专利名称：拟南芥糖基转移酶基因ugt85a5在提高植物耐盐性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个糖基转移酶基因及其应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因 UGT85A5在提高植物耐盐性中的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，它将活性糖基从供体(通常是UDP-glucose)转移到受体分子上。糖基化修饰往往会改变植物分子的生物活性、水溶性、在细胞内和整体植株的转运特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，另外还能降低或消除内源和外源物质的毒性(Lim and Bowles, 2004; Bowles et al. , 2006; Wang and Hou, 2009)。因此，糖基转移酶基因在调节植物细胞代谢平衡、维持植物正常生长发育等方面有重要意义。例如，已有报道糖基转移酶基因参与植物激素平衡调节、植物防御反应、植物次生代谢物合成以及植物信号转导等(Wang and Hou, 2009)。生物界存在的糖基转移酶按照所催化的底物性质和序列相关性分属94个不同的家族。其中家族I包含的成员数量最多，与植物的关系最密切。在家族I中大多数基因C端具有一个由44个氨基酸组成的保守序列，即PSPG盒(plant secondary product glycosy I transferase box)。随着拟南芥(Arabidopsis thaliana)全基因组测序的完成， 通过对PSPG盒的序列分析发现拟南芥中共有119个可能的糖基转移酶，这些糖基转移酶中大部分的功能还不清楚。见7 况5是拟南芥糖基转移酶家族I中的一个成员，目前它的基因序列已公开于核酸序列数据库中。但是经过检索，拟南芥糖基转移酶基因UGT85A5在增强植物耐盐性中的应用目前未见报道。
发明内容
(I)本发明的目的
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种拟南芥糖基转移酶基因见/ 5^5在提高植物耐盐性中的应用。(2)实现本发明的具体技术方案
本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT85A5在提高植物耐盐性中的应用。其中所述糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。所述植物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。本发明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆糖基转移酶基因UGT85A5,然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐盐性得到显著提高。(3)本发明实施后带来的有益效果
实验证实，应用本发明所述拟南芥糖基转移酶基因见/ 5^5进行植物转基因操作，可以显著提高转基因植物的耐盐性(见附图I、附图2和附图3)。预示本发明实施后将会创造新型耐盐植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。
图I :野生型对照烟草和见过表达转基因烟草浇盐水前和浇盐水后的生长状态。其中CK为野生型对照烟草，OE-I和0E-3为过表达转基因烟草。浇盐水前，野生型烟草与转基因烟草表现出一致的生长状态。浇盐水后，见7 况5两个转基因烟草株系的生长状态都比野生型烟草好，说明转基因烟草对盐胁迫有较好的耐受性。图2 :野生型对照烟草和见过表达转基因烟草在含有梯度浓度NaCl的MS培养基上生长状态。其中CK为野生型对照烟草，OE-I和0E-3为过表达转基因烟草。在正常条件下，野生型烟草与转基因烟草表现出一致的生长状态。而在含有NaCl的培养基上，两个转基因烟草株系的生长状态都比野生型烟草好，说明转基因烟草幼苗比野生型烟草幼苗对盐胁迫有更强的耐受性。图3 :野生型对照烟草和UGT85A5过表达转基因烟草的叶片在NaCl溶处理后叶绿素降解状态。其中CK为野生型对照烟草，OE-I和0E-3为过表达转基因烟草。在不进行盐胁迫处理的情况下，野生型烟草与转基因烟草的叶盘表现出一致的状态。而在盐胁迫处理的情况下，野生型烟草的叶盘变成黄褐色，两个转基因烟草株系的叶盘仍保持比较绿，其状态明显好于野生型烟草，说明转基因烟草比野生型烟草对盐胁迫有更强的耐受性。
具体实施例方式实施例I 拟南芥糖基转移酶基因见7 况5的分子克隆
I.拟南芥糖基转移酶基因UGT85A5的克隆
