4的图例再删除pΔPA构建体的较大部分，产生了pΔPA-2，pΔPA-3，pΔPA-4，pΔPA-5。
发明详述实施例1从重组DNA生成有缺陷的流感A病毒颗粒流感A病毒是负链的、分段的病毒。其基因组由8个基因片段组成。所有8个功能性基因片段是生产感染性病毒所必需的，即所述的感染性病毒是可复制的病毒，其能在通常认为适合流感病毒复制的细胞中复制无限个或至少几个周期。流感A病毒的基因片段的包装过程，无论是通过随机的还是特异性的机理，都已经争论了许多年。已经描述了这2种选择的一些证据。随机包装的证据是，聚集的病毒颗粒具有比未聚集的病毒颗粒更高的感染性(6)，且当以低moi感染细胞培养物时，一些感染的细胞不能表达一个片段(8)，这二者表明存在不含有完整流感病毒基因组的病毒粒子。随机包装的其它证据是，已经在实验中生产了含有9个片段的流感病毒(4)。Bancroft和Parslow发现，源自相同的基因片段的vRNA之间在包装病毒粒子方面没有竞争(1)。
一个支持特异性包装过程的理由是，尽管所有基因片段都等量地存在于病毒原液中，它们以不同的量存在于生产细胞中(10)。另外，当生成了有缺陷的干扰(DI)颗粒时，DI vRNA会替换其所源自的片段(3)(有缺陷的干扰颗粒是其中一个基因片段具有较大的内部缺失的病毒颗粒。当病毒以高moi传代时，会出现这些颗粒，且认为其发生的原因是聚合酶酸性蛋白的R638A突变[Fodor等；J.Virol.77，5017-5020，2003])。最后，病毒粒子形成的效率随着基因片段数目的增加而增加(5)。Fujii等也证实了NA片段区，它是将片段有效地整合进病毒粒子所必需的，后来该研究组也证实了HA和NS区，其对于包装进病毒颗粒是重要的[Fujii，2005#256；Watanabe，2003#184]。
在这里，我们提出了特异性包装的证据。为了生产仅仅含有7个功能性基因片段的病毒颗粒，我们必须确定可以省去哪个基因片段，而不妨碍病毒生产。鉴于有复制缺陷的病毒作为疫苗的应用，未省去HA和NA，也未省去MA或NS，因为需要2个分开的表达质粒。我们生产了缺少聚合酶基因的病毒。当没有用表达质粒反式补偿缺失的基因片段时，我们不能生产病毒(表1，2和3，rPR8-7ntc)。在7个基因片段和能以非常低的滴度表达通常由缺失的基因片段表达的蛋白的质粒转染后，可以生产病毒(表1，2和3，rPR8-7)。因此，生产了流感病毒A/WSN/33的基因片段1，2和3的缺失突变体，其分别携带1032，528和1120个核苷酸的内部缺失。将这些缺失突变体命名为pΔPB2，pΔPB1和pΔPA(见图2)。如前所述(de Wit，E.，M.I.Spronken，T.M.Bestebroer，G.F.Rimmelzwaan，A.D.Osterhaus，and R.A.Fouchier.2004.Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34from eight cDNA fragments.Virus Res 103155-61)，用这些缺失的基因片段中的每一个和7个互补的能编码A/PR/8/34的双向构建体(DeWit等，2004)和合适的表达质粒，转染了293T细胞。在转染后48小时，收获上清液。随后，如前所述(2)，用表达质粒HMG-PB2，HMG-PB1或HMG-PA中的一个，转染了MDCK细胞。将这些转染的细胞接种给转染的293T细胞的对应上清液(见图1，其解释了实验方法)。通过HA-实验，确定了这些MDCK细胞中的病毒复制。开始时，在未转染的MDCK细胞中没有病毒复制。在用HMG-PB2，HMG-PB1或HMG-PA转染的、接种到对应上清液中的MDCK细胞中，发现了病毒复制。接着，在从流感序列数据库(www.flu.lanl.gov，登记号K00867)得到的流感病毒A/PR/8/34的有缺陷的干扰PA vRNA的序列的基础上，我们克隆了有缺陷的PA基因片段。PCR-扩增了PA的5’207nt和3’194nt，克隆进源自如前所述(De Wit等.