专利名称：靶向pdcd5抗流感病毒寡核苷酸的结构和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向程序细胞死亡因子5 (PD⑶5， Programmed cell death protein 5)夕台？(IV, influenza virus)胃|白勺H胃 核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。
背景技术：
流感病毒感染可引起急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。甲 型流感威胁最大，且易发生变异，易引起暴发流行。1918年至1920年，著名的"西班牙流 感〃在全球范围内造成了 2000万-4000万人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2)所致 的〃亚洲流感"、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的"香港流感"、1977年由甲型流感 病毒(H1N1)所致的"俄罗斯流感"、1997年以来出现的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)，以及2009年出现的甲型流感病毒(H1N1)感染，都严重威胁了人们健康 和正常生活。流感作为急性呼吸道传染病严重威胁着人们的健康，对于儿童、老年人、其它 慢性病患者等高危人群尤其严重，而且也已成为社会劳动力损失、医疗负担加重乃至社会 不安定的主要原因之一。由于流感病毒变异，常规疫苗不能有效预防流感的发生和流行。过去用于治疗流 感的两种较低廉的抗病毒药物三环癸胺(amantadine)和金刚乙胺(remantadine)对人体 内流感病毒几乎不起作用，且耐药较为普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂(例如达菲和 帕纳米韦)虽效果较好，但随着临床广泛应用，耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺 乏可靠的方法对流感的发生和流行进行有效的控制，有效的预防和控制流感病毒方法的已 成当务之急。因此研究特异性高、毒副作用小的新型抗流感病毒药物对治疗与预防具有重 要现实意义。病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系 统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会 主动地通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必 需的细胞机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病 毒信号或者阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生 的频率。PD⑶5是我国科学家发现的一种凋亡效应分子。PD⑶5表达广泛，进化保守，具有 促进凋亡和促进Parapotosis的效应，其编码区全长559bp，编码的PDCD5蛋白由125个氨 基酸组成，具有促进多种肿瘤细胞凋亡和抑制增殖的效应。流感病毒感染引起细胞病变凋 亡，因此，抑制PD⑶5可能保护细胞免受病毒伤害。核酸药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特 别是近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。目前几 乎所有大的国际制药公司均投入巨资进行核酸药物的研发，如诺华和辉瑞公司分别与ISIS 和Eyetech公司共同开发的核酸药物Vitravene和Macugen已批准上市，另有几十个正在进行临床研究。反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15 30个核苷酸。 通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其 理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡 核苷酸作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些 著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗流感病毒药物设计的宿主靶标PD⑶5，以及一种靶 向PDCD5阻断流感病毒复制、抑制流感病毒致病的寡核苷酸序列、结构及其药物。