专利名称：一种表达人工修饰合成的甲型h1n1流感病毒ha-na-m1基因的重组杆状病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学领域。更具体地，本发明涉及一种新的含有人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒主 要免疫原性基因HA-NA-Ml和标记基因eGFP的重组杆状病毒株，这种重组毒株标记基因eGFP和甲型H1N1 流感病毒HA-NA-M1蛋白，并包装成流感样病毒颗粒。该病毒颗粒研制的疫苗可以预防人和猪甲型HINI流 感病毒的感染。
背景技术：
甲型H1N1流感(Influenza virus H1N1)是引起人和猪的呼吸道疾病的重要原发病原之一，常常与 其他病原混合感染造成更严重的损失。该病毒属于正粘病毒科流感病毒属，根据病毒核蛋白抗原性不同， 分为甲、乙和丙三个型(国际称其为A、 B和C三个型)。甲型流感病毒(influenza virus, IV)为有囊 膜的RNA病毒,其囊膜主要由血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)以及基质蛋白(Ml)构成。
甲型流感病毒危害巨大，不但影响畜牧业(尤其养禽业)健康发展，更重要的是可以引起人类的流感
大暴发，产生重要的公共卫生危害。人类历史上发生过3次流感大暴发，即1918年由H1N1亚型流感病毒
引起的西班牙流感、1957年由H2N2亚型流感病毒引起的香港流感和1968年由H3N2亚型流感病毒引起的
亚洲流感。其病原均由当时存在于禽类的甲型流感病毒直接突变或和人的流感病毒在猪体内重组而来，如
1918年西班牙流感病毒H1N1的HA和NA基因分别具有猪流感病毒和禽流感病毒的分子特征。2009年4月
出现甲型H1N1流感病毒是一种新型变异流感病毒。这种新的甲型流感病毒HA、NP和NS基因来源于与1918
年人流感病毒密切相关的经典猪流感病毒；NA和M来自于1979年引入的欧洲猪流感病毒；PB1来自人的
H3N2; PB2和PA来源于禽流感，该流感在1998年前后引入到猪体(Chang LY，et al. Novel Swine-origin
Influenza Virus A (H1N1): The First Pandemic of the 21st Century. J Formos Med Assoc, 2009;108(7):526-623 )。
目前甲型H1N1流感几乎从美洲蔓延至世界各地，传播途径既可以动物传人，也可以人传人。截至2009 年 7 月 6 日，目前全球已有 94512 人感染，429 人死亡 (http:〃丽.who. int/csr/don/2009 07 06/en/index. html):高效疫苗和抗病毒药物预防控制甲型H1N1 流感病毒有效措施。现阶段治疗甲型H1N1流感病毒最有效途径是抗病毒药物治疗，目前使用较多的是 oseltamivir(又称Tamiflu)和zanamivir,但是目前在丹麦、日本、美国、中国香港等国家和地区发现抗Tamiflu 耐药毒株(htt.p:〃www.who.int/csr/disease/swineflu/notes/hlnl antiviral —resistance 20090708/en/index.html)， 从而增加了该疾病带来的危险，该领域迫切需要有效的疫苗来预防控制该甲型H1N1流感病毒。迄今为止， 还没有商品化的疫苗问世，而传统的季节性流感疫苗不能有效预防该新型流感病毒。据冊O报道常规灭活 疫苗目前正在加紧研制，还没有问世 (http:〃www.who.int/csr/disease/swineflu/notes/ hlnl vaccine 20090713/en/index.html)，新型疫苗还未见报道。因此，本领域迫切需要开发出具有高效、安 全的针对甲型H1N1流感的基因工程疫苗。
发明内容
本发明的一个目的就是提供编码甲型H1N1人工修饰合成的免疫原性基因cDNA序列。 本发明的另一个目的是提供一种转移载体pFBDPHmHNMlP10eGFP，该载体含有编码具有甲型H1N1
3流感病毒免疫原性基因HA-NA-M1的cDNA序列和标记基因eGFP。
本发明的另一个目的就是提供一种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1的重组杆状病 毒，它含有人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒主要免疫原性基因HA-NA-M1以及标记基因eGFP的重组杆 状病毒株，该毒株被命名为QP-Ac-HNMl,属于杆状病毒(fecw7ow'/Y/s)，于2009年7月20送交湖北省 武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC-V200912。
申请人根据密码子的偏爱性人工合成了一种来源于甲型H1N1流感病毒编码的主要免疫原性蛋白HA、 NA和M1的核苷酸序列，如SEQ ID N0:1、 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示。
更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
本发明的有益效果是
1. 本发明根据密码子的偏爱性，人工修饰合成了甲型H1N1流感病毒HA、 NA和M1基因，提高了这些 基因在杆状病毒中表达水平。
2. 本发明所构建的杆状病毒转移载体含有绿色荧光标记基因，提高了重组杆状病毒的筛选效率，便 于监控外源蛋白的表达。
3. 本发明是将合成HA、 NA和Ml基因分别置于杆状病毒ra启动子下串连表达，表达的蛋白在昆虫细 胞中形成流感样病毒颗粒(VLP)。
4. 本发明的重组杆状病毒所表达包装形成的流感样病毒颗粒(VLP)可以剌激小鼠诱导产生免疫反应。
序列表SEQ IDN0:1是本发明人工合成的HA基因核苷酸序列； 序列表SEQ ID N0:2是本发明人工合成的NA基因核苷酸序列； 序列表SEQ ID NO:3是本发明人工合成的Ml基因核苷酸序列； 图1:显示了表达绿荧光蛋白基因的杆状病毒载体pFBD-gpA-P10eGFP物理图谱；
图2:显示表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因杆状病毒载体 pFBDPHraHNMlPlOeGFP的物理图谱；