通过公开网站http://www. cazy. org获得基因的cDNA序列。根据cDNA序列设计引物，其中正向引物为85A5-F: 5’ -GCGTCTAGAATGGCGTCTCATGCTGTTAC-3’ ;反向引物为 85A5-R: 5’ -GCGGAGCTCCTACTCCCCTAAAAGAACCT-3’。利用 TRIzol 试剂盒提取拟南芥 RNA, RT-PCR方法扩增见7 况5·基因的全长cDNA序列。RT-PCR扩增程序如下94°C 2min ； 94°C 40s, 55°C 40s, 72°C lmin，共 36 个循环；最后 72°C延伸 7min。将获得的基因
cDNA经过酶切、连接等操作克隆到pBluescript II SK(+)载体(一种通用载体)上,称为 PK85A5中间载体，然后进行中间载体的基因全长PCR验证和双酶切验证，最后进行序列测定。基因测序结果与已公开的基因序列一致。2.拟南芥糖基转移酶基因见的序列信息与特性分析
UGT85A5基因的编码区cDNA为1440 bp，编码479个氨基酸的54 kDa蛋白，C端具有 44个氨基酸的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。3.拟南芥糖基转移酶基因受盐诱导表达分析
取四叶期野生型拟南芥小苗6份，I份作为对照组，5份用于盐处理，盐浓度为150mM NaCl。设定处理1、3、6、12、24小时5个时间点取样。利用TRIzoI试剂盒提取每个样品植株总RNA，利用上述引物进行RT-PCR扩增获得cDNA，分析见7 况5基因的表达情况。结果显示，拟南芥受到盐胁迫后，见基因会被诱导上调表达，在盐处理3小时后基因表达开始上调，到6小时达到最高点，并且至24小时一直维持在较高水平。
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实施例2 拟南芥糖基转移酶基因UGT85A5的转基因应用
I.含有UGT85A5编码区cDNA表达载体的构建
用Xba I和Sac I双酶切pK85A5中间载体获得UGT85A5全长序列，再与经过油a I 和fee I双酶切的pBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S启动子驱动糖基转移酶基因 UGT85Ab的植物过表达载体，此载体命名为pB85A5。最后经基因PCR验证和双酶切验证，鉴定该植物表达载体的构建是正确的。2. 农杆菌介导植物遗传转化
先将植物表达载体PB85A5转入农杆菌LBA4404，经PCR验证和双酶切验证确定载体已转入农杆菌。然后利用农杆菌浸染的叶盘法(一种通用方法)将植物表达载体PB85A5转入野生型烟草细胞体内，使基因见在烟草中过量表达。在生芽培养基(MS培养基+0. 2mg/L IAA+2mg/L 6-BA +30g/L鹿糖+7g/L琼脂)中加入浓度为100mg/L的卡那霉素用于筛选转化植株。把生成的绿色小芽移入到带有相同抗生素的生根培养基(MS培养基+10mg/L VB1 +0. 2mg/L NAA +30g/L蔗糖+7g/L琼脂)中培养。在生根培养基上培养2_3周后，植株大小合适，进行分子鉴定，鉴定后再移入营养土中进行生理指标等分析。3.转基因植株分子鉴定
对转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型植株的RNA， RT-PCR方法分析过表达转基因植株和野生型植株的基因表达差异，结果显示，UGT85A51 过表达转基因植株中的表达量都明显高于野生型植株。4.UGT85A5基因的功能验证
(I)利用获得的两个见/ 况5高表达转基因烟草株系UGT85A50E-l、UGT85A50E-3，进行一系列耐盐性的实验分析。①烟草浇盐水实验将6周大小、长势一致的野生型烟草与转基因烟草植株移至同一个盆中，待其生长正常后，向盆中均匀浇300mM NaCl溶液IOOml，每隔2天浇一次，处理 I个月。结果表明两个转基因烟草株系的生长状态都明显好于野生型烟草，说明转基因烟草对盐胁迫有较好的耐受性(附图I)。②烟草幼苗水平培养实验将3周大小、长势一致的野生型烟草与转基因烟草幼苗移至相同大小，含有等量培养基的三角瓶中，培养基为分别含有O mM NaClUOO mM NaCl, 200 mM NaCl、300 mM NaCl的MS培养基。水平培养I个月后，将幼苗取出，称其鲜重，结果显示，在正常条件下，野生型烟草与转基因烟草的鲜重基本一致。而在含有NaCl的培养基上生长后，两个转基因烟草株系的鲜重都显著高于野生型烟草(附图2)。③叶盘失绿实验取8周大小、长势一致的野生型烟草与转基因烟草植株的相同部位的叶片，打成圆形小叶盘，称重后放置于含有不同浓度NaCl的溶液中，置于光照16h/ 黑暗8h条件下处理72h。梯度浓度NaCl溶液为0 mM NaClUOO mM NaCl,200 mM NaCl, 300 mM NaCl、400 mM NaCl。用分光光度法测定叶绿素含量，结果显示，在未进行盐胁迫处理下，野生型烟草叶盘与转基因烟草叶盘的叶绿素含量基本一致。而在盐胁迫处理后，两个转基因烟草株系叶盘的叶绿素含量都显著高于野生型烟草，说明了见7 况5基因在提高植物耐盐性中的作用(附图3)。