，2004)修饰的pHW2000(7)的双向转录载体中。得到的质粒称作pDIPA(见图2)。用pDIPA，HMG-PA和7个能编码剩余的流感病毒A/PR/8/34基因片段的双向构建体转染了293T细胞(见图2)。转染后48小时，收获上清液，随后，将提前24小时用HMG-PA转染的MDCK细胞接种给该上清液。接种后72小时，在这些MDCK细胞的上清液中进行HA-实验，发现是阳性的，这指示着这些细胞中的病毒复制。如通过HA-实验所确定的，接种未转染的MDCK细胞也不能导致病毒生产。随后在未转染或转染了HMG-PA的MDCK细胞上，传代含有PA-缺陷的病毒颗粒的上清液，产生了相同的结果(表1)。直到第4代，在用HMG-PA转染的MDCK细胞中生产了病毒。系列稀释了MDCKp4的上清液，得到病毒滴度的示度(indication)，证实它是约104TCID50/ml。
使用的方法步骤是用构建体pΔPB2，pΔPB1，pΔPA，pΔNP中的一个，7个能编码A/PR/8/34的互补构建体(De Wit等.，2004)和HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一个(表达质粒描述在例如Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，and A.Garcia-Sastre.1996.A plasmid-based reverse genetics systemfor influenza A virus.J Virol 704188-92.；获自A.Garcia-Sastre andP.Palese)，转染了293T细胞(关于转染方法，见De Wit等.，2004)。在转染后48小时，收获转染的293T细胞的上清液。当生成了病毒时，它们存在于上清液中。同时，用表达质粒HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一个(根据使用的缺失突变体，所以在使用pΔPB2的情况下，则用HMG-PB2转染MDCK细胞)转染了MDCK细胞(关于转染方法，见Basler等.，2000)，因为生产的病毒缺少能表达该蛋白的基因片段，因为它们包装了含有内部缺失的基因片段。在转染后24小时，将转染的MDCK细胞接种给从转染的293T细胞得到的上清液。当病毒存在于293T上清液中时，该病毒会在转染的MDCK细胞中复制，并生产更多的病毒。在接种后72小时，可以再次收集上清液。
为了证实没有发生会产生功能性PA基因片段的PA或DIPA重组，从MDCKp4的上清液分离出了RNA。首先，使上清液穿过22μM过滤器，并离心浓缩。随后，分离RNA，并使用针对PA片段的非编码区的引物，进行RT-PCR。使用对PA vRNA特异性的引物进行的RT-PCR证实了，ΔPA和DIPA经过多次传代后仍然稳定。在感染了DIPA病毒颗粒的MDCK细胞的上清液中，出现了约400bp的清晰带，在感染了含有ΔPA的病毒的MDCK细胞的上清液中，出现了1100bp的带。在感染了野生型A/PR/8/34的MDCK细胞的上清液中，可见约2300nt的带(图3)。这些结果表明，ΔPAPR8基因片段稳定地包装进了病毒粒子中。
为了生产缺少PB2的病毒，用7个能编码流感病毒A/PR/8/34的基因片段2，3，4，5，6，7和8(de Wit，E.，M.I.Spronken，T.M.Bestebroer，G.F.Rimmelzwaan，A.D.Osterhaus，和R.A.Fouchier.2004.Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34from eight cDNA fragments.Virus Res 103155-61)的双向构建体转染了293T细胞(Hoffmann，E.