本发明的主要内容是利用亚细胞蛋白质组学方法筛选到小分子蛋白PDCD5，根据 已公开的PDCD5基因mRNA序列(NM_004708. 2)，对其进行RNA 二级结构的计算机模拟，设计 了 5条针对PDCD5的反义寡核苷酸，初步筛选结果显示PDCD5-5抑制病毒所致细胞病变作 用最佳，PDCD5-1和-2次之。进而进行了长度优化，针对PDCD5总共设计了 29条反义寡核 苷酸。筛选结果显示14个碱基以上的序列绝大部分具有抗流感活性，其中序列PDCD5-1、 PDCD5-2、PDCD5-5、21L、19A、18B、16A在各个长度的序列中抗流感活性较高，综合考虑其中 PD⑶5-5抑制病毒所致细胞病变作用最佳。在A549细胞及MDCK细胞中以PD⑶5_5为代表 进一步评价了金刚乙胺修饰及与金刚乙胺联合用药抑制流感病毒致细胞病变效果。结果表 明修饰后PDCD5-5对病毒致细胞病变的抑制效果明显提高，对流感病毒Hmi所致细胞病 变抑制率提高了 10%左右，对金刚乙胺耐药H3N2型流感病毒引起的细胞病变的IC50降低 了 30%左右。表1反义寡核苷酸的分子设计 总之，根据本发明，与人PDCD5基因的mRNA互补结合的寡核苷酸均能有效的抑制 流感病毒和保护细胞使其免于流感病毒所致细胞病变，是一种特异性高、毒副作用小的新 型抗流感病毒的潜在药物。根据本发明，针对PDCD5 mRNA的反义寡核苷酸能特异性抑制流感病毒的致细胞病 变和复制，有可能成为治疗及预防流感相关疾病的新型生物工程药物。根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用 特异性等因素相关，PDCD5-5的长度根据实验确定，本发明包含了与PDCD5-5具有60%及其 以上连续相同序列的任何长度寡核苷酸。根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本 发明包含了 PD⑶5-5硫代修饰、甲基修饰或金刚乙胺修饰。根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药 的制剂。根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组 合物形式包括联合其他反义寡核苷酸及其衍生物形式，还可以含有治疗上可以接受的载体 材料，如脂质体、融合肽或病毒载体等。根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动 力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。本发明的实施对严重危害人类健康的流感病毒感染的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
图1硫代PDCD5反义寡核苷酸序列抑制Hmi型病毒所致细胞病变图2 PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5剂量依赖抑制Hmi型流感病毒致细胞病变作用图3 PD⑶5-5剂量依赖性地抑制H3N2型流感病毒引起的细胞病变图4 22个碱基长度的PD⑶5-5剂量依赖性地抑制Hmi型流感病毒所致细胞病变图5 18个碱基长度的PD⑶5-5剂量依赖性地抑制Hmi型流感病毒所致细胞病变图6 16个碱基长度的PD⑶5-5剂量依赖性地抑制Hmi型流感病毒所致细胞病变图7 14个碱基长度的PD⑶5-5剂量依赖性地抑制Hmi型流感病毒所致细胞病变图8对Hmi型流感病毒所致细胞病变抑制率较高的不同长度PDCD5-5序列效果 的验证图9 PD⑶5-5抑制Hmi型流感病毒序列长度的再优化图10金刚乙胺与PD⑶5-5的偶联过程示意11金刚乙胺修饰后的PD⑶5-5剂量依赖地抑制Hmi型流感病毒所致细胞病变图12金刚乙胺修饰后的PD⑶5-5剂量依赖地抑制金刚乙胺耐药H3N2型流感病毒 所致细胞病变
具体实施例方式实施例一本实施例主要说明靶向人PDCD5基因抗流感病毒反义寡核苷酸的设计、合成和筛 选。材料与方法1.反义寡核苷酸PD⑶5-5的设计和合成检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的PD⑶5 mRNA参考序列 NM_004708. 2，对其进行RNA 二级结构的计算机模拟，选择了 5个不稳定的茎环结构作为反 义寡核苷酸的作用靶点。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很 好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达(见表1)。所有寡核苷酸均采用8909型自 动DNA合成仪合成全硫代修饰的反义寡核苷酸。