一种鲁棒有序的mRNA差异显示的方法

专利名称：一种鲁棒有序的mRNA差异显示的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学及遗传学的全基因表达图谱技术领域。更具体涉及一 种鲁棒有序的mRNA差异显示的方法，它适用于所有真核物同一组织细胞在不同 发育时期、不同的生理病理条件下的mRNA差异比较研究，或者不同组织细胞 在相同的发育时期或相同的生理病理条件下的mRNA差异比较研究。
背景技术：
全基因组表达图谱技术是现代生命科学研究领域的核心技术之一。目前已经 有一些重要的模式真核生物如酵母、果蝇、线虫、人类、鼠、拟南芥、水稻和高 粱等的全基因组序列已经发表，但尚有大量生物物种的基因组是未知的，而且从 这些发表的结果到基因组序列完全完成尚有很大的距离。即使我们在后基因组时 代中得到了完美的基因组序列，由于真核生物在转录水平和转录后水平的调控复 杂性，仍然要依靠不断完成基因和转录本的"百科全书"才能最终真正解读基因 组密码。其核心问题就是揭示细胞在特定时空背景特定条件下的全基因表达图 谱。
现今的全基因表达图谱技术可依据各自的策略分为三大类基于测序的策 略、基于杂交的策略和基于凝胶电泳的策略。其中，测序策略可以为各种生物样 本提供具有最大广度和深度的序列信息及相应丰度信息。但是要对整个转录组或
全长cDNA进行测序，目前成熟可靠的技术是Sanger法，其成本极其昂贵。新一 代测序技术大大降低了成本，但目前仅适用于重测序，成本仍然很高。为了进一 步降低成本， 一些部分测序长标签技术如表达序列标签技术(EST) ， 3'-非翻译 区(UTR)测序技术和短标签测序技术如基因表达的系列分析技术(SAGE)，基因表 达的5' —帽端分析技术(CAGE)及3'和5'-端的双标签技术(Di-tag)被开发出来 并投入应用。但是长标签技术的成本仍然很高。短标签技术(尤其是在结合新一 代测序技术后)极大程度地降低了成本，但是往往因为序列太短而不能准确定位 到特定的基因。
cDNA微阵列技术是基于杂交策略中的主流技术。自发明以来，它一直在全 基因表达谱技术中占据优势地位。该技术利用样本及对照的raRNA池与固定在芯片上的数以万计根据已知基因序列设计的探针杂交，以高通量的方式确定各 mRNA的种类和丰度。虽然该技术获得广泛的利用，但长期以来一直倍受争议。 例如， 一些由于杂交原理本身内在的问题，包括它需要大量的RNA，缺乏多种样 本平行比较方式，探针与相似的转录本间的交叉杂交，需要大量验证努力等等。 此外由于要设计探针，参考基因组序列信息是必不可少的，所以该技术具有"封 闭性"，仅适用于基因组序列测定已经完成的少数物种。特别是最近，大量关于 其可靠性、重复性、性价比和数据及噪点处理问题的质疑呈爆发式地增加。cDNA 微阵列技术似乎已不再是全基因表达谱技术的理想选择。
基于凝胶电泳的策略是全基因表达谱策略中性价比最高和最为直观可行的 策略。它充分利用了包括PCR 、 DNA测序胶电泳、克隆和测序在内的常规分子生 物学技术的简单性和高效性。其所需仪器和试剂都是常规分子生物学实验室常备 的。两个或多个样本的多态可在同一凝胶相邻泳道中直观地显示出来并用于比较 分析。RNA的投入量可少至20皮克。通过有限数目引物组合进行PCR，即可以实 现高通量要求。差异条件被回收、重扩增和克隆测序后，可用于后续实验和分析， 如BLAST分析和转基因实验等。基于凝胶电泳的策略是"开放"的，它优于cDNA 微阵列技术，既适用于具有己知参照基因组序列的物种，也适用于基因组序列未 知的物种；既可用于检测已知基因或转录本表达差异，也可用于发现未知的基因 或转录本的检测。
