专利名称：人甲、乙型流感及新甲型h1n1流感病毒一管多检方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体是人甲型流感、乙型流感及新甲型 HlNl流感病毒一管多检方法及试剂盒。
背景技术：
人流感病毒是一种造成人类患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属 于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有 周期性的大流行。人流感病毒以其核蛋白的抗原性分为A型、B型和C型流感病毒(又称甲、乙和丙 型流感病毒)。在感染人类的三种流感病毒中，甲型流感病毒有着极强的变异性，乙型次之， 而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。所以造成大规模流行的一般都为前两种。流行性感冒病毒在免疫力较弱的老人或儿童及一些免疫失调的病人会引起较严 重的症状，如肺炎或是心肺衰竭等。从流行病学的角度来说，流感引起世界性大流行是流感 病毒抗原变异与人群免疫屏障相互作用的结果。20世纪全球共出现四次流感大流行，都是 由变异的甲型流感病毒引起，造成重大的人员和财产损失。2009年最先由墨西哥发现的新 甲型Hmi流感病毒就含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段，在全球迅速 传播开来，造成大规模的流行。目前全世界各国为防控新甲流H1N1，都在做积极的努力，同 时取得了显著的效果。鉴于甲乙型流感病毒及目前甲型流感中的新甲型Hmi流感病毒对人类所造成的 严重呼吸道疾病，特别是在儿童中，为诊治及防控需要，这就需要医疗机构提供准确快速灵 敏的检测方法，快速诊断，快速治疗。就目前情况，对甲乙型及新甲型Hmi流感病毒的诊断 主要以下几种方法(1)病毒的培养分离；(2)血清学检测特异IgG及IgM ； (3) RT-PCR方法 及荧光定量PCR方法。相比较几种方法，前两种方法都是早期开发的经典方法，PCR方法是 针对病原体核酸的检测方法，克服了前面两种方法中存在的周期长、灵敏度不高的问题，特 别是荧光定量PCR方法的引进，解决了 PCR方法容易产生假阳性的问题，使其得到了快速的 发展，该方法具有高特异性、高灵敏度、周期短、操作简单、成本较低等多种优点。但目前开发的流感病毒分型试剂基本都为单重荧光定量PCR检测试剂，不能对这 三种流感病毒进行同时检测；如要同时检测，则需要分别在三管中进行，其操作繁琐、费时 耗力。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种人甲型流感、乙型流感及 新甲型Hmi流感病毒一管多重荧光PCR检测方法，以改进目前现有方法，从而使检测达到 灵敏、快速、准确、节约材料和试剂的目的。本发明的人甲型流感、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多重荧光PCR检测方法包括样品核酸的制备和多重PCR扩增步骤，其中，多重PCR扩增步骤中采用了序列如下所 示的引物(见序列表SEQ ID NO 1-6)IFAF GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC ；IFAR TCTTCAAGTCTCTGCGCGATT ；
IFBF CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG ；IFBR GCTTATGGGAAGCACCACTTTG ；AHlF GGTTTGAGATATTCCCCAAGACA ；AHlR :GAGGACATGCTGCCGTTACA。其中，引物IFAF和IFAR用来检测人甲型流感病毒，我们称之为InfA组引物；引物 IFBF和IFBR用来检测乙型流感病毒，本发明中称之为InfB组引物；引物AHlF和AHlR用 来检测新甲型Hmi流感病毒，我们称之为A(HlNl)组引物。上述方法中，还采用了序列如下所示的探针(见序列表SEQ ID NO :7_10)IFAP CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG ；IFBP CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA ；AHlP :TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA。优选的，采用Taqman探针检测的荧光定量PCR的反应模式，上述探针的荧光标记 具体如下IFA-TAMRA :TAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2 ；IFB-FAM FAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1 ；AHl-JOE J0E-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1。其中，IFA-TAMRA是用来检测甲型流感病毒的探针，IFB-FAM是用来检测乙型流感 病毒的探针，AHl-JOE是用来检测新甲型Hmi流感病毒的探针。上述三种荧光标记的探针 在本发明中被称之为FAM/J0E/TAMRA多重荧光素标记探针。本发明采用一管多重方式检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感 病毒时，将上述InfA、InfB和A(HlNl)三组引物和三条Taqman探针混合在一个反应管中， 使用 ‘PrimeScript—步法RT-PCR试剂盒(Ver. 2)，(TAKARAiPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2')的RT-PCR缓冲液进行试剂配制，其中引物使用量为7-15pmol，探针使用量为 0. 5-5pmoL·反应总体积为25 μ 1 ；配制试剂体积18 μ 1/反应(预留2 μ 1用于添加酶混合 物；预留5 μ 1用于模板)，该方法的反应条件为50°C 30分钟，94°C 2分钟，热循环为94°C 10 秒，55°C 35秒，共40个循环。