专利名称：水稻铜转运子基因OsCtr5和它在铜污染土壤和水体修复中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻铜转运子基因0sCtr5的 分离克隆、功能验证和应用。0sCtr5基因是水稻中重要的铜转运基因。超量表达0sCtr5基 因后，水稻植株地上和地下部位内铜含量显著上升。可以通过种植超量表达0sCtr5的水稻 材料，降低土壤和周围水体中的铜含量，用于修复土壤和水体的铜污染。
背景技术：
铜作为一种重要的原料，在工业、农业、交通等诸多领域内有着非常广泛的用途。 随着经济的发展，对铜的需求量不断加大。在铜的开采、冶炼和使用过程中都不可避免的造 成含铜废物的排放和残留，导致环境中铜的污染(廖自基，1989)。水环境的铜污染物主要 是制造业排放含铜废水造成的。土壤中铜污染主要来源于铜污染的水，以及农业生产中含 铜杀菌剂(如波尔多杀菌剂)的长期大量使用等(Ayres，2004)。环境中铜的污染对人类和其它生物产生危害(Moffat，1995)。土壤中的铜污染通 过雨水的冲刷可以导致地下水和湖泊的污染。铜污染的土壤不利于植物生长(Le印，1981 ； Cao等，2000)。高铜会导致人和动物出现肝硬化、溶血性贫血症、神经中枢功能失调等诸多 病症(Harris 和 Gitlin，1996)。铜一旦进入土壤后，由于移动性小而很难清除。人们尝试了不同方法治理土壤的 铜污染。如施用有机肥、石灰等改良剂以降低土壤中铜的活性，使铜盐变成难溶物，植物不 吸收铜(Garcia-Sanchez等，1999)。用化学方法治理土壤中铜污染，主要是向土壤中投入 改良剂，通过对铜的吸附、氧化还原、拮抗或沉淀作用。但这些方法成本高，而且会破坏土 壤结构以及土壤微生物区系，造成二次污染(Khan和Scullion，2000)。通过植物直接吸收 土壤中过量的重金属，然后收获植物是一种高效、廉价而且保护环境的土壤污染治理途径 (Raskin等，1997)。利用植物治理土壤中的铜污染还有以下优势(1)植物在吸收土壤中 铜的同时，向根系周围释放分泌物，可以增加根系周围土壤中的碳和氧的含量，改良土质， 使其更适合农作物的生长(施积炎等，2004) ； (2)可以从修复植物中回收铜，缓解对铜矿资 源日渐增加的需求(Ho，2003) ； (3)铜是植物生长所必须的微量元素，部分耕地缺乏铜；富 集铜的植物可以作为铜肥生产的原材料；用这种植物原材料制成的铜肥更容易被植物所吸 收利用(He等，2005)。因此，利用植物修复技术能够彻底、永久性地解决土壤中的铜污染问 题，并可以使铜资源再利用(Rocha等，2009)。目前，有报道某些种类的植物，如黑麦草(Hao 等，2003)、海州香薷(Lou等，2004)、紫花香薷(Jiang等，2004)、紫花苜蓿(Peralta-Videa 等，2004)、印度芥菜(Bennett等，2003)、玉米(Liu等，2001)、酸模(Tang等，1999)、密毛蕨 (郑洁敏等，2006)，对高铜有较好地耐受、吸收或体内累积能力，可用于土壤中铜污染的治 理。但是这些植物种类远远不能满足在不同环境中对不同土壤铜污染治理的需求。采用植物治理土壤中的重金属污染的基本原理是植物的根系直接将土壤中过量 的金属污染物吸收，并将其转移到地上部的各个组织中，通过收获植物而清除土壤中的金属污染物。植物体生长发育所需要的铜都来源于外界。植物从土壤中吸收铜有转运蛋白的 调控。对模式植物拟南芥铜转运蛋白基因AtCOPT的研究发现，这类基因能够通过根部把 土壤中的铜吸收进入植株体内，进而转运至地上的茎和叶等组织中，使铜在植株体内累积 (Kampfenkel 等，1995 ；Sancenon 等，2003)。水稻在全世界范围内广泛种植。其根系发达，秸杆生物量丰富，可以容纳大量铜。 另外，水稻割蔸后可以快速再生；当水稻生长至其生物量达到最大阶段时，收割地上部分后 让其再生继续吸收累积土壤中的铜。分离克隆水稻铜转运蛋白基因，并超量表达目标基因 增强其转运铜的功能；改良的水稻不仅可以用于治理土壤中铜污染，还可以有效吸收周围 水体中的铜。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个铜转运子基因的完整DNA片段，并 通过超量表达目标基因的功能鉴定该基因在铜吸收转运过程中所起到的作用，为利用这 个基因进行土壤和水体中铜污染修复的技术奠定基础。这个基因被命名为0SCtr5(0ryZa sativa copper transporter 5) 0本发明涉及分离一种包含0sCtr5基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予植物 吸收转运土壤和水体中铜。