合成完毕浓氨水55°C切割并脱保护15小 时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo Prep 0P120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干 燥，-20°C保存备用。2. A549细胞、病毒和对照药物病毒在10日龄SPF鸡胚传代，收集尿囊液，测定其血凝(Hemagglutination，HA) 效价，取HA价>1 26者，混勻、分装、保存于-70°C备用。使用的病毒毒株为A/京防 /86-1 (HlNl)、A/ 鲁防 /9/93 (H3N2)。A549 细胞培养液为含 10%胎牛血清(Gibco)的 1640 培养液，病毒感染和细胞病变测定时使用含胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的维持液。阳 性对照药物为金刚乙胺。
3.反义寡核苷酸的筛选A549细胞在含10%胎牛血清(Gibco)的1640培养基中，于37°C、5% C02培养箱中 培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以8000 10000个细胞/孔将细胞接 种至96孔细胞培养板中，次日60 80%长满。用含胎牛血清的1640稀释PD⑶5-1 5至ii M。用PBS (pH7. 5)冲洗细胞一次，将PDCD5-1 5以100 yl/孔的量加入各孔。同 时设立盐酸金刚乙胺阳性对照药物组、病毒感染阳性对照组和A549细胞阴性对照组，作用 60min。用 PBS (pH7. 5)冲洗细胞一次，每孔加入 100TCID50/0. lml 的 A/ 京防 /86-1 (H1N1) 病毒稀释液50 u 1，37°C感染作用60min，用PBS (pH7. 5)冲洗细胞，将PDCD5-1 5及阳性对 照药物盐酸金刚乙胺以lOOiU/孔的量加入各孔。37°C培养2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution试剂盒(Promega产品)测定细胞病变程度(以0D490表示)，并以如下公式 计算药物的病毒抑制率[(0D试验-0D病毒)/ (0D细胞-0D病毒)]X 100。重复试验二次， 计算平均值以筛选出最佳的反义寡核苷酸以进一步评价。4. PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5抑制流感病毒致细胞病变剂量依赖作用参照实施例一将A549细胞铺板96孔细胞培养板，次日60 80%长满。用含1 % FBS 的 1640 稀释 PDCD5-l、PDCD5-2、PDCD5-5 至 0. 25,0. 5,1. 0、2. Oy M。以 PBS(pH7. 5)冲 洗细胞一次，将PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5以100 yl/孔的量加入各孔。同时设立盐酸 金刚乙胺阳性对照药物组、病毒感染阳性对照组和A549细胞阴性对照组，作用60min。用 PBS(pH7. 5)冲洗细胞一次，每孔加入100TCID50/0. lml的A/京防/86-1 (Hmi)病毒稀释 液 50iil，37°C 感染作用 60min，用 PBS(pH7. 5)冲洗细胞，将 PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5 及 阳性对照药物盐酸金刚乙胺以100 ill/孔的量加入各孔。37°C培养2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution试剂盒(Promega产品)测定细胞病变程度(以0D490表示)，计算 药物的细胞病变抑制率和IC5Q。5. PDCD5-5抑制H3N2型流感病毒(A/鲁防/9/93 (H3N2))致细胞病变剂量依赖作 用参照实施例一将A549细胞铺板96孔细胞培养板，次日60 80%长满。用 含 1 % FBS 的 1640 稀释 PDCD5-5 至 0. 25,0. 5,1. 0、2. OyM。以 PBS(pH7. 5)冲洗细胞一 次，以100 yl/孔的量加入不同浓度的PD⑶5-5，同时设立阳性药物对照组、病毒感染阳 性对照组和A549细胞阴性对照组，作用60min。用PBS(pH7. 5)冲洗细胞一次，每孔加入 100TCID50/0. lml的H3N2型病毒稀释液50iU，37°C感染作用60min。再以PBS(pH7. 5)冲洗 细胞一次，每孔加入100 u 1不同浓度的PDCD5-5。37°C培养2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution试剂盒(Promega产品)测定细胞病变程度(以0D49(1表示)，计算药物的细 胞病变抑制率和IC5(1。结果从所设计的5条反义寡核苷酸中进行初步筛选，以选出效果最佳的反义寡核苷 酸，以便于进一步的评价。结果显示在浓度为2 y M时以PDCD5-2抑制病毒所致细胞病变 作用最佳，平均抑制率为94. 299%, PDCD5-1和-5次之，平均抑制率为88. 23%和89. 13% (见图1)。1. PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5抑制Hmi型流感病毒致细胞病变作用的剂量依赖