需要说明的是，本发明所说的一管多重方式包括在同一反应 管内同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感病毒中的任意两种病毒或 三种病毒。本发明的目的之二是提供了用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi 流感病毒的引物和探针。引物序列选自与如下序列中的至少一种相同、相似或互补的序列 (见序列表 SEQ ID NO 1-6)IFAF GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC ；IFAR TCTTCAAGTCTCTGCGCGATT ；IFBF CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG ；IFBR GCTTATGGGAAGCACCACTTTG ；
AHlF GGTTTGAGATATTCCCCAAGACA ；AHlR :GAGGACATGCTGCCGTTACA。本发明所提供的用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感病毒 的探针是能与用上述引物扩增得到的核酸序列杂交的序列。优选的，所述探针选自与如序列SEQ ID NO :7_10中的至少一种相同、相似或互补 的序列。所述相似序列是指与上述序列存在个别不同的碱基，比如1-5个碱基，只要不影响 扩增效果；不同的碱基表现可以为在原有序列基础上插入、缺失、替换等方式。本发明还提供了一种人甲型流感，乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多重荧 光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含序列如SEQ ID NO :1_6所示的引物。该试剂盒还包含如下的荧光标记探针RSV-FAM :FAM-TATGAATGCCTATGGTGCAGGGCAAG_BHQ ；ADV-TAMRA :TAMRA-AAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCG_BHQ2 ；HMPl-JOE JOE-AGAGATGTAGGCACCACAAC-MGB ；HMP2-J0E JOE-TGGCCAATTGCCCCAATTTTGC-BHQ1 ；HMP3-J0E JOE-CTAGCCAACTGTCCCAACTTTGCA-BHQl。与现有技术相比，本方法采用自身设计的InfA/InfB/A (HlNl)特异引物及Taqman 探针，使用FAM/J0E/TAMRA多重荧光素标记，实现对infA、infB、A(HlNl)(简称为M-ABH1) 的多重检测，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等多种优点，可作为 人甲型流感，乙型流感及新甲型Hmi流感病毒检测的试剂，用于科研及临床应用。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1 引物、探针的特异性实验运用生物信息学和设计引物探针的生物软件对甲、乙型流感病毒及新甲型Hmi 流感病毒序列资料，分别对甲、乙型流感病毒的保守区进行引物探针设计，对新甲型Hmi 流感病毒的Hl基因的保守区进行引物探针设计，其中探针分别采用TAMRA、FAM、JOE标记。 详细序列见表1所示，表1为人甲型流感、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒引物及探针序 列。表 1InfAIFAFGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCIFARTCTTCAAGTCTCTGCGCGATT[FA-TAMRATAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2InfBIFBFCCCTGCTTGCTCGTAGTATGGIFBRGCTTATGGGAAGCACCACTTTGIFB-FAMFAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1A(HlNl)AHlFGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAHlRGAGGACATGCTGCCGTTACAAHl-JOEJOE-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1为验证所设计的引物和探针的特异性，首先设计单重荧光PCR反应，对引物和探 针进行评估，即分别检测InfA、InfB和A(HlNl)三组引物及相应探针单独反应的特异性。 实验采用培养分离的阳性株进行，阳性株来源于广州呼吸疾病研究所、呼吸疾病国家重点 实验，分别选择流感A、流感B，另外用副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、 腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、0C43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体 CP作为阴性对照。实验分别取100μ 1培养物标本，通过常规RNA/DNA提取方法提取，得 到50 μ 1核酸产物，使用DEPC水对核酸提取产物100倍稀释后作为模板(其中H5W不进 行稀释，冠状病毒及偏肺病毒产物稀释10倍)。使用‘PrimeScript —步法RT-PCR试剂盒 (Ver. 2) ’ (TAKARA iPrimeScript One Step RT-PCR KitVer. 2')中的 RT-PCR 缓冲液进行 试剂配制，其中引物使用量为7-15pmol，探针使用量为0. 5-5pmol。反应总体积为25 μ 1 ； 配制试剂体积18 μ 1/反应(预留2 μ 1用于添加酶混合物；预留5 μ 1用于添加模板)，在 八排管中分别加入18 μ L流感Α、流感B、新甲流Hmi的单重反应液，最后放置于荧光定量 PCR仪中反应，反应条件如下50°C 30分钟，94°C 2分钟，热循环为94°C 10秒，55°C 35秒， 共40个循环，表2为单重infA、infB、A(HlNl)试剂检测80株阳性病毒株的情况，其中流 感A(H3N213株、普通HmilO株、新甲流Hmill株、H5N1灭活标本1株、H9亚型株1株)、 流感B 20株，另外有副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒 HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、0C43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体CP各2株作为阴性对 照。表2