图3:是杆状病毒载体pFBDPHmHNMlP10eGFP的酶切鉴定的电泳图谱； 图4:是在荧光显微镜下(4A)和光镜下(4B)重组杆状病毒感染sf9细胞结果的图片。
具体实施例方式
实施例1:—种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因重组杆状病毒QP-Ac-HNMl的 构建。
1、 甲型HINI流感病毒主要免疫原性基因的合成。
参照甲型H1N1流感病毒A/California/04/2009(H1N1)毒株的HA、 NA和Ml基因序列，根据密码子的 偏爱性人工合成HA、 NA和M1基因的序列，其中NA和M基因合成到一起，同时在NA基因N端加上杆状病 毒多角 基因的启动子(PH)，在其C端引SV40病毒的poly (A)序列'在Ml基因的N端加入启动子HI。
2、 杆状病毒转移载体pFBDPHmHNMlP10eGFP的构建。
根据Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (试齐U盒)中杆状病毒载体 pFastBacDual骨架，加将鸡的globin的polyA插入到Stul和Sail之间，将绿荧光蛋白基因eGFP插入到 P10下游的Ncol和Kpnl之间，获得改造的杆状病毒载体pFBD-gpA-P10eGFP，在该载体的基础上，用Sa^I 和￡boRI分别酶切mHA基因和载体pFBD-gpA-P10eGFP，回收mHA基因和载体pFBD-gpA-PlOeGFP,用T4 DNA 连接酶连接过夜，转化DH5ct感受态细胞'涂布含有氨苄青霉素抗性平皿'37。C培养16小时'提取重组质粒进行酶切鉴定后获得载体pFBDPHmHAgpA-P10eGFP;再用Xhol和HindIII分别酶切mNA-mMl基因和 pFBDPHmHAgpA-P10eGFP,回收mNA-Mml基因和载体pFBDPHmHAgpA-PlOeGFP,然后连接，提取重组质粒，酶 切鉴定，获得最终杆状病毒转移载体pFBDPHmHNMlPlOeGFP。 3、重组病毒杆状病毒QP-Ac-HNM1的构建。
(1) 重组穿梭载体(Bacmid)的构建
取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHmHNMlPlOeGFP和pFBD-gpA-P10eGFP 2yL与100 DHlOBac大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，于42°C 45s水浴进行热激，然后冰浴2rain,加入900 uLLB液体培养基(氯化钠浓度为10%)， 37°C振摇培养4h,按10_1、 10—2、 10—3稀释后，各取100yL涂 布于三抗高盐LB平板(卡那霉素、庆大霉素和四环素，使用浓度按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (试剂盒)操作说明书)，37°C培养24-48h,通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落。
(2) 重组穿梭载体(Bacmid)的提取
无菌挑取含重组Bacmid的阳性菌落于高盐LB液体培养基中，培养至细菌对数生长期时，收集菌体用 0.3mL溶液I (50mmol/L葡萄糖，lOmraol/L EDTA, 25mmol/L Tris-CI (pH8. 0))重悬，加入0. 3mL溶液 II (0. 2raol/L NaOH, 1魁DS,现用现配)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0. 3mL溶液III (3 mol/L的乙 酸钾，pH5.0)混匀，冰浴5-lOmin, 14000r/min离心lOmin,上清加到0. 5mL异丙醇中，混匀冰浴5-lOmin， 室温14000r/min离心15min， 70%乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40 w L TE中，可立即使用或-2(TC保存，避 免反复冻融。
(3) 重组杆状病毒获得
利用脂质体介导转染法(按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (试剂盒) 操作说明书操作)，将筛选、纯化后的重组穿梭载体(Bacmid)转染到sf9昆虫细胞(购自武汉大学中国 典型物保藏中心)中，于28'C培养，待出现细胞病变和发绿色荧光后，收集细胞培养上清即可获得重组杆 状病毒。
实施例2:重组杆状病毒QP-Ac-HNMl鉴定、VLP疫苗制备和免疫原性实验。 1、重组杆状病毒QP-Ac-HNM1鉴定。
将sf9细胞接种6孔细胞培养板，待细胞长成80-90%单层时，用1个M0I重组杆状病毒QP-Ac-HNM1接 种，同时设对照杆状病毒，逐日观察。感染72小时后90X以上的sf9细胞发亮绿荧光。
取400nl培养上清和细胞悬液，用胰蛋白酶在56'C下处理4个小时，用等体积的酚/氯仿抽提二次，取 上清加入1/10体积的3M醋酸纳和2倍体积的无水乙醇沉淀，离心弃上清，用500^170%乙醇洗沉淀一次, 自然干燥后加入50^1灭菌的去离子水重悬作为PCR模板。PCR鉴定所用的上游引物为 5,——ttttcccgggatccaccatgaaggccatc—3,, 下 游 引 物 为 -
5， —ttttctcgaggattccgggtcactgtgag—3， <■
PCR扩增条件如下-
LA T叫酶 0.5^1
10xLA buffer 5.0nl
模板
特异性上游引物 i.opi
特异性下游引物 i.ow
dNTP 2，
5ddH2035.5^1
反应条件
94 。C3 miii
94 °C30 s -
56 。C30 s
72'C3.0 min
72 。ClOmin
4°C00
PCR扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明能够扩增出一条2597bp特异的目的带，大小与预 期一致，表明外源基因己经成功的插入到重组杆状病毒中。
2、 重组杆状病毒QP-Ac-HNMl VLP疫苗制备。