mRNA差异显示和cDNA-AFLP是最重要的两种基于凝胶电泳策略的技术。在 基于凝胶电泳的技术中，mRNA差异显示技术是最简单和最经济的。传统的差异 显示实验方案利用由mRNA反转录产物作为模板，利用由17个碱基组成的带有 5'-历'/wHI识别序列后跟的锚定多聚胸腺嘧啶引物(记为HT11V，H代表〃i/7dl1 识别序列，V代表碱基A、 C或G)和由13个碱基组成的5' — 识别序列 后跟的任意七碱基引物(H-AP， AP即arbitrary primer随机引物)进行PCR。 PCR 产物跨越了 mRNA的多聚腺苷酸尾[poly(A) tail]和距其最近的与H-AP引物配对 区间，可能包括了部分或者全部的3'-UTR，还可能包括部分编码区。3'-UTR相 对mRNA的其它区域更适于全基因表达图谱分析，因为它更具可靠性和多态性。 通过不同样本PCR产物片段长度多态性比较，可以提示不同样本转录本的差异， 甚至可以区别出极其相似的转录本差异，这有效地克服了 cDNA微阵列技术中的 交叉杂交问题。此外，锚定的多聚胸腺嘧啶[poly(T)]引物保证了mRNA的3'-端 100%的覆盖率。然而，差异显示技术的局限也是很明显的。poly(T)引物和任意 引物的使用会导致PCR的退火温度低，非特异性扩增多。而且会存在大量无序的 错配和引物对模板的竞争。各种因素导致PCR效率和结果的可靠性、重复性及灵 敏度低下，假阳性高。此外，还会存在低覆盖率与大量覆盖冗余的矛盾。cDNA-AFLP技术通过引入双链cDNA合成、酶切(通常利用高频位点/低频位 点限制酶组合进行双酶切)和连接接头等几个步骤克服了 raRNA差异显示技术的 大多数缺点。借助接头特异性引物，PCR可以在高严谨条件下进行。通过引入基 于磁珠的DNA片段分离技术，冗余现象可以避免而实现一片段一转录本的理念。 这样cDNA-AFLP实现了从无序到有序的转变。然而覆盖率对其来说却是一个棘手 的问题，它依赖于两种酶切位点尤其是低频酶切位点在各cDNA的分布情况。超 过十多种方法曾被胜于攻克这一难题，但收效甚微。因此，有必要建立一种既发 挥以上技术的优点也克服以上技术的不足的新技术方法，来检测基因组或转录本 mRNA的表达差异。 一种鲁棒有序的mRNA差异显示方法就是在这种研究背景中产 生的。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种鲁棒有序的mRNA差异显示的方法，它将常 规的mRNA差异显示与cDNA—AFLP方法有机地结合起来，从而具有高覆盖率、 低冗余、高灵敏度、高重复性和高性价比。本方法普遍适于常规分子生物学实验 室进行各种差异表达研究，尤其是在植物、动物及人类疾病的分子生物学诊断等 领域中具有潜在而广泛的应用价值。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方法措施
利用设计的带5'-端生物素标记和^cmI酶切位点的bmaT16V引物进行反转 录，使所有的cDNA上都实现了灰mI酶切位点100%覆盖；利用酶切，可 以保证较高的覆盖率和合适的扩增片段长度；反转录引物的生物素标记结合磁珠 法可专一性地分离每一 cDNA的仅带poly(T/A)尾的唯一酶切片段，并去除冗余 片段；通过^c"I切除poly(T/A)尾，再连接假接头，从而实现poly(T/A)置换。这 样，传统的差异显示技术被彻底转化成了 cDNA-AFLP技术方法。
鲁棒有序的mRNA差异显示的方法(Robust ordered differential display, RoDD)包括以下6个步骤(具体步骤见说明书附1):
(1) 、双链cDNA的合成。以样本纯化后的总RNA为模板，利用设计的带 5'-端生物素标记和Zod酶切位点的bmaT16V引物反转录合成cDNA第一链(以 样本水稻日本晴叶片和对照水稻日本晴根纯化后的总RNA为模板，利用本发明 自主设计的bmaT16V引物(本实验所有设计的接头序列和引物序列皆由 invitrogen公司合成)合成cDNA第一链},再利用切口平移法合成cDNA第二链。 bmaT16V引物序列为5'-bio-GAGTCTGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'(其中bio 代表生物素标记，V代表碱基A、 G或C)。