(2)分析一系列耐盐性相关的生理指标，进一步确定见7 况5基因在增强植物耐盐性中的作用。①脯氨酸含量测定将6周大小、长势一致的野生型烟草与转基因烟草植株移至同一个盆中，待其生长正常后，用300mM NaCl溶液处理I周，取叶片用分光光度法测定脯氨酸含量，结果显示，在正常生长状态下，野生型烟草和转基因烟草叶片中的脯氨酸含量基本一致，而在盐胁迫处理一周后，转基因烟草比野生型烟草积累更多的脯氨酸，野生型烟草的脯氨酸含量上升了约13倍，两个转基因烟草株系的脯氨酸含量都上升了约16倍，差异达到显著性。转基因烟草在盐胁迫下可积累更多的脯氨酸，表明其具有比野生型烟草更耐盐的特性，UGT85A5参与到植物耐受盐胁迫的反应中。②可溶性总糖类含量测定将6周大小、长势一致的野生型烟草与转基因烟草植株移至同一个盆中，待其生长正常后，用300mM NaCl溶液处理I周，取叶片用分光光度法测定可溶性总糖类含量。结果显示，在正常生长状态下，野生型烟草和转基因烟草叶片中的可溶性总糖含量基本一致。而在盐胁迫处理一周后，转基因烟草比野生型烟草积累更多的可溶性总糖，野生型烟草的可溶性总糖含量上升了约28%，转基因烟草的可溶性总糖含量分别上升了约40%和38%，差异达到显著性。转基因烟草在盐胁迫下可积累更多的可溶性总糖， 表明其具有比野生型烟草更耐盐的特性。③丙二醛含量测定将6周大小、长势一致的野生型烟草与转基因烟草植株移至同一个盆中，待其生长正常后，用300mM NaCl溶液处理I周，取叶片用分光光度法测定丙二醛含量。结果显示，在正常生长状态下，野生型烟草和转基因烟草叶片中的丙二醛含量基本一致。而在盐胁迫处理一周后，转基因烟草比野生型烟草积累更少的丙二醛，野生型烟草的丙二醛含量上升了约123%，转基因烟草的丙二醛含量分别上升了约73%和76%，与野生型相比差异达到显著性。转基因烟草在盐胁迫下积累更少的丙二醛，表明其受的损害比野生型烟草小，具有比野生型烟草更耐盐的特性。④Na+、K+含量测定将6周大小、长势一致的野生型烟草与转基因烟草植株移至同一个盆中，待其生长正常后，用200mM NaCl溶液处理2周，取叶片用原子吸收光谱法测定 Na+含量、K+含量。结果显示，在正常生长状态下，野生型烟草的Na+含量与转基因烟草基本一致，而K+含量高于转基因烟草的K+含量，这就造成了在正常生长状态下野生型烟草叶片中的Na+/K+低于转基因烟草中的Na+/K+ ;在受到200mM NaCl处理两周之后，野生型烟草和转基因烟草中Na+含量都上升而K+含量都下降，但是野生型烟草叶片中Na+/K+比率升高了约18倍，而转基因烟草叶片中的Na+/K+比率分别升高了约12倍和10倍，与野生型相比差异达到显著性。这就说明野生型烟草和转基因烟草在受到盐胁迫的情况下叶片内积累大量的Na+，同时引起K+的流失，但野生型烟草会积累比转基因烟草更多的Na+，从而使得野生型烟草比转基因烟草更易受到盐胁迫的危害，表明见基因与植物耐受盐胁迫反应有关，该基因的闻水平表达能够提闻植物的耐盐性。
权利要求
1.拟南芥糖基转移酶基因UGT85A5在提高植物耐盐性中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述糖基转移酶基因UGT85A5的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述植物是十字花科植物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述十字花科植物是拟南芥、芥菜、油菜、 白菜或甘蓝。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT85A5在提高植物耐盐性中的应用，其中所述糖基转移酶基因UGT85A5的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其是通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆的。本发明利用基因UGT85A5构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐盐性得到显著提高，预示本发明实施后将会创造新型耐盐植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。
文档编号C12N15/54GK102586293SQ20121008220
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者侯丙凯, 孙延国 申请人:山东大学