分离的0sCtr5基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示， 或者基本上相当于SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，或者其功能相当于SEQ ID N0:1所示 序列的亚片段。超量表达序列表SEQ ID NO :1所示序列可以显著增加水稻植株体内铜的含 量，从而降低土壤和水体中铜污染物的含量。可以采用已经克隆的0sCtr5基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明 的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)方法，也可以从基因组、 mRNA和cDNA中扩增得到本发明的0sCtr5基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一 段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含0sCtr5基因的序列或者包含一段0sCtr5基因的 序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞超量表达0sCtr5基因，产生转基 因植物。转基因植物可以在体内累积铜，从而降低土壤和水体中铜含量，治理土壤和水体的 铜污染。在本发明的实施例部分，申请人阐述了 0sCtr5基因的分离、功能验证和应用过程 以及该基因的特点。
序列表SEQ ID NO 1是本发明分离克隆的0sCtr5基因的核苷酸序列和它编码的 蛋白质的氨基酸序列。图1.本发明鉴定和分离克隆水稻铜转运子基因0sCtr5以及验证0sCtr5基因功 能的流程图。图2. 0sCtr5基因的结构。黑色长方形示编码区，白色长方形示5'和3'非翻译区 (untranslated region，UTR)。“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。数字示每 一种结构的核苷酸数目。箭头示PCR扩增引物0sCtr51F、0sCtr55F、0sCtr56R和0sCtr51R 的位置和方向。
图3.用定量RT-PCR技术分析水培水稻植株经铜胁迫(缺铜或过量铜)处理后 0sCtr5基因的表达变化。每个样品中0sCtr5基因的表达量是相对于未经铜胁迫(正常铜) 处理植株的表达量。图中(A)铜胁迫处理后苗中0sCtr5基因的表达模式；(B)铜胁迫处理 后根中0sCtr5基因的表达模式。图4.携带0sCtr5基因的遗传转化载体pU1391的结构。RB和LB代表pU1391载 体上的T-DNA右和左边界；Pim代表玉米泛素基因启动子；GFP代表绿色荧光蛋白基因；NOS 代表napoline合成酶多聚腺嘌呤信号；Hpt代表潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)。图5.融合蛋白0sCtr5-GFP位于洋葱表皮细胞的细胞膜中。图中(A) 0sCtr5_GFP 位于细胞边界。(B)与㈧同一个视野的明场照片。(C)重叠㈧和⑶的图像显示 0sCtr5-GFP位于细胞膜。(D)对照GFP分布于细胞膜、细胞质和细胞核。标尺示100 μ m。图6.遗传转化载体pU1301的结构。图7. TO代遗传转化植株(D179UM)中的0sCtr5基因表达量。对照为水稻品种牡 丹江8 (遗传转化的受体)。
具体实施例方式以下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了鉴定和分离克隆0sCtr5基因以及验 证0sCtr5基因功能的流程。根据以上的描述和下面的实施例，本领域技术人员可以确定本 发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变 和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1 :0sCtr5基因的序列和结构分析1.0sCtr5基因结构的预测本发明的申请人用拟南芥的铜转运子基因AtCOPTl的一段cDNA序列(Kampfenkel 等，1995)，用 BLAST 方法(Altschul 等，1997)检索核苷酸数据库 GenBank(http://Ww. ncbi. nlm. nih. gov)，发现基因AtCOPTl序列与来自水稻品种日本晴的一条位于水稻5号染 色体、长125650bp序列(GenBank注册号AC109595. 