(2) 、第一次酶切与连接。将cDNA纯化回收，利用il/spl (本实验所有内接酶(购自promega公司)连接 My; I接头。My户I接头序列为M-F 5'-GATGATGAGTCCTGAG-3'和M-R 5'-TACTCAGGACTCAT-3' o
(3) 、第一次分离。利用链霉亲和素包被的磁珠与生物素杂交结合各cDNA 分子经Afe/ I酶切并加上My; I接头后带生物素的片段，再利用磁力架吸附磁珠， 洗脱非吸附的冗余片段。
(4) 、第二次酶切、分离与连接，即poly(T/A)置换。利用Ar"I对结合在磁 珠上的片段进行再次酶切，然后利用磁力架吸附磁珠以留住其中带生物素的片 段，取上清(含目的片段)并将其等分为I、 II两部分，再利用T4连接酶连接 各自对应的假接头，置换掉扩增效率低的poly(T/A)尾。连接产物加适量双蒸水 稀释即获得预扩增的模板。第I部分连接的假接头序列为PseudoI-F-
5'國CTCGTAGACTGCGAACCTT-3'和Pseudo I -R: 5'-GGTTCGCAGTC隱3'; 第II部分连接的假接头序列为 Pseudo II -F : 5'-CTCGTAGACTGCGAACCTTNN-3'和Pseudo II -R
5'-AAGGTTCGC AGTC隱3'。
(5) 、预扩增和选择性扩增。第i、 n部分连接产物的预扩增引物序列同为
M+0 : 5'-GATGATGAGTCCTGAACGG-3' 和Pseudo+0 : 5'
-CTCGTAGACTGCGAACCTT-3';而两部分的选扩引物有区别，第I部分的选 扩引物序列为PI+2:
5' -GTAGACTGCGAACCTTVN-3'和MI+2: 5'陽GATGAGTCCTGAACGGNN-3'， 共192 个组合；第II部分选扩引物序列为 P II +2: 5'-GTAGACTGCGAACCTTNN隱3'(除去5'陽GTAGACTGCGAACCTTTT-3')和Mil +2: 5'-GATGAGTCCTGAACGGNN-3'，共240个组合；
(6) 、 DNA测序胶电泳分离及差异显示。利用4% (质量体积比)尿素变性 PAGE凝胶和DNA测序电泳仪(Thermo Fisher Scientific Inc.,美国)80W恒功率电 泳1.5 2小时分离步骤5中的选择性扩增片段。银(硝酸银)染显色(或者采取 荧光、放射性等替代显示技术)，通过比较显色结果获取差异片段。
含差异片段的PAGE胶块可被切下并加以回收，利用原引物及原选择性扩增 的条件重扩，克隆测序供进一步分析。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果
1、适用范围广。本发明适用于基因组序列已知和未知的所有真核生物物种， 适用于已知转录本的检测和未知转录本的发现；本方法发明适用于任何普通分子
生物学实验室采用。2、 性价比高。本发明利用常规仪器和试剂去探索基因差异表达，操作成本 经济，实验结果理想。
3、 结果可靠性高、实验可重复性好，灵敏度高。本发明将mRNA差异显示 彻底转化为cDNA-AFLP形式，利用接头特异性引物使得PCR在高严谨条件下 进行，有效地解决了常规差异显示非特异扩增、引物竞争和高假阳性等问题，从 而使结果可信，重复性好，而且灵敏度高。
4、 覆盖率高，而且冗余少。本发明利用poly(T/A)置换法将其置换为人工接 头序列，确保了带poly(A+)mRNA100W的覆盖率。而另一端依赖于高频酶切位 点在所有mRNA上的分布情况，预期可达93%以上。由于磁珠法的引入，去除 了绝大多数的非目的片段，因而将冗余降到了最低程度。


图1鲁棒有序的mRNA差异显示方法(RoDD)流程图