参考Pushko P等人的方法(Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, and Ml proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune response in BALB/c mice. Vaccine 2005,23:5751-5759)提取甲型H1N1流感病毒样颗粒(VLP)。在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell 的感染复数接种重组杆状病毒QP-Ac-HNMl， 72小时后通过荧光显微镜检测90%以上细胞发绿色荧光后 收集病变细胞并超声波裂解，总体积为300ml。在4'C条件下8000g离心30min，然后用蔗糖浓縮到原体积 的1/10，上清中即含有表达的VLP颗粒。将上清27，000rpm/min，超速离心3小时，沉淀重悬于2ml的PBS 中，并用1ml的注射器反复吹打，然后病毒悬液用20-60%蔗糖密度梯度进行27，00rpm/min超速离心16 小时，最上层的蛋白带即为流感病毒样颗粒VLP。获得的VLP用pH7.2的PBS重悬稀释，27，000rpm/min， 超速离心3小时，沉淀重悬于2ml的PBS中，测定所获得的VLP蛋白浓度，配成lmg/ml浓度，然后用等 体积的氟氏完全佐剂进行乳化制备成VLP疫苗，存储于4'C备用。
3、 重组杆状病毒QP-Ac-HNMl VLP疫苗免疫原性初步实验。
10只雌性6-8周龄的Blab/C小鼠分为两组，每组5只。第一组5只小鼠作为阴性对照，两后腿肌肉 各注射PBS加氟氏完全佐剂乳化的对照疫苗10(^1。第二组5只小鼠两后腿肌肉各注射VLP疫苗10(^1，共 含有2jigVLP蛋白。首免28天后用相同剂量加强免疫一次。分别于0天、14天、28天、42天采血，检测 其血凝抑制抗体。血凝抑制抗体是用8个血凝单位的H1N2猪流感病毒进行检测(注H1N2猪流感病毒 的HA基因与甲型H1N1流感病毒的HA基因同源性达到95X)。结果如下表所示初步表明VLP疫苗可 以诱导小鼠产生免疫反应。
表l重组杆状病毒QP-Ac-HNMl VLP疫苗免疫原性
. . MI抗体效价组別o天14天 28天42天
VLP疫苗组1016 58910
阴性对照组1010 1010
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由 所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或 修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。序列表
<110〉 <120> <130〉 〈141〉 〈160〉 <170>
华中农业大学
一种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-Ml基因的重组杆状病毒
2009-07-14 6
Patentln version 3. 1
<210> <211〉 <212〉 <213〉 〈220> <221> <222> <223> <220〉 <221〉 <222〉 <223> <400> 3tg aag Met Lys 1
get gac Ala Asp
gtg gac Val Asp
ctg etc Leu Leu 50
gCC CC3
Ala Pro 65
aac cc3 Asn Pro
gtg gaa Val Glu
1
1701 DNA
甲型流感病毒 (l)..(讓)
(Influenza A virus)
CDS (l)..
1
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3CC
Thr
3CC
Thr 35 g朋 Glu
ctg Leu
gag Glu
acc Thr
(1701)
3tC
lie
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Leu
20
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Val
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cct Pro 100
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gag
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Ser
gtg gtc Val Val
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70
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55
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40
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10
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3CC
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acc ttc Thr Phe
33C
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tgc Cys
get
Ala
75
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Ser
88C
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8CC
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Lys 60 ggc Gly
tec Ser
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His 45 etc Leu
tgg Trp
tgg Trp
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3CC
Thr 30 tct Ser
cgc Arg
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ggt Gly 110
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15
gsc
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ggc gtc Gly Val
ctg Leu
tac
Tyr
95