2)中的一段(第81886至82341处) 高度同源。在水稻基因组数据库TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中，这段与 OsCtrl基因同源的水稻序列被注释为一个基因，其编号是L0C_0s05g35050。本发明的申请 A^S^hSIS'BP'^i^J 0sCtr5 (Oryza sativa copper transporter 5) 2.从水稻品种中花11中分离克隆0sCtr5基因中花11是研究中常用的一个水稻品种(Wu等，2003 ；Cao等，2007)。申请人根据 0sCtr5基因在粳稻日本晴基因组中的位置和结构(水稻基因组数据库TIGR)，以0sCtr5基 因两侧的基因组序列为模板，设计了两条PCR引物0sCtr51F(5' -CGGGGTACCAAGAGCTAACCC ATA-3')(下划线代表KpnI限制性内切酶消化位点)和0sCtr51R(5' -GCTGGATCCGAACAGT TTTGCAGG-3')(下划线代表BamHI限制性内切酶消化位点)(图2)，从中花11中扩增包含 0sCtr5基因、长870bp的DNA片段。利用美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒，以 双脱氧核苷酸末端终止法(美国Applied Biosystems公司)分别从PCR扩增片段两端测 序。序列拼接后得到一长870bp的DNA序列，它包括完整的0sCtr5基因序列。3. 0sCtr5基因结构分析为了获得0sCtr5基因全长cDNA序列，本发明申请人提取水稻品种中花11的总
5RNA(Zhou 等，2002)。取 1 5 μ g 总 RNA 用 DNaseI (美国 Invitrogen 公司)处理 15 分 钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo (dT) 15寡聚引物和 M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录成cDNA。然后利用PCR引物0sCtr51F和 0sCtr51R，以总cDNA为模板，扩增出0sCtr5基因的全长cDNA。然后将PCR产物与T-A克 隆载体pGEM-T (美国Promega公司)连接，将连接好的载体电转化(电转化仪为印pendorf 公司产品，本实施例所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)进入大肠杆菌 菌株DHlOB (Sim等，2004)，通过酶切筛选阳性克隆。对阳性克隆进行测序，获得0sCtr5基 因的cDNA序列。比较分析0sCtr5基因的基因组序列和cDNA序列，确定0sCtr5基因由870个核苷 酸组成，仅包含一个外显子，没有内含子(见图2)。0sCtr5基因的编码区由456个核苷酸 组成(位于序列表SEQ IDNO 1的75-530bp处)，编码152个氨基酸。0sCtr5基因的5，端 非翻译区(untranslated region，UTR)由74个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO 1的 l-74bp处)，3，端UTR由340个核苷酸组成(位于序列表SEQIDN0 1的531_870bp)。4. 0sCtr5基因编码产物分析用BLASTP(Altschul等，1997)方法分析，0sCtr5蛋白质与拟南芥的铜转运子蛋 白AtCOPTl的氨基的氨基酸一致性为56%，氨基酸相似性为71 %。用PSORT软件(http:// psort. nibb. ac. jp/form. html. Naki andKanehisa, 1991)分析显示，0sCtr5 蛋白可言旨是细 胞膜蛋白。实施例2 铜处理后0sCtr5基因的表达谱分析为了验证0sCtr5基因是否参于水稻铜吸收转运的调控，本发明申请人首先采 用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR, qRT-PCR)技术(Qiu 等，2007)分析了 0sCtr5基因对铜处理的反应。本发明申请人采用水培方法种植水稻 (Ishimaru等，2006)。水培培养液采用标准配方(Ishimaru等，2006)。标准水培培养液中 铜盐(硫酸铜)含量为0.2 μ M。在铜缺乏胁迫处理实验中，培养液中不加铜盐；在铜过量 胁迫处理实验中，培养液中铜盐含量为50μΜ。将水稻品种中花11水培至4叶期开始铜胁 迫处理。