，G.Neumann，Y.Kawaoka，G.Hobom，和R.G.Webster.2000.A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids.Proc Natl Acad Sci USA976108-13.)，导致了vRNA和mRNA的表达。共转染了能表达A/PR/8/34的PB2、pHMG-PB2的质粒(Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，和A.Garcia-Sastre.1996.Aplasmid-based reverse genetics system for influenza A virus.J Virol704188-92.)。作为对照，仅仅转染了能编码A/PR/8/34的7个双向构建体，省去了pHMG-PB2。转染后48小时，收获上清液，并接种给MDCK细胞或提前24小时在100mm盘中转染了pHMG-PB2(MDCK-PB2)的MDCK细胞。接种后3天，使用火鸡红细胞作为病毒生产的指示剂，测试了接种的MDCK细胞的上清液的血细胞凝集活性。在接种了仅仅转染了7个基因片段、没有转染pHMG-PB2(rPR8-7ntc，表2)的293T细胞的上清液的细胞中，没有检测到病毒。接种了转染了7个基因片段和pHMG-PB2的293T细胞上清液的MDCK-PB2细胞上清液是阳性的。随后，使rPR8-7上清液在MDCK和MDCK-PB2细胞中传代。rPR8-7能在MDCK-PB2细胞中复制，但是在MDCK细胞中不能(表2)。我们接着生产了流感病毒A/WSN/33的基因片段1的1032nt缺失突变体，产生了344个氨基酸的缺失(pΔPB2，图2)。如上所述，生产了含有ΔPB2(rPR8-ΔPB2)的重组病毒(图1)。在MDCK细胞中没有检测到病毒，而在接种了rPR8-ΔPB2的MDCK-PB2细胞中检测到了病毒。传代rPR8-ΔPB2后，在MDCK细胞中没有病毒生成的证据，这与MDCK-PB2细胞相反(表2)。
还生产了缺少PB1的病毒。用能编码流感病毒A/PR/8/34的基因片段1，3，4，5，6，7和8的7个双向构建体转染了293T细胞，导致了vRNA和mRNA的表达。共转染了能表达A/PR/8/34的PB1和pHMG-PB1的质粒。作为对照，仅仅转染了能编码A/PR/8/34的7个双向构建体，省去了pHMG-PB1。转染后48小时，收获上清液，并接种给MDCK细胞或提前24小时在100mm盘中转染了pHMG-PB1(MDCK-PB1)的MDCK细胞(2)(图1)。接种后3天，使用火鸡红细胞作为病毒生产的指示剂，测试了接种的MDCK细胞的上清液的血细胞凝集活性。在接种了仅仅转染了7个基因片段、没有转染pHMG-PB1(rPR8-7ntc，表3)的293T细胞的上清液的细胞中，没有检测到病毒。接种了转染了7个基因片段和pHMG-PB1的293T细胞上清液的MDCK-PB1细胞上清液是阳性的。随后，使rPR8-7上清液在MDCK和MDCK-PB1细胞中传代。rPR8-7能在MDCK-PB1细胞中复制，但是在MDCK细胞中不能(表3)。我们接着生产了流感病毒A/WSN/33的基因片段2的528nt缺失突变体，产生了178个氨基酸的缺失(pΔPB1，图2)。如上所述，生产了含有ΔPB1(rPR8-ΔPB1)的重组病毒(图1)。在MDCK细胞中没有检测到病毒，而在接种了rPR8-ΔPB1的MDCK-PB1细胞中检测到了病毒。传代rPR8-ΔPB1后，在MDCK细胞中没有病毒生成的证据，这与MDCK-PB1细胞相反(表3)。
因而，我们已经能使用如上所述的RNA聚合酶II-驱动的PB2，PB1或PA表达质粒，通过提供pΔPB2，pΔPB1，或pΔPA/pDIPA构建体和反式互补，生产缺少片段1，2，或3的病毒。这里所述的条件性缺陷的病毒可以在非反式补偿的细胞中仅仅经历1个周期的复制，但是可以在反式互补的细胞系中繁殖。这是首次使用反向遗传学生产有缺陷的病毒，其仅仅含有7个功能性基因片段，且可以经历1个周期的复制，或者当反式补偿了有缺陷的基因片段时，可以经历多个周期的复制。