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Asp
ggt
Gly
80
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lie
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48
96
144
192
240
288
336
ate gat tac gag gag ctg cgc gag cag ctg age tec gtg tec tec ttc
384
7lie Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
gaa cgc ttt gaa ate ttc cct aag act age tec tgg cca aac cac gac 432
Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
tct aac aag ggt gtg ace get gcc tgc cct cac get ggt gca卿age 480
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
ttc tac aag aac ctg ate tgg ctg gtg aaa aag ggt aac tct tac cca 528
Phe Tyr Lys Asn Leu lie Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
aag etc age aag tec tac att aac gac aaa ggc aaa gaa gtc etc gtg 576
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr lie Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
ctg tgg ggc att cac cac cca tct acc agt gcc gac cag caa age etc 624 Leu Trp Gly lie His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gin Gin Ser Leu
195 200 205
tac cag aac gca gac acc tac gtc ttc gtg ggc tec tec cgc tac age 672 Tyr Gin Asn Ala Asp Thr Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
aag卿ttc aag cct gag ate gcc ate cgc cct aag gtg agg gac cag 720 Lys Lys Phe Lys Pro Glu lie Ala lie Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin 225 230 235 240
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245 250 255
ate acc ttc gag gcc 8cc ggc aac ctg gtg gtc cct aga tac gcc ttc 816 lie Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
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275 280 285
gtc cac gac tgc aac aca act tgt cag aca cct aag ggt gcc ate aac 912 Val His A印Cys Asn Thr Thr Cys Gin Thr Pro Lys Gly Ala lie Asn
290 295 300
acc age etc cca ttc cag aac ate cac cct ate acc ate ggc aag tgc 960 Thr Ser Leu Pro Phe Gin Asn lie His Pro lie Thr lie Gly Lys Cys 305 310 315 320
cca aag tac gtg犯g age aca aag ctg cgc ctg gcc aca ggc ctg cgc 1008 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
aac ate cct tec ate cag tec卿ggc ctg ttc ggc gcc ate gcc ggt 1056 Asn lie Pro Ser lie Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly 340 345 350ttc ate gag ggc ggc tgg aca ggc atg gtg gac ggt tgg tac ggt tac 1104 Phe lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
cac cat cag aac gag cag ggc tec ggt tac get gcc gac ctg aag age 1152 His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
acc cag aac gcc ate gac gag ate acc aac aag gtg aac tec gtg ate 1200 Thr Gin Asn Ala lie Asp Glu lie Thr Asn Lys Val Asn Ser Val lie 385 390 395 400
gag aag atg aac acc cag ttc acc get gtg ggt aag gag ttc aac cac 1248 Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
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435 440 445
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450 455 柳