铜胁迫处理后在不同时间点分别取苗(shoot)和根，抽提总RNA(Zh0u等，2002)。 取1 5 μ g总RNA用DNaseI (美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污 染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用0lig0(dT)15寡聚引物和M-MLV反转录酶(美 国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒SYBR Green PCR Master Mix (大连Tokara公司)，并根据试剂盒使用说明书，在ABI 7500Real-Time PCR system(美 国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白 (actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的 0sCtr5 基因特异 PCR 引物是 0sCtr5realF(5' -GCTGTCTCGCTCGTCATGGT-3 ‘)和 0sCtr5re alR(5' -CGCACACACAAMCATCAACAA-3‘)，肌动蛋白基因PCR 引物是actinF(5' -TGCTATG TACGTCGCCATCCAG-3‘)和 actinR(5' -AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3‘)。定量RT-PCR分析显示，不管是在苗(图3A)还是在根部(图3B)，缺铜诱导0sCtr5 基因表达增强，而当在培养液中重新补加正常生理条件需求的铜后，0sCtr5基因表达逐渐 恢复到起始水平。进一步分析发现，培养液中含有过量铜，在苗和根中0sCtr5基因表达水平显著下降(图3)。这些结果提示0sCtr5基因可能参与铜吸收的调控。实施例3 :0sCtr5基因编码产物亚细胞定位分析1.遗传转化载体的构建本发明所用的农杆菌介导的遗传转化载体是pU1391(图4)。pU1391是常用的水 稻遗传转化载体(Cai等，2008)。它携带玉米泛素(ubiquitin)基因启动子(Pubi)和绿色 焚光蛋白基因(green fluorescence protein, GFP)标签。以全长0sCtr5基因克隆为模板，采用PCR技术扩增0sCtr5基因的编码区段DNA。 PCR 引物为 0sCtr55F (5’ CGGGGTACCATGGACATGGGCGGC-3’)(下划线代表 KpnI 限制性内切酶 消化位点)和 0sCtr56R(5 ‘ -GCTGGATCCCAGCACACGGGGTCG-3 ‘)(下划线代表 BamHI 限制 性内切酶消化位点)(图2)。将PCR产物与T-A克隆载体pGEM-T (美国Promega公司)连 接，将连接好的载体电转化(电转化仪为印pendorf公司产品，本实施例所用电压为1800V， 具体操作参考该仪器的使用说明书)进入大肠杆菌菌株DHlOB (Sim等，2004)，通过酶切筛 选阳性克隆，再经测序验证有无碱基突变。用限制性内切酶BamHI和KpnI消化带有0sCtr5 基因的编码区的阳性克隆和PU1391载体；酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比为24 1) 抽提，纯化酶切产物。用酶切纯化好的包含0sCtr5基因编码区的DNA片段和酶切好的载体 做连接反应。通过BamHI和KpnI酶切筛选外源片段正向插入的阳性克隆(图4)。2. 0sCtr5蛋白的亚细胞定位分析将携带0sCtr5_GFP融合基因的pU1391载体通过电转化的方法转入农杆菌菌株 EHA105(Qiu等，2007)。通过农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)在洋葱表皮细 胞中瞬时表达0sCtr5-GFP蛋白。具体方法是将洋葱切成1平方厘米的小块，撕下内层表皮 细胞层，用灭菌水洗净后平铺在MS固体培养基上28°C暗培养24小时(Lin和Zhang，2005)； 然后用携带上述遗传转化载体的农杆菌菌株侵染洋葱表皮细胞，浸泡半小时后吸干洋葱表 皮细胞表面的菌液，将其转入MS固体培养基上25°C培养一天(Lin和Zhang，2005)。用莱 -P^MMMWM Leica TCS SP2A0BS confocal microscope ( H Leica Microsystems Heidelberg GmbH公司)观察绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的分布(Qiu等，2007)。