单重试剂检测结果InfAInfBA(HlNl)阳性362011阴性446069总计808080 实验结果中，阳性结果与预期完全符合，与其他常见呼吸道病原体副流感1、副流 感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、 0C43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体CP等无交叉反应，infA-infB、A (HlNl)-infB之间亦无交 叉反应，infA-A (HlNl)在普通流感A时无交叉反应，特异性高。
实施例2 =M-ABHl多重检测试剂的特异性实验多重检测试剂使用TAKARA iPrimeScript 一步法RT-PCR试剂盒 (Ver. 2) ‘ (TAKARA iPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2')的 RT-PCR 缓冲液进行 试剂配制，其中引物的使用量为7-15pmol，探针的使用量为0. 5-5pmol。将表1中的InfA/ InfBA(HlNl)引物及各条探针配制为一管反应液(M-ABHl)。反应总体积为25 μ 1/反应， 配制试剂体积18 μ 1/反应，预留2 μ 1用于添加酶混合物；预留5 μ 1用于添加模板。分别 使用单阳性模板(普通流感A ；流感B或新甲流Hmi)；双阳性模板(普通流感A-流感B; 普通流感A-新甲流Hmi ；流感B-新甲流Hmi)；三阳性模板(普通流感A-流感B-新甲流 Η1Ν1)对多重检测试剂进行实验，同时使用单重荧光PCR试剂进行对比。实验结果见表3， 表3是各种模板情况下多重M-ABHl流感病毒检测试剂与单重检测的对比。表权利要求
人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法，包括样品核酸的制备和多重PCR扩增步骤，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中采用了序列如SEQ ID NO1 6所示的引物。
2.根据权利要求1所述的多检方法，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中还采用了序 列如SEQ ID N0:7-9所示的探针。
3.根据权利要求1所述的多检方法，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中还采用了如 下荧光标记的探针IFA-TAMRA :TAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2 ；IFB-FAM :FAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1 ；AHl-JOE JOE-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1。
4.用于人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多检的引物，其特征在于，所述引 物序列选自与如SEQ ID NO :1-6序列中的至少一种相同、相似或互补的序列。
5.用于人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多检的探针，其特征在于，所述探 针能与用权利要求4所述的引物扩增的核酸序列杂交的序列。
6.根据权利要求5所述的探针，其特征在于，所述探针选自与如SEQIDN0:7-9序列中 的至少一种相同、相似或互补的序列。
7.一种人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多检试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒包含如权利要求1所述的引物。
8.根据权利要求7所述的多检试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含如权利要求3所 述的荧光标记探针。
全文摘要
本发明提供了一种人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的一管多重荧光PCR检测方法，该方法采用了序列如SEQ ID NO1-6所示的引物，还采用了序列如SEQ ID NO7-9所示的探针。本发明还提供了一种人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述引物和探针。本发明采用InfA/InfB/A(H1N1)特异引物及Taqman探针，使用FAM/JOE/TAMRA多重荧光素标记，实现对人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的多重检测，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等优点，可作为多重检测试剂，用于科研及临床应用。
文档编号C12Q1/70GK101942525SQ20101017135
公开日2011年1月12日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者刘文宽, 周荣, 苏晓波, 高文娟 申请人:广州市华南医学病毒学研究所;广州呼吸疾病研究所