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
gtc tec ctg ggc gcc ate age ttc tgg atg tgc tct aac ggc tec etc 1680 Val Ser Leu Gly Ala lie Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560
cag tgt cgc ate tgc ate taa 1701 Gin Cys Arg lie Cys lie 565
〈210〉 2<211> 566 〈212> PRT
<213〉 甲型流感病毒(Influenza A virus) 〈400〉 2
Met Lys Ala lie Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
15 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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260 265 270
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Phe
His
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Leu
Leu
Glu
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Lys
Asn
Gin
Val 545 Gin
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lie
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Cys
Pro
Glu 355 Gin
Asn
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lie 435 Thr
Arg
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Gly
Glu 515 Leu
Leu
Arg
Ser 340 Gly
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Ser
Phe
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Ala
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325 lie
Gly
Glu
lie
Thr 405 lie
Thr
Asp
Gin
Tyr 485 Tyr
lie
lie
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Gin
T卬
Gin
Asp 390 Gin
Glu
Tyr
Tyr
Leu 470 His
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Ser
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Gly 375 Glu
Phe
Asn
Asn
His 455 Lys
Lys
Tyr
Gly
Ser 535 Ser
Arg
Gly 360 Ser
lie
Thr
Leu
Ala 440 Asp
Asn
Cys
Pro
Val 520 Thr
Phe
Gly 345 Met
Gly
Thr
Ala
Asn 425 Glu
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Asn
Asp
Lys 505 Lys
Val
Trp
330 Leu
Val
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Asn
Val 410 Lys
Leu
Asn
Ala
Asn 490 Tyr
Leu
Ala
Met
Phe
Asp
Ala
Lys 395 Gly
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Leu
Val
Lys 475 Thr
Ser
Glu
Ser
Cys 555
335
Gly Ala lie Ala Gly 350
Gly Trp Tyr Gly Tyr 365
Ala Asp Leu Lys Ser 380
Val Asn
Lys Glu Val Asp
Ser Val lie 400
Phe Asn His
415 Asp Gly Phe 430
Leu Glu Asn
Val Leu 445
Lys Asn Leu Tyr Glu 460
Glu lie
Cys Met Glu Glu
Gly Asn Gly ■
Glu Ser Val
495 Ala Lys Leu 510
Arg lie Tyr
Ser Thr 525
Ser Leu Val Leu Val 540
Ser Asn Gly Ser Leu 560
〈210> 3
<211> 画
〈212〉 DNA
<213〉 甲型流感病毒(Influenza A virus) <220>
<221〉 gene
〈222〉 (1)..(1410) <223> <220>
<221> CDS
<222> (l)..(l楊)
<223>
< 3
11atg aac cca aac cag aag ate ate acc att ggc tec gtg tgc atg ace 48 Met Asn Pro Asn Gin Lys lie lie Thr lie Gly Ser Val Cys Met Thr 15 10 15
att ggc atg gcc aac ctg ate etc cag ate ggc aac ate ate tec ate 96 lie Gly Met Ala Asn Leu lie Leu Gin lie Gly Asn lie lie Ser lie
20 25 30
tgg ate age cac tec ate cag etc ggc aac cag aac cag ate gag acc 144 Trp lie Ser His Ser lie Gin Leu Gly Asn Gin Asn Gin lie Glu Thr