观察 结果显示0sCtr5-GFP位于洋葱表皮细胞的细胞膜上，而对照GFP分布于洋葱表皮细胞的细 胞膜、细胞质和细胞核中(图5)。由此证实0sCtr5是细胞膜蛋白质，它可能在细胞膜上发 挥功能。实施例4 超量表达0sCtr5基因验证其在水稻铜吸收转运中的功能1.超量表达遗传转化载体的构建本发明所用载体是pU1301 (图6)。pU1301是常用的水稻遗传转化载体(Cao等， 2007)。它是携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素基因启动子的农杆菌介导的遗传 转化载体。将上述包含0sCtr5基因、长870bp的DNA片段(图2)用限制性内切酶KpnI和 BamHI消化，灭活酶后作为外源DNA片段。同时，用限制性内切酶KpnI和BamHI消化携带玉 米泛素基因启动子的遗传转化载体PU1301 ；酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比为24 1) 抽提，纯化酶切产物。用包含0sCtr5基因的酶切片段和纯化好的载体做连接反应。通过测 序验证阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为D179U。2.遗传转化和Ttl代遗传转化植株分析
采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D179U导入水稻品种牡 丹江8。牡丹江8是常用的水稻遗传转化受体材料(Sun等，2004 ；Cao等；2007 ；Qiu等， 2007)。获得的遗传转化植株被命名为D179UM(其中前面部分D179U为遗传转化载体名称， M代表水稻品种牡丹江8)。本发明共获得独立转化植株16株。本发明采用RNA杂交分析方法检测遗传转化植株中0sCtr5基因的表达量。将 20 yg的总RNA在含1 %甲醛的琼脂糖凝胶中电泳，利用IOx SSC将RNA转移到Hybond-N+ 尼龙膜上，通过紫外交联进行固定，65°C进行预杂交和杂交，杂交液选用Church缓冲液 (0. 14M NaH2PO4,0. 36M Na2HPO4, 7 % SDS, ImMEDTA)，洗膜和 X-光片放射自显影(Yuan 等， 2009)。结果显示，与对照牡丹江8相比，所有阳性转化植株体内的0sCtr5基因的表达量都 大幅提高(图7)。3.超量表达植株中铜含量分析为验证遗传转化植株是否能够增强对铜吸收和累积的能力，本发明申请人对在TO 代表达量显著提高的2个遗传转化植株(D179UM11和D179UM33)的Tl代转基因阳性家系 进行铜含量分析。在孕穗期取叶片和根进行铜含量测定。测定铜含量方法按照《中华人民 共和国国家标准》GB/T 5009. 13-2003，“食品中铜的测定”方法进行。样品的准备过程如下分别称取20克左右新鲜水稻的叶和根，用去离子水清洗两 次，在80°C烘箱中烘1周，至恒重；用组织粉碎机将材料研磨成细粉。称取200mg左右干 粉，加入IOml IlN HNO3，在80°C烘箱中酸消化10h，滤纸过滤。用原子吸收光谱仪(atomic absorption spectroscopy, SPECTRAA220, PaloAlto, USA)在 324. 8nm 波长下测定铜的含
fio结果显示，超量表达0sCtr5基因的植株叶和根中铜的含量都显著提高(表 1)。与对照牡丹江8相比，转基因植株叶中铜含量增加了 67% _77%，根中铜含量增加了 39%-48%。这些结果证明超量表达0sCtr5基因可以促使水稻从外界吸收铜。在铜污染 的土壤或水体中种植超量表达0sCtr5基因的水稻可以将土壤或水体中的铜转移进水稻体 内；通过收获水稻植株彻底移除土壤或水体中的多余铜，从而达到土壤或水体铜污染修复 的效果。表1. Tl代遗传转化植株(D179UM)体内铜含量
水稻材料叶(pg/g鲜重)根Oig/g鲜重)牡丹江8 (对照)10.73 ±0.12170.17 ± 15.32D179UM1117.97 ±0.43236.88 ± 1.04D179UM3319.00 ±0.88252.54 ±9.16参考文献廖自基(1989)环境中微量重金属的污染危害与迁移转化。北京科学出版社。施积炎，陈英旭，林琦，王远鹏(2004)根分泌物与微生物对污染土壤重金属活性 的影响。中国环境科学。24:316-319。郑洁敏，楼丽萍，王世恒，唐世荣(2006) —种新发现的铜积累植物-密毛蕨。应用 生态学报17 507-511.
Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z， Miller W， Lipman DJ (1997)Gapped BLAST andPSI-BLAST :a new generation ofprotein database search programs. Nuc 1. Acids Res. 25 :3389_3402·Ayres PG(2004)Alexis Millardet :France’ s forgotten mycologist. Mycologist. 18 :23_26.Bennett LE, Burkhead JL, Hale KL, Terry N， Pilon M， Pilon-Smits EA(2003)Analysis of transgenic indianmustard plants for phytoremediation of metal-contaminated mine tailings. J. Environ. Qual. 32 :432_440·Cai M, Yuan T， Duan L, Li X, Wang S (2008) Identification of potential protein regulators bound to thetissue-specific positive and negative cis-acting elements of a green tissue-specific promoter in rice. Plant Biol. 10 :771-777.Cao Y，Ding X，Cai M，Zhao J，Lin Y，Li X，Xu C，Wang S (2007)The expression pattern of a rice disease resistance gene Xa3/Xa26is differentially regulated by the genetic backgrounds and developmental stages that influence its function. Genetics 177 :523_533.Cao ZHjHu ZYiWong MH(2000)Copper contamination in paddy soils irrigated with wastewater. Chemosphere. 41 :3_6.Garcia-Sanchez A， Alastuey A， Querol X(1999)Heavy metal adsorption by different minerals !application to the remediation of polluted soils·Sci·Total Environ. 242 :179-188.Hao XZ，Zhou DM, Wang YJ，Cang L，Chen HM(2003)Effect of different amendments on ryegrass growth in copper mine tailings. Pedosphere 13:299—308·Harris ZL，Gitlin JD (1996)Genetic and molecular basis for copper toxicity. Am. J. Clin. Nutr. 63 :836S_841S.He ZL, Yang XE, Stoffella PJ(2005)Trace elements in agroecosystems and impacts on the environment. J. Trace Elem. Med. Biol. 19 :124-140.Ho WS (2003) Removal and recovery of metals and other materials by supported liquid membranes with strip dispersion. Ann. N. Y. Acad. Sci. 984 :97-122.Ishimaru Y，Suzuki M，Tsukamoto T，Suzuki K，Nakazono M，Kobayashi T，Wada Y，Watanabe S，Matsuhashi S，Takahashi M，Nakanishi H，Mori S，Nishizawa NK(2006) Rice plants take up iron as an Fe3+-phytosiderophore and as Fe2+· Plant J. 45 335-346.Jiang LY, Yang XE, Shi WY (2004) Copper uptake and tolerance in two contrasting ecotypes of Elsholtzia argyi. Plant Nutr. 27 :2067-2083.Kampfenkel K，Kushnir S，Babiychuk E，Inze D,Vanmontagu M(1995)Molecular characterization of a putative Arabidopsis~tha1iana copper transporter and its yeast homolog. J. Biol. Chem. 270 :28479_28486.Khan M，Scullion J(2000)Effect of soil on microbial responses to metal contamination. Environ. Pollut. 110 :115_125·
9