RoDD方法主要包括六个步骤(1).利用5'-端带生物素标记和iWy/、 ^cm/ 酶切位点的bmaT16V引物进行反转录，将mRNA转化为双链cDNA。 (2).利用 Myp/进行酶切双链cDNA，然后利用T4连接酶连接Mspl接头。(3 ).利用链 霉亲和素包被的磁珠与生物素杂交结合带生物素的片段，利用磁力架吸附该类片 段并洗脱非吸附的冗余片段。(4).利用^:w/对被磁珠吸附的片段进行二次酶切， 然后利用磁力架吸附住带生物素端的片段，取上清(含目的片段)并将其等分为 I和II两部分。第I部分连接带TT粘末端的假接头；第II部分连接带两个任意选 择性碱基的16种假接头混合物。(5).分别以不带选择性碱基的假接头引物和 MspI接头引物组合对A、 B连接产物进行预扩增，再分别以稀释的预扩产物为模 板，用相应带两个选择性碱基的引物组合进行选择性扩增。A部分共有12X 16=192 个组合，B部分有15 X 16=240个组合，两者共计432个组合。(6).利用4%尿素 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同长度的扩增片段，硝酸银染色。差异片段可被 切下回收、重扩增、克隆及测序，供进一步分析。
图2 —周龄水稻幼苗叶、根基因表达差异研究示意图I 图2图示了 31对选择性引物组合和第I部分连接产物所扩增的产物经变性、 测序胶电泳和硝酸银染色等程序后得到的一周龄水稻幼苗叶和根的部分RoDD 差异表达图谱。第I部分引物与带TT突出末端的假接头对应。各引物组合下的 1-3个泳道对应的水稻的叶(L)、根(R)和作为对照的叶根混合物(M)。右下角的小图为矩形框所示局部结果的放大图谱。各样本扩增产物大小分布在 50-1000bp之间，而集中分布的区域为400bp左右。
图3—周龄水稻幼苗叶、根基因表达差异研究示意图n
图3图示了 30对选择性引物组合和第II部分连接产物所扩增的产物经变性、 测序胶电泳和硝酸银染色等程序后得到的一周龄水稻幼苗叶和根的部分RoDD 差异表达图谱。第II部分引物与非TT的二碱基突出末端假接头相对应。各引物 组合下的1-3个泳道对应的水稻的叶(L)、根(R)和作为对照的叶根混合物(M)。 右下角的小图为矩形框所示局部结果的放大图谱。各样本扩增产物大小分布情况 与图2—致。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本方法发明。这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明要求保护的范围。下列实施例中未注明具体实验条件和方 法，实验条件和方法参照相关试剂公司的说明书或者《分子克隆》(第三版)(萨 姆布鲁克等主编，2001)。
实施例l: 一周龄水稻幼苗叶、根基因表达差异研究
一种鲁棒有序的mRNA差异显示的方法，包括以下步骤
(1) 、双链cDNA的合成。利用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)从一周龄基因 组序列己测定的标准粳稻日本晴幼苗中叶、根中分别提取总RNA。经DNase I (Promega，美国)处理、酚仿(体积比1:1)抽提和75% (体积百分比)乙醇沉 淀后，将纯化的总RNA溶于30ul焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水中。取 适量纯化后的叶、根各总RNA，以设计的bmaT16V为引物(Invitrogen公司合成, 美国)，利用Superscript III反转录酶(Invi加gen，美国)分别合成cDNA第一链。 进一步利用RNA酶H、 DNA聚合酶I和大肠杆菌(￡. co//) DNA连接酶(takara， 日本)，通过切口平移法合成cDNA第二链。bmaT16V引物序列为 5'-bio-GAGTCTGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'(其中bio代表生物素标记，V 代表碱基A、 G或C)。