35 40 45
tgc aac cag age gtc ate act tac gag aac aac acc tgg gtg aac cag 192 Gys Asn Gin Ser Val lie Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gin
50 55 60
acc tac gtg aac ate age aac acc aac ttc get gcc ggc cag tec gtg 240 Thr Tyr Val Asn lie Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gin Ser Val 65 70 75 80
gtc tec gtg aaa ctg gcc ggc aac tec tct etc tgc cct gtg age ggc 288 Val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly
85 90 95
tgg get ate tac agt aaa gac aac agt gtg cgc ate ggt tec aag ggc 336 Trp Ala lie Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg lie Gly Ser Lys Gly
100 105 110
gat gtg ttc gtc ate cgc gag cca ttc ate tec tgc tec cct ctg gag 384 Asp Val Phe Val lie Arg Glu Pro Phe lie Ser Cys Ser Pro Leu Glu
115 120 125
tgc cgc acc ttc ttc ctg act cag ggc gcc ctg etc aac gac aag cat 432 Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gin Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
tec aac ggc acc ate aaa gac cgc age cca tac cgc acc ctg atg age 480 Ser Asn Gly Thr lie Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser 145 150 155 160
tgt cct ate ggt gag gtg cct tct cca tac aac tct cgc ttc gag tec 528 Cys Pro lie Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
gtc get tgg tec gcc age get tgc cac gac ggc ate aac tgg ctg aca 576 Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly lie Asn Trp Leu Thr
180 185 190
ate ggc ate tct ggc cca gac aac ggc gcc gtg get gtg ctg aag tac 624 lie Gly lie Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
aac ggc ate att acc gac acc ate卿age tgg cgc aac aac ate ctg 672 Asn Gly lie lie Thr Asp Thr lie Lys Ser Trp Arg Asn Asn lie Leu
210 215 220
cgc aca cag gag tct gaa tgt gcc tgt gtg aac ggt tct tgc ttc act 720 Arg Thr Gin Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr 225 230 235 240gtg atg acc gac ggc cca age aac ggc cag gcc tec tac aag att ttc 768 Val Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Gin Ala Ser Tyr Lys lie Phe
245 250 255
cgc ate gag aag ggc aag ate gtc aag tec gtc gag atg aac gcc cct 816 Arg lie Glu Lys Gly Lys lie Val Lys Ser Val Glu Met Asn Ala Pro
260 265 270
aac tac cac tat gag gaa tgc tec tgt tac cct gac tct age gag ate 864 Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu lie
275 280 285
acc tgt gtg tgc cgc gac asc tgg cac ggc tec aac cgc cct tgg gtg 912 Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
tct ttc aac cag aac ctg gag tac cag ate ggc tac ate tgt age ggc 960 Ser Phe Asn Gin Asn Leu Glu Tyr Gin lie Gly Tyr lie Cys Ser Gly 305 310 315 320
ate ttc ggc gac aac cca cgc cct aac gac aag aca ggc age tgc ggt 1008 lie Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
cca gtg tec tct aac ggt gcc aac ggc gtg aag ggc ttc tec ttc aag 1056 Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