以该方式生产的有缺陷的病毒颗粒是疫苗候选品，因为它们可以经历1个周期的复制，而不生成感染性病毒。该单周期复制的结果是，疫苗会诱导体液和细胞免疫反应。尽管这些有缺陷的颗粒不能在正常细胞中复制，为了生产目的，可以使大量病毒在能表达有缺陷的蛋白的细胞系中生长。正如我们已经证实的，多个周期的复制不会影响病毒的基因型。除了有缺陷的病毒颗粒作为疫苗的应用外，它们也是基因输送和表达外来蛋白的候选载体，因为可以将功能性基因插入5’和3’PA，PB2或PB1序列之间。这也得到了Watanabe等(11)的证实，他们用外来基因替换了HA和NA，仍然能生成病毒。
pΔPA的进一步截短另外，删除了pΔPA构建体的更大部分，产生了pΔPA-2，pΔPA-3，pΔPA-4，pΔPA-5(图4)。如前所述(De Wit等.，2004)，用这些缺失的基因片段之一和能编码A/PR/8/34的7个互补双向构建体(De Wit等，2004)和能表达PA的表达质粒转染了293T细胞。转染后48小时，收获上清液。随后，如前所述(Basler，C.F.，等.，2000.Proc Natl AcadSci USA 9712289-94.)，用表达质粒HMG-PA转染了MDCK细胞。用转染的293T细胞的上清液接种了这些转染的细胞和未转染的细胞。通过HA-实验，检测了这些MDCK和MDCK-PA细胞中的病毒复制。在未转染的MDCK细胞中没有病毒复制。在接种了任一种上清液的HMG-PA转染的MDCK细胞中，发现了病毒复制。因而，所有源自这些构建体的vRNA都包装进了病毒粒子(表4)。
表1.缺少完整的PA基因片段的重组流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PA细胞中的复制
ntc未反式补偿的(在293T细胞中没有转染pHMG-PA)
表2.缺少完整的PB2基因片段的重组流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PB2细胞中的复制
ntc未反式补偿的(在293T细胞中没有转染pHMG-PB2)表3.缺少完整的PB1基因片段的重组流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PB1细胞中的复制
ntc未反式补偿的(在293T细胞中没有转染pHMG-PB1)表4.缺少完整的PA基因片段的重组流感A/PR/8/34病毒在MDCK-PA和MDCK细胞中的复制
实施例2用有缺陷的重组病毒接种疫苗在含有相关流行病病毒(例如A/莫斯科/10/99)的HA和NA基因的高通量病毒主链(例如源自疫苗株A/PR/8/34)的基础上，如本文所述，生产了条件性缺陷的缺少功能性PA、PB1或PB2基因的重组病毒。通过转染生产了条件性缺陷的病毒，其中通过反式互补实现了聚合酶蛋白表达。随后，在能稳定表达相关聚合酶的合适细胞基质(例如MDCK细胞或Vero细胞)中扩增了病毒。通过在1000xg离心10分钟，澄清了病毒上清液。通过在20-60％蔗糖梯度中进行超离心，浓缩和纯化了病毒，沉淀后，重新悬浮到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。使用考马斯亮蓝染色的12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，确认了病毒制品的纯度和数量，通过MDCK细胞和能表达相关聚合酶的MDCK细胞的感染和用抗-核蛋白单克隆抗体染色，确定了条件性缺陷的病毒的病毒滴度。使用喷雾器，给小鼠气管内地或鼻内地接种1×10550％组织-培养物感染剂量(TCID-50)。使用血凝反应抑制实验、神经氨酸酶抑制实验、ELISA或病毒中和实验，确定了接种疫苗之前和之后收集的血清样品中的针对流感病毒的HA、NA和内部蛋白的抗体滴度。通过流式细胞仪、CD4和CD8-阳性细胞的四聚体染色、细胞裂解活性、T-细胞增殖等，测量细胞内的细胞因子表达，对接种疫苗的动物中的抗原特异性的细胞免疫反应进行了定量。接种疫苗后6周，使用1×106TCID-50的流感病毒A/莫斯科/10/99或异源病毒分离株，攻击接种疫苗的动物和对照动物。攻击后，每天从动物收集鼻的或咽喉的拭抹样品，进行10天，通过定量PCR分析或病毒滴定，确定了感染动物排出的病毒的量。通过对抗体滴度的升高进行定量，确定了得到的疫苗诱导的体液免疫，通过对辅助和细胞毒性T-细胞反应的升高进行定量，确定了得到的疫苗诱导的细胞免疫，通过确定针对攻击病毒的感染的保护，确定了免疫的总水平。