Leep Nff(1981)Copper effect of heavy metal pollution on plants. London and New Jersy :Applied Science Publishers.Lin Y，Zhang Q(2005)Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice. Plant Cell Rep. 23 :540-547.Liu DH，Jiang WSjHou WQ(2001)Uptake and accumulation of copper by roots and shoots of maize (Zea mays L.). J. Environ. Sci. (Chiha). 13 :228-232.Lou LQ,Shen ZG,Li XD(2004)The copper tolerance mechanisms of Elsholtzia haichowensis，a plant from copper-enriched soils. Environ. Experi.Botany 51 111-120.Moffat AS(1995)Plants proving their wotrh in toxic metal cleanup. Science 269 :302_303.Nakai K，Kanshisa M (1991)Expert system for predicting protein localization sites in gram-negative bacteria. Proteins 11:95-110·Peralta-Videa JR， Rosa G， Gonzalez JH， Gardea-Torresdey JL(2004)Effects of the growth stage on the heavy metal tolerance of alfalfa plants. Adv. Environ. Res. 8 :679-685.Qiu D，Xiao J，Ding X，Xiong M，Cai M，Cao Y，Li X，Xu C，Wang S (2007) 0sWRKY13mediates rice disease resistance by regulating defense-related genes in salicylate-and jasmonate—dependent signaling. Mol. Plant Microbe Interact. 20 492-499.Raskin II， Smith RD, Salt DE(1997)Phytoremediation of metals :using plants to remove pollutants from theenvironment. Curr. Opin. Biotechnol.8 221-226.Rocha CG，Zaia DA，Alfaya RV, Alfaya AA(2009)Use of rice straw as biosorbent for removal of Cu(II)，Zn(II)，Cd(II)and Hg(II) ions in industrial effluents. J. Hazard Mater. 166 :383-388.Sancenon ViPuig S，Mira H，Thiele DJ，Penarrubia L(2003)identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaiiana· Plant Mol. Biol. 51 :577_587·Sun XiCao YiYang Z，Xu C,Li XiWang SiZhang Q(2004)Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv. Oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein. Plant J. 37 :517-527.Tang SR， Wilke BM， Huang CY(1999)The uptake of copper by plants dominantly growing on copper miningspoils along the Yangtze River, the People' s Republic of China. Plant Soil 209:225-232.Wu C, Li XiYuan W, Chen GiKilian A, Li J, Xu C, Li XiZhou D-XiWang SiZhang Q(2003)Development ofenhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J. 35 :418_427.Yuan M，Chu Z，Li X，Xu C,Wang S (2009)Pathogen-induced expressional loss of function is the key factor in race-specific bacterial resistance conferredby a recessive R gene xal3 in rice.Plant Cell Physiol. 50 :947_955.Zhou B, Peng KM, Chu ZH, Wang SP, Zhang QF (2002) The defense-responsive genesshowing enhanced and repressed expression after pathogen infection in rice (Oryza sativa L.).Sci. China Ser C 45 :449-467.序列表<110>华中农业大学<120>水稻铜转运子基因0sCtr5和它在铜污染土壤和水体修复中的应用<130><141>2009-07-14<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>870<212>DNA<213> 7jCfS (Oryza sativa)<220><221>gene<222>(1). . (870)<223><220><221>3，UTR<222>(531). . (870)<223><220><221>CDS<222>(75). . (530)<223><220><221>5，UTR<222>(1). . (74)<223><400>1aagagctaac ccatagagag caacatcgac ataaactatc atcagctagc tgcgacagcg 60agctagtaga agcc atg gac atg ggc ggc aat ggc atg gcg atg ccg ccg 110Met Asp Met Gly Gly Asn Gly Met Ala Met Pro