tac ggc aac ggt gtg tgg ate ggt cgc act aag age ate agt tct cgc 1104 Tyr Gly Asn Gly Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser lie Ser Ser Arg
355 360 365
aac ggt ttc gag atg att tgg gac cct aac ggc tgg act ggc acc gac 1152 Asn Gly Phe Glu Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp
370 375 380
aac aac ttc tec ate aag cag gac ate gtg ggc ate aac gag tgg tec 1200 Asn Asn Phe Ser lie Lys Gin Asp lie Val Gly lie Asn Glu Trp Ser 385 390 395 400
ggc tac age ggc age ttc gtg cag cac cca gag ctg aca ggc ctg gac 1248 Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gin His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
tgt ate cgc cct tgc ttc tgg gtg gaa ctg ate cgc ggt cgc cct aag 1296 Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Pro Lys
420 425 430
gag aac aca ate tgg act age ggc age age ate tec ttc tgt ggt gtg 1344 Glu Asn Thr lie Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
aac agt gac act gtg ggt tgg tct tgg cca gac ggt get gag ctg cca 1392 Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
ttc acc ate gac aag taa 1410 Phe Thr lie Asp Lys 465
13〈210> 4
〈211>柳
<212〉 PRT
〈213〉甲型流感病毒
〈400> 4
Met Asn Pro Asn Gin 1 5 lie Gly Met Ala Asn 20
Trp lie Ser His Ser 35
Cys Asn Gin Ser Val 50
Thr Tyr Val Asn lie 65
Val Ser Val Lys Leu 85
Trp Ala lie Tyr Ser 100
Asp Val Phe Val lie 115
Cys Arg Thr Phe Phe 130
Ser Asn Gly Thr lie 145
Cys Pro lie Gly Glu 165
Val Ala Trp Ser Ala 180
lie Gly lie Ser Gly 195
Asn Gly lie lie Thr 210
Arg Thr Gin Glu Ser 225
Val Met Thr Asp Gly 245
Arg lie Glu Lys Gly 260
Asn Tyr His Tyr Glu 275
Thr Cys Val Cys Arg 290
Ser Phe Asn Gin Asn
(Influenza A virus)
Lys
Leu
lie
lie
Ser
70
Ala
Lys
Arg
Leu
Lys 150 Val
Ser
Pro
Asp
Glu 230 Pro
Lys
Glu
Asp
Leu
lie
lie
Gin
Thr
55
Asn
Gly
Asp
Glu
Thr 135 Asp
Pro
Ala
Asp
Thr 215 Cys
Ser
lie
Cys
Asn 295 Glu
lie
Leu
Leu
40
Tyr
Thr
Asn
Asn
Pro 120 Gin
Arg
Ser
Cys
Asn 200 lie
Ala
Asn
Val
Ser 280 Trp
Tyr
Thr
Gin
25
Gly
Glu
Asn
Ser
Ser 105 Phe
Gly
Ser
Pro
His 185 Gly
Lys
Cys
Gly
Lys 265 Cys
His
Gin
lie
10
lie
Asn
Asn
Phe
Ser
90
Val
lie
Ala
Pro
Tyr 170 Asp
Ala
Ser
Val
Gin 250 Ser
Tyr
Gly
lie
Gly
Gly
Gin
Asn
Ala
75
Leu
Arg
Ser
Leu
Tyr 155 Asn
Gly
Val
Trp
Asn 235 Ala
Val
Pro
Ser
Gly
Ser
Asn
Asn
Thr
60
Ala
Cys
lie
Cys
Leu 140 Arg
Ser
lie
Ala
Arg 220 Gly
Ser
Glu
Asp
Asn 300 Tyr
Val
lie
Gin
45
Trp
Gly
Pro
Gly
Ser 125 Asn
Thr
Arg
Asn
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Ser
Tyr
Met
Ser 285 Arg
lie
Cys
lie
30
lie
Val
Gin
Val
Ser 110 Pro
Asp
Leu
Phe
Trp 190 Leu
Asn
Cys
Lys
Asn 270 Ser
Pro
Cys
Met
15
Ser
Glu
Asn
Ser
Ser
95
Lys
Leu
Lys
Met
Glu 175 Leu
Lys
lie
Phe
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Glu
Trp
Ser
Thr
lie
Thr
Gin
Val
80
Gly
Gly
Glu
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Ser 160 Ser
Thr
Tyr
Leu
Thr 240 Phe
Pro
lie
Val
Gly305 310 315 320
lie Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser lie Ser Ser Arg