作用
7
不同浓度PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5抑制Hmi型流感病毒致细胞病变抑制率见图2。三种反义序列能较好地抑制Hmi型流感病毒致细胞病变，三种反义核酸 PDCD5-l、PDCD5-2和PDCD5-5抑制流感病毒致细胞病变作用，IC5tl分别为0. 34μΜ、0. 79 μ M 和 0. 25 μ Μ。三种反义序列均能较好地抑制Hmi型流感病毒致细胞病变，PD⑶5-1在高浓度对 HlNl型流感病毒致细胞病变抑制率较高，PDCD5-2，在低浓度对Hmi型流感病毒致细胞病 变抑制率最低，PDCD5-5对Hmi型流感病毒致细胞病变抑制IC5tl最低。选择PDCD5-5进行 下步实验。2. PD⑶5-5抑制Η3Ν2型流感病毒致细胞病变剂量依赖作用各个剂量PDCD5-5对Η3Ν2型流感病毒引起的细胞病变抑制率见图3，由试验结果 可知PD⑶5-5抑制Η3Ν2型流感病毒致细胞病变存在剂量依赖作用，IC5tl约为0. 16 μ Μ,阳性 药盐酸金刚乙胺对Η3Ν2型流感病毒引起的细胞病变抑制的IC5tl约为0. 16 μ M0由结果可 推测PDCD5-5对甲型流感病毒的抑制存在普遍性。结论PDCD5可以作为抗甲型流感病毒宿主靶标，靶向PDCD5的反义寡核苷酸药物具有 体外抗甲型流感病毒引起的细胞病变和抑制流感病毒的复制作用。实施例二 本实施例主要说明不同长度反义寡核苷酸PDCD5-5抗流感病毒效果。1.PDCD5-5序列长度的优化一参考人PD⑶5基因的mRNA序列，将PD⑶5_5序列进行两端增加或减少碱基，使序 列为22、18、16、14个碱基。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有 很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。参照实施例一进行寡核苷酸合成、硫代 修饰、纯化、干燥和存储。参照实施例一将A549细胞铺板96孔细胞培养板，次日60 80%长满。用含1 % FBS 的 1640 稀释 PDCD5-5 至 0. 25、0. 5、1.0、2. ΟμΜ。以 PBS(pH7. 5)冲洗细胞一次，加入不 同浓度的22、20、18、16、14个碱基长度的PD⑶5_5。同时设立盐酸金刚乙胺阳性对照药物 组、病毒感染阳性对照组和A549细胞阴性对照组。加入100TCID50/0. Iml的病毒稀释液 50μ 1，37°C感染作用60min。再用PBS(pH7. 5)冲洗细胞，加入不同浓度的22、20、18、16、14 个碱基长度的 PDCD5-5。37°C培养 2d。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 试剂盒 (Promega产品)测定细胞病变程度(以OD49tl表示)，计算药物的细胞病变抑制率和IC5。。2.PDCD5-5序列长度的优化二参考人PDCD5基因的mRNA序列，将实施例二步骤1筛选出的序列进行两端增加或 减少碱基。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性， 不会干扰人类其它正常基因的表达。所有寡核苷酸均参照实施例一进行寡核苷酸合成、硫 代修饰、纯化、干燥和存储。参照实施例一将A549细胞铺板96孔细胞培养板，次日60 80%长满。用含1 % FBS 的 1640 稀释 PDCD5-5 至 0. 25、0. 5、1.0、2. ΟμΜ。以 PBS(pH7. 5)冲洗细胞一次，加入不 同浓度的23、22、21、20、19、18个碱基长度的PD⑶5_5。同时设立盐酸金刚乙胺阳性对照药物组、病毒感染阳性对照组和A549细胞阴性对照组。加入100TCID50/0. Iml的病毒稀释液 50μ 1，37°C感染作用60min。再用PBS(pH7. 5)冲洗细胞，加入不同浓度的22、20、18、16、14 个碱基长度的 PDCD5-5。37°C培养 2d。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 试剂盒 (Promega产品)测定细胞病变程度(以OD49tl表示)，计算药物的细胞病变抑制率和IC5。。结果 1.PDCD5-5序列长度的优化一不同碱基长度的PDCD5-5序列对细胞病变剂量依赖抑制效果如图4、图5、图6、图 7，其中22々、228、22(、？