(2) 、第一次酶切与连接。利用PCR产物回收试剂盒纯化回收cDNA，再 利用她pl (neb公司，美国)进行酶切，然后利用T4连接酶连接Ms; I接头。
接头序列为M-F5'-GATGATGAGTCCTGAG-3'和 M-R 5'-TACTC AGGACTCAT-3'。
(3) 、第一次分离。通过磁珠法，利用链霉亲和素包被的磁珠(promega公司，美国)与生物素杂交结合各cDNA分子经M^I酶切并加上M^7l接头后带 生物素的片段，再利用磁力架吸附磁珠，洗脱非吸附的冗余片段。
(4) 、第二次酶切、分离与连接，即poly(T/A)置换。利用^cwl (neb公司， 美国)对被磁珠吸附的片段进行再次酶切，然后利用磁力架吸附住带生物素端的 片段，取上清(含目的片段)并将其等分为I、 II两部分，再利用T4连接酶连 接各自对应的假接头，置换掉扩增效率低的poly(T/A)尾。将第I、 II两部分连 接产物加适量双蒸水稀释即获得预扩增的模板。第I部分连接的假接头序列为 Pseudo I -F: 5'-CTCGTAGACTGCGAACCTT-3'和Pseudo I —R: 5' -GGTTCGCAGTC-3',带-TT突出末端；第II部分连接的假接头序列为Pseudo II-F: 5'-CTCGTAGACTGCGAACCTTNN-3'和PseudolI-R : 5' -AAGGTTCGCAGTC-3'， 带任意两碱基突出末端。
(5) 、预扩增和选择性扩增。通过不带选择性碱基的接头特异性引物，分别 对第I、 II部分连接产物进行预扩增。两者的预扩增引物序列同为M+0: 5'-GATGATGAGTCCTGAACGG-3'和Pseudo+0: 5'
-CTCGTAGACTGCGAACCTT-3',预扩增的PCR程序为94°C ， 5min, 1个循环； 94°C， 30s， 56°C， 30s， 72°C， lmin，不超过25循环；72°C， 5min， 1个循环； 4'C， hold。将各自的预扩增产物加适量双蒸水稀释作为模板，以带选择性碱基 的引物进行选择性扩增。两部分的选扩引物有区别，第I部分的选扩引物序列为 PI+2: 5'-GTAGACTGCGAACCTTVN-3'和MI+2:
5'-GATGAGTCCTGAACGGNN-3'，共192个组合；第II部分选扩引物序列为P II+2:
5' -GTAGACTGCGAACCTTON-3'(除去5'陽-GTAGACTGCGAACCTTTT-3，)和M n+2:5'-GATGAGTCCTGAACGGNN-3'，共240个组合；选择性扩增程序为94 。C， 5min， 1个循环；94°C， 30s， 65°C (每一循环降低0.7°C )， 30s， 72°C， lmin, 共13个touchdown循环；94°C， 30s， 56°C， 30s， 72°C， lmin， 25个循环;72 °C, 5min， l个循环；4'C，保存。
(6) 、 PAGE凝胶电泳及差异显示。取各选扩产物10iU，分别加入4ul甲 酰胺DNA变性缓冲液，95'C变性10min,然后迅速转冰上冷却2-3min。利用DNA 测序电泳仪(Thermo Fisher Scientific Inc.,美国)，以4% (质量体积比)尿素变性 PAGE凝胶电泳分离扩增片段，变性产物上样量l-4iU， 80W恒功率电泳1.5~2 小时，经银(硝酸银)染显色即可得到一周龄水稻幼苗叶、根基因差异表达指纹 图谱(图2、图3)。
逐个比较各引物组合条件下水稻日本晴叶、根的选择性扩增片段，对重要的 差异片段进行切胶、回收、重扩增和克隆测序，以供其它分析，如BLAST分析和半定量RT-PCR验证。