355 360 365
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370 375 380
Asn Asn Phe Ser lie Lys Gin Asp lie Val Gly lie Asn Glu Trp Ser 385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gin His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Pro Lys
420 425 430
Glu Asn Thr lie Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
Phe Thr lie Asp Lys 465
〈210> 5 <211〉 759 〈212> DNA
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus) 〈220>
<221> gene 〈222〉 (1)..(759) 〈223> 〈220〉
〈221〉 CDS <222> (1)..(759) <223〉 〈400〉 5
atg age etc ctg acc gag gtg gag acc tac gtg ctg tct ate ate cct 48 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser lie lie Pro 15 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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130 135 140
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165 170 175
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<210> 6
〈211〉 252
<212> PRT
<213>甲型流感病毒
<400> 6
(Influenza A virus)
16AlaArgThr65GinValLysGlyGly 145 SerAsnAlaThrSer 225 GinSerGlyGlyPro50LeuAsnLysGluLeu 130 LeuHisArgGlyArg 210 SerLysLeuProLys35lieThrAlaLeuVal 115 lieValArgMetSer 195 GinAlaArgLeuLeu20AsnLeuValLeuTyr 100 SerTyrCysGinVal 180 SerMetGlyMetThr 5LysThrSerProAsn85LysLeuAsnAlaMet 165 LeuGluValLeuGly 245GluAlaAspProSer70GlyLysSerArgThr 150 AlaAlaGinHisLys 230 ValValGluLeuLeu55GluAsnLeuTyrMet 135 CysThrSerAlaAla 215 AspGinGlulieGlu40ThrArgGlyLysSer 120 GlyGluThrThrAla 200 MetAspMetThrAla25AlaLysGlyAspArg 105 ThrThrGinThrThr 185 GluArgLeuGinTyr10GinLeuGlyLeuPro90GluGlyVallieAsn 170 AlaAlaThrLeuArg 250ValArgMetlieGin75AsnlieAlaThrAla 155 ProLysMetlieGlu 235 PheLeuLeuGluLeu60ArgAsnThrLeuThr 140 AspLeuAlaGluGly 220 AsnLysSerGluTrp45GlyArgMetPheAla 125 GluSerlieMetVal 205 ThrLeulieSer30LeuPheArgAspHis 110 SerAlaGinArgGlu 190 AlaHisGinlie15ValLysValPheArg95GlyCysAlaHisHis 175 GinAsnProAlaProPheThrPheVal80AlaAlaMetPheArg 160 GluMetGinSerTyr 2401权利要求
1、一种重组的甲型H1N1流感病毒基因工程毒株，其特征在于，它含有人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒主要免疫原性基因HA-NA-M1以及标记基因eGFP，所述的重组甲型H1N1流感病毒基因工程毒株(Baculovirus)，QP-Ac-HNM1；保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC-V200912。
2、 人工合成修饰的甲型H1N1流感病毒编码的免疫原性蛋白HA、 NA及M1， 它们是序列表SEQ ID N0:1， SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
3、 权利要求1所述的基因工程毒株在制备甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗 中的应用。
4、 权利要求2所述的免疫原性蛋白HA、 NA及Ml在制备甲型H1N1流感病毒 基因工程疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及病毒学领域。具体涉及一种人工修饰合成的含有甲型H1N1流感病毒主要免疫原性基因HA-NA-M1的重组杆状病毒，该毒株QP-Ac-HNM1属于杆状病毒(Baculovirus)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC-V200912。该重组病毒可以同时表达甲型H1N1流感病毒HA、NA和M1蛋白，形成病毒样颗粒。该病毒样颗粒可以用来研制成疫苗，预防人和猪感染甲型H1N1流感病毒。
文档编号C12N7/01GK101624580SQ20091006321
公开日2010年1月13日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者李祥敏, 金梅林, 平 钱, 陈焕春 申请人:华中农业大学