00)5-5、188和16A均表现出较好的抑制流感病毒致细胞病变作用和 剂量依赖性，IC5tl 分别为3. 873μΜ、0· 442μΜ、3· 903μΜ、0· 507μΜ、0· 838 μ M和 0. 573 μ Μ。 选出这6个序列，再次合成重复试验，对细胞病变的抑制率如图8，22A、22B、22C、PD⑶5_5、 18B和16A抑制流感病毒致细胞病变均表现出较好的剂量依赖作用，IC5tl分别为0. 884 μ Μ、 0. 879 μ Μ、0· 958 μ Μ、0· 864 μ Μ、3· 245 μ M 和 0· 882 μ Μ。2.PDCD5-5序列长度的优化二长度再次优化的PDCD5-5序列抑制Hmi型流感病毒所致细胞病变效果如图 9，PDCD5-5、18B、19A、19B、21L、21R、22A、23L、和23R均表现出较好的抑制流感病毒致细 胞病变作用和剂量依赖性，IC50分别为0. 271 μ Μ、1. 212 μ Μ、0· 454,0. 715,0. 302 μ Μ、 0. 295 μ Μ、0· 413 μ Μ、0· 537 μ M和0· 831 μ Μ。确定PDCD5-5为抑制流感病毒致细胞病变效 果和长度最佳序列。结论考虑合成及抑制效果确定PD⑶5-5为最佳抗流感序列。实施例三本实施例主要说明经过金刚乙胺修饰的PD⑶5-5在体外Α549细胞水平抑制Hmi 致细胞病变活性的研究。材料与方法1.金刚乙胺与PD⑶5-5的偶联盐酸金刚乙胺去盐酸后暴露氨基，与6-马来酰亚胺己酸N琥珀酰亚胺酯进行亲核 取代反应，取代琥珀酰亚胺酯，形成新的化合物。与5 ‘进行巯基修饰的反义寡核苷酸重新 反应，最终形成目标金刚乙胺-反义寡核苷酸偶联化合物，偶联过程如图10。使用优化合成 路线及各步反应条件进行合成，合成高纯度的金刚乙胺与PDCD5-5的偶联的PDCD5-5的金 刚乙胺修饰序列(PJG)并借助各类分析手段确保得到的偶联化合物纯度好、结构正确。2. Α549细胞、MDCK细胞、病毒和对照药物参照实施例一病毒在10日龄SPF鸡胚传代，收集尿囊液，测定其血凝 (Hemagglutination，HA)效价，取HA价> 1 26者，混勻、分装、保存于-70°C备用。使用 的病毒毒株为A/京防/86-1 (HlNl)、金刚乙胺耐药毒株H3N2。A549细胞培养液为含10% 胎牛血清(Gibco)的1640培养液；MDCK细胞培养液为含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培 养液，病毒感染和细胞病变测定时使用含胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的维持液。阳性 对照药物为金刚乙胺。3.偶联金刚乙胺后的PD⑶5-5抑制Hmi型流感病毒复制的剂量依赖作用参照实施例一将A549细胞铺板96孔细胞培养板，次日60 80%长满。用含1 %FBS 的 1640 培养基稀释 PDCD5-5 及 PJG 至 0. 125,0. 25,0. 5,1. 0,2. OyM0 以 PBS (pH7. 5) 冲洗一次，加入100TCID50/0. Iml的H3N2型病毒稀释液50 μ 1，37°C感染作用60min。再 以PBS(pH7. 5)冲洗一次，分别加入不同浓度的PJG和同浓度PD⑶5-5与金刚乙胺联合用药 (PD⑶5-5+JG)，同时设立盐酸金刚乙胺阳性药对照、病毒感染阳性对照和A549细胞阴性对 照。37°C培养 2d。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 试剂盒(Promega 产品)测定 细胞病变程度(以OD49tl表示)，计算药物的细胞病变抑制率和IC5Q。4.偶联金刚乙胺后PD⑶5-5抑制金刚乙胺耐药毒株H3N2型流感病毒复制的剂量 依赖作用参照实施例一将MDCK细胞铺板96孔细胞培养板，次日60 80%长满。用含1 % FBS 的DMEM 培养基稀释 PDCD5-5 及 PJG 至 0. 125、0. 25、0. 5、1. 0、2. 0 μ M。以 PBS(pH7. 5) 冲洗一次，加入100TCID50/0. Iml的H3N2型病毒稀释液50 μ 1，37°C感染作用60min。再以 PBS(pH7. 5)冲洗一次，分别加入不同浓度的PJG，同时设立盐酸金刚乙胺对照、病毒感染阳 性对照和MDCK细胞阴性对照。37°C培养2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution试 剂盒(Promega产品)测定细胞病变程度(以OD49tl表示)，计算药物的细胞病变抑制率和 IC500结果1.合成成出高纯度的PJG，经分析纯度在95%以上。2. PJG抑制Hmi型流感病毒致细胞病变检测结果得出，PD⑶5_5组抑制Hmi型流 感病毒致细胞病变IC5tl为0. 