Pro1510ccg ccg gcg ccg gtg aag aag gcg egg tac atg cac atg acc ttc ttc 158Pro Pro Ala Pro Val Lys Lys Ala Arg Tyr Met His Met Thr Phe Phe1520 250123]tggggcaagaacacggaggtgctcttcaccCtgtggCCgggcgccagg2060124]TrpGlyLysAsnThrGluValLeuPheThrLeuTrpProGlyAlaArg0125]3035400126]ggcggcatgtacgcgctcgcgatectcttcatgttcgcgCtggccgtg2540127]GlyGlyMetTyrAlaLeuAlalieLeuPheMetPheAlaLeuAlaVal0128]455055600129]ctcctcgagttcCgCggctacCgCgtgCtggaggcgCgCctcgccegg3020130]LeuLeuGluPheArgGlyTyrArgValLeuGluAlaArgLeuAlaArg0131]6570750132]CggCgCgcgCCgegggcggccgcggcgCtgCgCacggccgtccacgcc3500133]ArgArgAlaProArgAlaAlaAlaAlaLeuArgThrAlaValHisAla0134]8085900135]gtgCgCgtcggcgtcgcatacctcateatgctcgcgctcatgtcgttc3980136]ValArgValGlyValAlaTyrLeulieMetLeuAlaLeuMetSerPhe0137]951001050138]aacggcggggtgttcctcgcgategtggcggggcacgccgccggcttc4460139]AsnGlyGlyValPheLeuAlalieValAlaGlyHisAlaAlaGlyPhe0140]1101151200141]CtggcgttcCgCgccggcCtgtgcggcggcgggCCggcgCCgCCgCtg4940142]LeuAlaPheArgAlaGlyLeuCysGlyGlyGlyProAlaProProLeu0143]1251301351400144]gaggaggacCgCaagaacgacCCCgtgtgctgctag tatggcttaa5400145]GluGluAspArgLysAsnAspProValCysCys0146]1451500147]gctgtctcgc tcgtcatggt gttcacgtggccttttcgct taatttgttg atgttttgtg6000148]tgtgcgcata taggtttcag gtgattgaaatctttgaaat ttgggtcgga tgatcgagtt6600149]tgtttggttg ttttgttttt ctctcgtaaggtctacagat gtgacatgaa agttaatttc7200150]ttgatgtcat cttggcttgg aatctattactagtggtgtc tgtcaaactg taattgtata7800151]gcatatgtca ctcatttgat tgatgctgcctcccggcttt agtttcaatt gtctcagatt8400152]ggttattata gtgtacctgc aaaactgttc8700153]<210>20154]<211>1510155]<212>PRT0156]<213> 水稻(Oryza sativa)0157]<400>20158]MetAspMetGlyGlyAsnGlyMetAlaMetProProProProAlaPro0159]1510150160]ValLysLysAlaArgTyrMetHisMetThrPhePheTrp GlyLysAsn0161]202530
ThrGluValLeuPheThrLeu
35
AlaLeuAlalieLeuPheMet
5055
ArgGlyTyrArgValLeuGlu
6570
ArgAlaAlaAlaAlaLeuArg
85
ValAlaTyrLeulieMetLeu
100
PheLeuAlalieValAlaGly
115
AlaGlyLeuCysGlyGlyGly
130135
LysAsnAspProValCysCys
145150
Trp Pro Gly Ala Arg Gly Gly Met Tyr 4045
Phe Ala Leu Ala Val Leu Leu Glu Phe 60
Ala Arg Leu Ala Arg Arg Arg Ala Pro 7580
Thr Ala Val His Ala Val Arg Val Gly
9095
Ala Leu Met Ser Phe Asn Gly Gly Val
105110
His Ala Ala Gly Phe Leu Ala Phe Arg 120125
Pro Ala Pro Pro Leu Glu Glu Asp Arg 140
权利要求
增强水稻吸收和累积铜的OsCtr5基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.0sCtr5基因的编码区，它是序列表SEQ ID NO 1中第75-530位所示的DNA序列或 者是编码与SEQ ID NO :1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
3.权利要求1或2任一项所述的基因在增强水稻吸收和累积铜中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻铜转运子基因OsCtr5的DNA片段的分离克隆和功能验证。OsCtr5基因编码一种铜转运子蛋白。它能够增强水稻吸收和累积铜。将该片段与其外源调节序列直接转入水稻，超量表达OsCtr5的转基因水稻吸收和累积铜的能力显著增强。可以通过种植超量表达OsCtr5的水稻材料，降低土壤和周围水体中的铜含量，用于修复土壤和水体的铜污染。
文档编号C12N15/29GK101955944SQ20091006314
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者王石平, 袁猛 申请人:华中农业大学