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权利要求
1.有缺陷的流感病毒颗粒，当与它的天然基因组相比较时，其缺少一个功能性流感病毒核酸片段。
2.有缺陷的流感病毒颗粒，其缺少编码酸性聚合酶(PA)的功能性流感病毒核酸片段。
3.根据权利要求1的有缺陷的流感病毒颗粒，其中缺少的片段编码酸性聚合酶(PA)。
4.根据权利要求1至3中的任一项的有缺陷的流感病毒颗粒，其具有编码病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。
5.根据权利要求1至4中的任一项的有缺陷的流感病毒颗粒，其具有编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。
6.根据权利要求1至5中的任一项的有缺陷的流感病毒颗粒，其具有源自WHO推荐的用于疫苗目的的流感病毒的流感病毒核酸片段。
7.根据权利要求1至5中的任一项的有缺陷的流感病毒颗粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。
8.根据权利要求1至7中的任一项的有缺陷的流感病毒颗粒，其含有不编码流感肽的核酸。
9.细胞，其含有根据权利要求1至8中的任一项的有缺陷的流感病毒颗粒。
10.根据权利要求9的细胞，其含有流感病毒酸性聚合酶(PA)。
11.组合物，其包含根据权利要求1至8中的任一项的有缺陷的流感病毒颗粒或根据权利要求9或10的细胞或源自所述细胞的物质。
12.根据权利要求11的组合物在生产旨在生成使对象免受流感病毒感染的免疫保护的药物组合物中的应用。
13.产生使对象免受流感病毒感染的免疫保护的方法，包括给有此需要的对象提供根据权利要求11的组合物。
14.根据权利要求8的有缺陷的流感病毒颗粒在生产旨在将不编码流感肽的核酸输送给细胞的组合物中的应用。
15.根据权利要求8的有缺陷的流感病毒颗粒在生产旨在将不编码流感肽的核酸输送给对象的细胞的药物组合物中的应用。
16.将不编码流感肽的核酸输送给细胞的方法，包括为所述细胞提供根据权利要求8的有缺陷的流感病毒颗粒。
17.将不编码流感肽的核酸输送给对象的方法，包括为所述对象提供根据权利要求8的有缺陷的流感病毒颗粒。
全文摘要
本发明涉及流感病毒和针对流感的疫苗接种领域。本发明提供了条件性缺陷的流感病毒颗粒，其具有7个不同的流感核酸片段。本发明还提供了条件性缺陷的流感病毒颗粒，其缺少选自基本编码酸性聚合酶(PA)、碱性聚合酶1(PB1)和碱性聚合酶2(PB2)的片段的流感核酸片段。更具体地，本发明提供了有缺陷的流感病毒颗粒，其具有7个不同的流感核酸片段，且缺少基本编码酸性聚合酶的流感核酸片段。另外，本发明提供了包含根据本发明的有缺陷的流感病毒颗粒的组合物在生产旨在生成使对象免受流感病毒感染的免疫保护的药物组合物中的应用，并提供了产生使对象免受流感病毒感染的免疫保护的方法，包括给需要的对象提供包含这样的有缺陷的流感病毒颗粒的组合物。
文档编号A61K48/00GK101056976SQ200580038694
公开日2007年10月17日 申请日期2005年11月8日 优先权日2004年11月11日
发明者E·德维特, M·I·J·斯普隆肯, R·A·M·福切尔, A·D·M·E·奥斯特霍斯 申请人:索尔瓦药物有限公司, 伊拉斯谟大学鹿特丹医药中心