451 μ Μ,盐酸金刚乙胺阳性药对照组抑制Hmi型流感病毒致 细胞病变IC5tl为1. 265 μ Μ, PJG组抑制Hmi型流感病毒致细胞病变IC5tl为0. 235 μ Μ，如图 11所示，PD⑶5-5+JG组抑制Hmi型流感病毒致细胞病变IC5tl为0. 097 μ Μ,与未修饰相比， 金刚乙胺修饰后PDCD5-5对流感病毒引起的细胞病变的抑制率提高了 10%左右，与金刚乙 胺联合用药结果显示联合用药对Hmi型流感病毒致细胞病变抑制作用几乎是两种药单 独效果的叠加。3. PJG抑制金刚乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒致细胞病变检测结果得出，PD⑶5_5组 抑制金刚乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒所致细胞病变IC50为0. 294 μ Μ,盐酸金刚乙胺对金刚 乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒所致细胞病变几乎没有抑制作用，PJG组抑制金刚乙胺耐药Η3Ν2 型流感病毒所致细胞病变IC50为0. 215 μ Μ，如图12所示，与未修饰相比，金刚乙胺修饰后 PD⑶5-5对金刚乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒引起的细胞病变的IC50降低了 30%左右。结论通过偶联金刚乙胺PD⑶5-5对流感病毒Hmi所致细胞病变抑制率提高了 10%左 右，对金刚乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒引起的细胞病变的IC50降低了 30%左右。
权利要求
与PDCD5mRNA互补的寡核苷酸，分布在5’非编码区、编码区和3’非编码区，其长度是10-30个碱基。
2.根据权利要求1所述寡核苷酸，其特征是所述的选自序列表1 29所示反义寡核苷 酸序列结构。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构选自下列 之一Dgcttccctgtgctttgcttc ；2)tccctgtgctttgcttcctg；3)ccctgtgctttgcttcctgt；4)ccctgtgctttgcttcctgtt5)ccctgtgctttgcttcctg；6)ccctgtgctttgcttcct；7)ccctgtgctttgcttc。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构选自下列 之一1)ccctgtgctttgcttcctgt；2)gcttccctgtgctttgcttc。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构为以下序 列ccctgtgctttgcttcctgt。
6.根据权利要求5所述的寡核苷酸，其特征为所述的反义寡核苷酸包含了与 ccctgtgctttgcttcctgt具有60%及其以上连续相同序列的任何长度寡核苷酸。
7.根据权利要求1所述寡核苷酸，其特征是该反义寡核苷酸经过不同化学修饰。
8.根据权利要求7所述寡核苷酸，其化学修饰为硫代修饰、甲基修饰或金刚乙胺修饰。
9.根据权利要求1所述寡核苷酸，其特征为活性成分选自权利要求1-8所述任一寡核 苷酸或其组合。
10.权利要求1-9中所述的任一寡核苷酸或其组合在制备治疗和预防流感病毒感染的 药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是发现程序死亡蛋白5(PDCD5)可以作为抗病毒的宿主靶标，靶向PDCD5抗流感病毒病毒(IV)反义寡核苷酸的结构和用途。本实验室通过筛选和验证发现病毒感染相互作用宿主蛋白PDCD5，于是设计合成了靶向PDCD5的反义寡核苷酸。在病毒感染的A549细胞上对27条反义寡核苷酸序列进行了活性筛选及评价，首次发现互补于PDCD5 mRNA特定功能区域的寡核苷酸PDCD5-5在培养的A549细胞中能有效地抑制IV的复制和H1N1、H3N2型IV所致的细胞病变，具有很好的特异性和可药性。因此，本发明涉及到靶向PDCD5 mRNA抗IV感染的反义寡核昔酸的序列与结构及其成为治疗IV病毒相关性疾病，减小IV相关性疾病危害性的新型药物。
文档编号A61K48/00GK101864421SQ20101017917
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者丁晓然, 伯晓晨, 周喆, 杨静, 林汝仙, 王升启, 赵海豹, 钟芝茵 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所