申请人的验证结果表明本方法发明能够较灵敏、准确地检测出不同类型的核 基因组背景的组织或细胞所表达的mRNA的差异，还能检测出同一生物体的不 同组织所表达的mRNA的差异。据此，它也适用于同一生物体的同一组织在不 同的发育时期或不同生理病理条件下的差异表达研究。结果如图2、 3中致密有 序的条带说明了它较高的覆盖率和较好的分辨率。实验中通过有限的引物组合就 实现较高的覆盖率，因而它具有高通量的特点。多次的重复实验结果表明它具有 很好的重复性。鉴于本发明技术具有较高灵敏度、精确度、覆盖率、高通量和重 复性的特点，同时普遍适用于不同的实验室进行多个样本的差异表达研究，只需 要常规的仪器和药品，成本低廉，因而本方法发明在同领域中具有极高的性价比。
权利要求
1.一种鲁棒有序的mRNA差异显示的方法，包括以下步骤(1)、双链cDNA的合成，以样本纯化后的总RNA为模板，利用设计的带5′-端生物素标记和AcuI酶切位点的bmaT16V引物反转录合成cDNA第一链，再利用切口平移法合成第二链；bmaT16V引物序列为5′-bio-GAGTCTGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′；(2)、纯化回收cDNA，利用MspI酶切，然后利用T4连接酶连接MspI接头；MspI接头序列为M-F 5′-GATGATGAGTCCTGAG-3′和M-R5′-TACTCAGGACTCAT-3′；(3)、利用磁珠法分离带生物素的酶切片段，即利用链霉亲和素包被的磁珠与生物素杂交结合带生物素的片段，利用磁力架吸附磁珠分离带生物素的酶切片段，洗脱非吸附的不带生物素的片段；(4)、利用AcuI再次酶切结合在磁珠上的带生物素的片段，然后利用磁珠法再次吸附二次酶切产物后带生物素的片段，取含目的片段的上清并将其等分为I、II两部分，再利用T4连接酶连接各自对应的假接头，实现poly(T/A)置换，连接产物加适量双蒸水稀释即获得预扩增的模板；第I部分连接的假接头序列为Pseudo-F5′-CTCGTAGACTGCGAACCTT-3′和Pseudo-R5′-GGTTCGCAGTC-3′；第II部分连接的假接头序列为Pseudo-F5′--CTCGTAGACTGCGAACCTTNN-3′和Pseudo-R5′-AAGGTTCGCAGTC-3′；(5)、利用第I、II部分连接产物分别进行预扩增和选择性扩增；两部分的预扩增引物序列同为M+05′-GATGATGAGTCCTGAACGG-3′和Pseudo+05′-CTCGTAGACTGC GAA CCTT-3′；两部分的选扩引物有区别，第I部分的选扩引物序列为P+25′-GTAGACTGCGAACCTTVN-3′和M+25′-GATGAGTCCTGAACGGNN-3′，共192个组合；第II部分选扩引物序列为P+25′--GTAGACTGCGAACCTTNN-3′和M+25′-GATGAGTCCTGAACGGNN-3′，共240个组合；(6)、利用DNA测序电泳仪以4％尿素变性PAGE凝胶电泳分离扩增片段，80W恒功率电泳1.5～2小时，硝酸银染显色，比较显色结果获取差异片段；含差异片段的PAGE胶块被切下并加以回收，利用原引物及原选择性扩增的条件重扩，克隆测序供进一步分析。
全文摘要
本发明公开了一种鲁棒有序的mRNA差异显示的方法，步骤是A.提取总RNA，利用设计的带5′-端生物素标记和AcuI酶切位点的poly(T)引物反转录合成cDNA第一链，进一步用切口平移法合成双链；B.纯化回收cDNA，利用MspI进行酶切，再利用T4连接酶连接MspI接头；C.利用磁珠法分离带生物素的酶切片段，洗脱其余片段；D.利用AcuI对带生物素的酶切片段进行再次酶切，通过T4连接酶连接AcuI假接头；E.常规cDNA-AFLP的预扩增和选择性扩增；F.尿素变性PAGE凝胶电泳及差异扩增片段显示。差异片段可被切下回收、重扩、克隆和测序，供进一步分析。本法具有较高灵敏度、精确度、覆盖率、高通量和重复性，适于常规分子生物学实验室进行各种差异表达研究。
文档编号C12Q1/68GK101638686SQ20091006316
公开日2010年2月3日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者毅 丁, 刘宏高 申请人:武汉大学